葉下珠水提物的體外抗炎作用研究*

陳偉鴻，韋浩純，吳琪琪，段小群，周越菡

桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 廣西桂林 541100

炎癥是一種常見(jiàn)而又十分重要的基本病理過(guò)程，與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、惡性腫瘤等多種致命性疾病有密切相關(guān)[1]，臨床上常用的抗炎藥如糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥，但上述藥物在治療過(guò)程中常伴隨機(jī)體代謝功能紊亂、胃腸反應(yīng)等副作用[2]，因此，發(fā)掘高效低毒的抗炎活性藥物，是炎癥治療的重要領(lǐng)域。中醫(yī)理論認(rèn)為炎癥的核心病機(jī)為邪氣內(nèi)聚，癥瘕集聚，中醫(yī)藥有著數(shù)千年的歷史且對(duì)于治療炎癥屢建奇功[3]，2016年國(guó)務(wù)院頒布了《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要（2016-2030年）》，明確中藥研究是中藥開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。因此，從我國(guó)傳統(tǒng)中草藥中發(fā)掘具有抗炎作用的中草藥，將具有重要的科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由Andrew L Hopkins首先提出的，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析方法研究藥物作用靶點(diǎn)的一系列方法，為現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究提供了新的思路[5]。

葉下珠（Phyllanthus urinariaL.），又名珍珠草，主要分布于我國(guó)的廣西、廣東等地，是大戟科葉下珠屬的全草，最早收載于《生草藥性備要》中，具有平肝清熱、利水解毒等功效[6]。近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于葉下珠的藥理相關(guān)研究主要集中于保肝、抗腫瘤、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓等方面[7]，對(duì)其抗炎效應(yīng)鮮有研究。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，初步探索葉下珠抗炎的相關(guān)機(jī)制，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究AEP對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌的調(diào)節(jié)作用和具體作用機(jī)制，為葉下珠的開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

1.1 藥品與試劑 葉下珠水提物由桂林醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)教研室提供，馬瑞婧博士鑒定。高糖培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自于Gibco，上海立菲生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Calf Serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自于LONSERA，上海雙洳生物科技有限公司；雙抗（鏈霉素+青霉素）購(gòu)自于Hyclone；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自于SIGMA；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自于BIOFROXX；脂 多 糖（Lipopolysaccharide，LPS）購(gòu) 自 于SIGMA；ELISA （NO）試劑盒購(gòu)自于Elabscience，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶抑制劑混合液（Proease Inhibitor Cocktail（EDTA-free））、RIPI組織細(xì)胞裂解液、BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）購(gòu)自于Beyotime，碧云天生物科技有限公司；30%丙烯酰胺溶 液、1.5mol/L Tris（Ph8.8）、1.0mol/L Tris（pH6.8）、10%SDS、過(guò)硫酸、TEMED購(gòu)自于Solarbio，北京索萊寶科技有限公司；一抗NF-kappaB p65 Rabbit mAb購(gòu)自于Cell Signaling Technology；一抗GAPDH Rabbit mAb、二抗HRP標(biāo)記山羊抗小鼠lgG（H+L）、二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔lgG（H+L）購(gòu)自于 Beyotime，碧云天生物科技有限公司；發(fā)光液購(gòu)自于凱基生物。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀購(gòu)自于美國(guó)伯騰儀器有限公司（BioTek），型號(hào)：ELx800；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自于Bio TeK Instruments；DSY5000X倒置顯微鏡購(gòu)自于重慶重光實(shí)業(yè)有限公司；二氧化碳孵育箱購(gòu)自于SANYO，Japan；低溫離心機(jī)購(gòu)自于EPPENDORF，型號(hào)：5424R；Tanon-5200購(gòu)自于上海天能科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%的雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 獲得葉下珠抗炎的作用靶點(diǎn) 在HERB數(shù)據(jù)庫(kù)的Herb板塊以“葉下珠”為關(guān)鍵詞獲得葉下珠相關(guān)的作用靶點(diǎn)，將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“inflammation”為關(guān)鍵詞獲得炎癥的相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)韋恩軟件對(duì)葉下珠的作用靶點(diǎn)與炎癥的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行取交集并繪制韋恩圖。

2.1.2 初步的PPI可視化與關(guān)鍵核心靶點(diǎn)篩選 將上述獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得初步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），在最低互作分?jǐn)?shù)（minimum required interaction score）選擇medium confidence（0.400），并選擇隱藏未連接的節(jié)點(diǎn)，選擇保存為T(mén)SV文件，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理，運(yùn)用MCODE插件尋找最有意義的模塊，通過(guò)CytoHubba插件篩選得到10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

2.1.3 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析 將上述10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Hiplot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，并繪制GO富集分析的氣泡圖和KEGG的柱狀圖。將KEGG富集結(jié)果的部分信號(hào)通路和重要核心靶點(diǎn)基因信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行KEGG通路富集分析結(jié)果的可視化。見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)信息

2.2 體外研究

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，即含10%胎牛血清及1%的雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 AEP的制備的制備 葉下珠干燥全草后，使用粉碎機(jī)對(duì)葉下珠進(jìn)行粉碎，過(guò)篩，稱(chēng)取過(guò)篩后的粉末，每150g粉末加入2L蒸餾水后煮沸2h，得到水煎液，待自然冷卻后過(guò)濾得到濾液。而濾渣則繼續(xù)加入1.15L蒸餾水后煮沸2h，上述步驟重復(fù)2次，合并3次操作得到的濾液，濃縮后，得到浸膏33g，然后用DMSO配制成1g/mL的儲(chǔ)存液，無(wú)菌處理后分裝保存于-20℃，臨用前用稀釋到實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMSO稀釋到相應(yīng)濃度備用。

2.2.3 MTT法檢測(cè)AEP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%以上且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞分別培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板，分為24h、48h、72h三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組再設(shè)有空白對(duì)照組（即藥物濃度為0）、溶劑組v和同種藥物的不同濃度梯度給藥組，給藥組再分為5組，具體濃度分為0.0625，0.125，0.25，0.5，1（單位：mg/ml），使用DMSO溶解藥物。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁刮下，加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為10個(gè)/μL，每孔為100 μL的量，接種于24 h、48 h、72 h三個(gè)分組的96孔板中，24h過(guò)后，觀察到細(xì)胞貼壁，棄置舊培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，給藥組加入含不同藥物濃度的AEP的完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，溶劑組加入含DMSO的培養(yǎng)基，且溶劑組中所加的DMSO與溶解最高藥物濃度的含量一致。進(jìn)行上述步驟后將96孔板置于37℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出24h組的96孔板，加入濃度為5mg/ml的MTT溶劑10μL，放置培養(yǎng)箱孵育3-4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，置于搖床上搖15min使結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力變化。其余48 h、72h組給藥后分別培養(yǎng)48 h、72h，進(jìn)行上述相同操作。

2.2.4 AEP作用細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞炎性因子檢測(cè) 根據(jù)MTT法結(jié)果分析，取藥物濃度為0.0625、0.125 mg/ml的藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞炎性因子檢測(cè)。通過(guò)細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁刮下，加入完全培養(yǎng)基，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105個(gè)/mL，每孔1mL，接種于24孔板，標(biāo)記空白對(duì)照組0、LPS組、LPS +AEP組，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；同時(shí)配制不同濃度的AEP（質(zhì)量濃度 為0.0625mg/ml、0.125mg/ml）和1μg/ml LPS藥液備用，待24孔板細(xì)胞密度至75%-85%后對(duì)藥物組進(jìn)行給純藥于CO2培養(yǎng)箱保護(hù)2h，其他孔不換液；2h后取24孔板進(jìn)行處理，0組更換完全培養(yǎng)基，LPS組給予LPS處理，藥物組給予LPS+純藥處理，上述操作后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h后通過(guò)ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)上清NO分泌情況，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2.2.5 免疫印跡法對(duì)細(xì)胞經(jīng)藥物處理后檢測(cè)NF-κB p65蛋白表達(dá) 將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于中皿中，每個(gè)皿中細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×105個(gè)/mL，共4ml。設(shè)置空白對(duì)照組0、LPS組、LPS +AEP各濃度組，標(biāo)記好后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至75%～85%后，LPS +AEP各濃度組中細(xì)胞給予配置好的AEP藥液進(jìn)行對(duì)應(yīng)給藥處理2h，對(duì)其他組別不處理；2h后取24孔板處理，0組換完全培養(yǎng)基，LPS組給LPS處理，藥物組給LPS+純藥處理，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出加裂解液（RIPI：蛋白酶抑制劑=100：1），離心，吸取上層清液，進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)，按比例加上樣緩沖液，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果計(jì)算所需的上樣量。制備12%膠，按蛋白定量后的數(shù)據(jù)進(jìn)行上樣，進(jìn)行電泳（濃縮膠：80 v，30 min ；分離膠：120 v，60 min），轉(zhuǎn)膜（200 mA，80 min），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后置于牛奶液中封閉（37℃，120min），封閉結(jié)束后放置于TBST中洗3次，10 min/次，4℃孵一抗過(guò)夜。次日，用TBST漂洗3次，10 min/次，孵二抗120 min后，用TBST漂洗3次，10min/次，顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

細(xì)胞活力、炎性因子的相關(guān)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件分析，Western blot實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用Image J 軟件分析。通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間的差異采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t方法檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 葉下珠抗炎的作用靶點(diǎn)

在HERB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得葉下珠的作用靶點(diǎn)共64個(gè)，如圖1所示，其中P值越小，在圖中的顏色越深，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得炎癥的相關(guān)靶點(diǎn)共10498個(gè)，制作上述兩者的韋恩圖如圖2所示，共得到49個(gè)交集靶點(diǎn)。

圖1 葉下珠作用靶點(diǎn)

圖2 葉下珠作用靶點(diǎn)與炎癥相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖與交集信息

2 PPI分析與關(guān)鍵核心靶點(diǎn)篩選

將49個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步的PPI分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理，如圖3所示，其中包括41個(gè)節(jié)點(diǎn)，313條邊，運(yùn)用MCODE尋找最有意義的模塊，利用Cyto-Hubba插件篩選得到10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素6（IL6）、腫瘤壞死因子 （TNF）、白細(xì)胞介素-1β（IL1B）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、半胱天冬酶3（CASP3）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、細(xì)胞間粘附分子1（ICAM1）。

圖3 交集靶點(diǎn)的PPI及關(guān)鍵核心靶點(diǎn)的篩選

3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將上述獲得的10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Hiplot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行整理并繪制氣泡圖與柱狀圖，如圖4所示，通過(guò)GO功能富集分析結(jié)果得出，在生物過(guò)程（biological processes，BP）上主要參與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、脂多糖應(yīng)答、細(xì)菌原分子應(yīng)答、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的應(yīng)答等；在分子功能（molecular function，MF）上主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體結(jié)合、信號(hào)受體激活因子的活性等；在細(xì)胞組分（cellular component，CC）上主要參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、膜微區(qū)、膜區(qū)域等。

圖4 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，按P ＜0.05，共可富集到130條通路，包括NF-κB信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等等，如圖5。以上分析結(jié)果說(shuō)明葉下珠可以參與細(xì)胞生物過(guò)程，調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路與途徑來(lái)治療炎癥。

圖5 關(guān)鍵核心靶點(diǎn)與KEGG通路富集結(jié)果網(wǎng)絡(luò)（前18位）

4 AEP各濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如圖6所示，可以觀察到0.0625mg/ml、0.125mg/mlAEP作用72h后，與空白對(duì)照組相比，在正常條件下對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力無(wú)明顯抑制作用，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度根據(jù)MTT結(jié)果選擇AEP質(zhì)量濃度為0.0625mg/ml、0.125mg/ml。

圖6 AEP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

5 AEP對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組經(jīng)過(guò)處理后，RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量顯著升高；然而與LPS組相比，AEP各組（0.0625mg/ml、0.125mg/ml）均能抑制NO釋放量，由此可以得出結(jié)論，給藥組能顯著減少LPS誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量。

圖7 AEP對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌的影響

6 Western blot檢測(cè)經(jīng)藥物處理后胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)

如圖8所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞胞漿內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），然而與LPS組相比，AEP給藥組能顯著增加NF-κB p65在細(xì)胞胞漿中表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），由此可以得出結(jié)論，給藥組能顯著抑制胞漿中NF-κB激活進(jìn)入細(xì)胞核中。

圖8 AEP對(duì)胞漿NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

討 論

炎癥是一種伴隨多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理現(xiàn)象，與惡性腫瘤[8]、代謝性疾病[9]、心血管疾病[10]、自身免疫性疾病[11]等疾病密切相關(guān)。炎癥反應(yīng)主要是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)，有研究表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到外界刺激時(shí)（如LPS）會(huì)釋放一氧化氮（NO）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和導(dǎo)致組織損傷[12]。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要組成成分之一，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的過(guò)程包括識(shí)別LPS與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。經(jīng)過(guò)LPS刺激后，巨噬細(xì)胞會(huì)引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，此時(shí)核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NFκB）信號(hào)通路是后續(xù)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控信號(hào)通路，因此NF-κB信號(hào)通路在LPS引起巨噬細(xì)胞反應(yīng)與炎癥細(xì)胞因子分泌等方面具有重要作用[13]。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，得到葉下珠抗炎的10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，AKT1在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中COX-2的表達(dá)起關(guān)鍵作用，并作為保持LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中氧化還原平衡的介質(zhì)，是藥物緩解炎癥的潛在特異性靶點(diǎn)[14]；IL-6、TNF、IL1B屬于促炎細(xì)胞因子，在機(jī)體防御病原體和急性應(yīng)激等方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，促炎細(xì)胞因子可影響著各種人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制，臨床前和臨床研究確定了IL-6、TNF、IL1B在炎癥、癌癥中的關(guān)鍵作用[15]；IL-10是一種關(guān)鍵的抗炎介質(zhì)，可保護(hù)宿主免受對(duì)病原體和微生物群的過(guò)度反應(yīng)，同時(shí)在無(wú)菌傷口愈合、癌癥和體內(nèi)平衡等其他環(huán)境中發(fā)揮重要作用[16]；JUN是轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，有研究表明可通過(guò)影響JUN靶向控制IL-1β合成和巨噬細(xì)胞活化來(lái)調(diào)節(jié)炎癥[17]；CASP3是半胱氨酸-天冬氨酰蛋白酶家族的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有著重要意義，它可作為一種凋亡調(diào)節(jié)因子，影響細(xì)胞中的蛋白質(zhì)底物并誘導(dǎo)細(xì)胞的調(diào)亡[18]；PPARG屬于核受體超家族，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、發(fā)育和代謝，此外還涉及脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，控制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的成熟和炎癥反應(yīng)應(yīng)答[19]；MAPK1從細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，作用于多條信號(hào)通路如NF-κB 信號(hào)通路，影響著細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等等[20]；ICAM-1是一種細(xì)胞表面糖蛋白和粘附受體，調(diào)節(jié)白細(xì)胞從循環(huán)到炎癥部位聚集，在上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞上被誘導(dǎo)以響應(yīng)炎癥刺激，ICAM-1在驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)中的作用是公認(rèn)的，是炎癥、損傷消退和腫瘤發(fā)生中細(xì)胞反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器[21]。

通過(guò)GO、KEGG富集分析對(duì)10個(gè)關(guān)鍵核心靶點(diǎn)所參與的生物學(xué)過(guò)程與相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果說(shuō)明葉下珠可參與細(xì)胞生物過(guò)程與影響相關(guān)信號(hào)通路達(dá)到抗炎的作用。其中KEGG分析共得到130條信號(hào)通路，包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，上述信號(hào)通路可能是葉下珠抗炎的重要關(guān)鍵通路，且NF-κB信號(hào)通路是LPS引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，因此我們側(cè)重對(duì)NF-κB信號(hào)通路展開(kāi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步確證。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用不同質(zhì)量濃度的AEP刺激RAW264.7細(xì)胞，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)AEP的濃度小于0.125mg/ml時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力無(wú)顯著影響且無(wú)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

NO是一種不穩(wěn)定的自由基，可由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生。在炎癥刺激等情況下，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）可產(chǎn)生并誘導(dǎo)催化NO持續(xù)生成，造成的后果是過(guò)量的NO會(huì)促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[22]。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)LPS和用不同質(zhì)量濃度的AEP（0.0625mg/ml、0.125mg/ml）干預(yù)24h后發(fā)現(xiàn)，AEP各質(zhì)量濃度組均能有效抑制LPS組NO的釋放。

NF-κB是早期核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控炎癥反應(yīng)各階段的許多分子。在沒(méi)有外界刺激時(shí)，IκB在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合NF-κB形成復(fù)合體，掩蓋NF-κB的核定位信號(hào)，在受到外界刺激時(shí)，通過(guò)IκB激酶（IKK）復(fù)合物被激活，磷酸化IκB，使NF-κB與IκB從結(jié)合狀態(tài)解離，釋放NF-κB二聚體，進(jìn)入胞核與DNA中的特異性位點(diǎn)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[23]。Western blot實(shí)驗(yàn)證明，RAW264.7細(xì)胞受到LPS刺激后，NF-κB p65蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明NF-κB從胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)；而經(jīng)不同質(zhì)量濃度的AEP組（0.0625、0.125mg/mL）作用細(xì)胞后，均能增加胞漿內(nèi)NF-κB p65蛋白的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），可以抑制NF-κB的激活阻止轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，證明AEP可以通過(guò)作用于NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)炎癥相關(guān)性疾病的治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探索葉下珠抗炎的具體作用靶點(diǎn)與機(jī)制，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AEP可通過(guò)作用于NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，為葉下珠治療炎癥相關(guān)性疾病的開(kāi)發(fā)與利用提供了初步的理論依據(jù)。