濕熱痹阻型痛風性關節(jié)炎中藥治療數(shù)據(jù)挖掘及作用機制研究

張帆 周奕璇 周勝利

1.合肥市第二人民醫(yī)院 合肥 230011 2.北京中醫(yī)藥大學

痛風性關節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是由于嘌呤代謝紊亂，體內(nèi)尿酸生成過多或排泄減少，導致尿酸鹽結晶沉積于關節(jié)引起的炎性反應，先天免疫反應是其引起組織異物炎性反應的主要驅(qū)動力[1]。中醫(yī)藥治療GA優(yōu)勢明顯，其療效顯著、不良反應小，且復發(fā)率低，現(xiàn)已廣泛應用于臨床。21世紀以來，數(shù)據(jù)挖掘技術在名老中醫(yī)經(jīng)驗傳承研究中發(fā)揮了重要作用，為探索中醫(yī)診療規(guī)律與臨床經(jīng)驗提供了科學方法[2]。網(wǎng)絡藥理學是一項可系統(tǒng)研究中藥復雜成分生物學效應的技術，為中醫(yī)藥研究提供了新的視角，在多成分、多靶點、多途徑的藥物研究中得到廣泛應用。數(shù)據(jù)挖掘技術與網(wǎng)絡藥理學的結合運用，是中醫(yī)藥研究工作的有力工具。本研究收集整理了中國知網(wǎng) （China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、 萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺（WanFang Database）、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫（VIP Chinese Scientific Journal Database）、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫（China Biology Medicine disc，CBMdisc）中近30年中醫(yī)藥治療濕熱痹阻型GA的中文文獻，對其用藥規(guī)律和潛在作用機制進行了分析，以期為今后GA的臨床辨治和實驗研究提供參考。

1 資料和方法

1.1 資料來源 收集CNKI、WanFang Database、VIP、CBMdisc等數(shù)據(jù)庫1989年1月至2021年12月發(fā)表的，名老中醫(yī)治療濕熱痹阻型GA的臨床文獻，并以“痛風性關節(jié)炎、痛風、濁瘀痹、濕熱痹阻型、中醫(yī)、中藥、醫(yī)家、經(jīng)驗”等詞進行精確擴展檢索，共得到相關文獻1 995篇，參照納入排除標準進行篩選，最終納入241篇，搜集醫(yī)家醫(yī)案處方483首。

1.2 文獻納入標準 （1）所選文獻均為名老中醫(yī)治療濕熱痹阻型GA的臨床病案；（2）治療處方以中藥湯劑為主，且有明確的組成、劑量；（3）文獻記載患者服藥后主要癥狀較前改善。

1.3 文獻排除標準 （1）研究進展類綜述文獻、科普宣傳類文章、動物實驗研究文獻等；（2）采用中西醫(yī)結合治療的文獻；（3）研究對象心肺腎等系統(tǒng)功能不全，或患有其他重大疾病的文獻。

1.4 數(shù)據(jù)錄入及預處理 所有數(shù)據(jù)采用雙人錄入Excel 2010表格，并進行篩選、規(guī)范化命名、核查等，建立數(shù)據(jù)庫。以2015年版《中華人民共和國藥典》[3]為標準，同時參考《中藥學》[4]，規(guī)范中藥名稱，統(tǒng)一別名，合并同類藥物，如忍冬、鴛鴦藤、二花統(tǒng)一為金銀花，山芋肉、萸肉統(tǒng)一為山茱萸，刺豬苓、過山龍統(tǒng)一為土茯苓，茅術、毛術、京茅術統(tǒng)一為蒼術。

1.5 數(shù)據(jù)分析 （1）描述性分析：利用Microsoft Excel 2021軟件對錄入的二分類中藥（無=0，有=1），進行藥類、頻次、頻率以及四氣五味歸經(jīng)等性味分析，總結高頻中藥特點。（2）關聯(lián)規(guī)則分析：采用SPSS Modeler 18.3軟件中的Apriori算法，對使用頻次≥20的中藥進行高頻藥物組合、二項關聯(lián)、三項關聯(lián)分析；采用SPSS Modeler 18.3軟件中Web復雜網(wǎng)絡插件，對高頻中藥繪制整體網(wǎng)絡與核心處方的Web網(wǎng)絡圖。（3）聚類分析：采用SPSS Statistics 26.0軟件中Ward方法對中藥進行系統(tǒng)聚類分析，歸納總結名老中醫(yī)特色經(jīng)驗用藥。（4）作用機制分析：通過中藥分子機制生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）[5]，對濕熱痹阻型GA核心處方中的藥物進行疾病及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 濕熱痹阻型GA常用中藥及類別頻次分析 483首處方涉及中藥311味，歸19大類，清熱藥、利水滲濕藥使用最為頻繁。見表1。311味中藥用藥頻次共7 707次，用藥頻次＞200有7味，依次為土茯苓、薏苡仁、牛膝、蒼術、黃柏、萆薢、甘草；頻次＞50共計36味。 見表2、3。

表1 濕熱痹阻型GA常用中藥及類別（前12類）

表2 濕熱痹阻型GA高頻中藥頻次分布（頻次＞50）

表3 濕熱痹阻型GA常用中藥總體頻次分布

2.2 濕熱痹阻型GA常用中藥性味歸經(jīng)頻次分析 四氣以寒為主，其次是溫、平；五味以甘、苦為主，其次為辛；歸經(jīng)則以脾（胃）經(jīng)為最，達5 528次，其次為肝（膽）、腎（膀胱）、肺（大腸）經(jīng)。 見表4。

表4 濕熱痹阻型GA常用中藥性味歸經(jīng)頻次分析

2.3 基于關聯(lián)規(guī)則的用藥規(guī)律分析 使用SPSS Modeler 18.3軟件為挖掘工具，當支持度≥25.00%、置信度≥20.00%時得到常用中藥組合18組。見表5。當支持度≥10.00%、置信度≥70.00%時，共挖掘得到二項關聯(lián)中藥組合20組；當支持度≥10.00%、置信度≥80.00%時，共挖掘得到三項關聯(lián)中藥組合26項。見表6、7。通過SPSS Modeler 18.3軟件Web復雜網(wǎng)絡插件，生成處方用藥整體網(wǎng)絡圖和核心處方用藥網(wǎng)絡圖。見圖1、2。由圖可知，四妙丸加土茯苓、萆薢為核心用藥，體現(xiàn)了清熱解毒利濕、健脾泄?jié)岢缘闹畏ㄌ攸c。

表5 濕熱痹阻型GA常用中藥組合

表6 濕熱痹阻型GA處方中藥二項關聯(lián)分析

表7 濕熱痹阻型GA處方中藥三項關聯(lián)分析

圖1 處方用藥整體網(wǎng)絡圖

圖2 核心處方用藥網(wǎng)絡圖

2.4 基于系統(tǒng)聚類的用藥規(guī)律分析 通過Ward方法對頻次≥20次中藥進行系統(tǒng)樹狀聚類分析，統(tǒng)計方法采用組間聯(lián)接法，區(qū)間采用Pearson相關性，度量區(qū)間采用平方Euclidean距離，共得到12組中藥聚類組合。見表8。

表8 濕熱痹阻型GA處方中藥聚類分析

2.5 基于BATMAN-TCM分析核心處方的潛在作用機制

2.5.1 核心處方配伍疾病富集分析 通過平臺將“Score cutoff” 設置為80，“Adjust P-value” 設置為0.05，結果顯示核心處方黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁、土茯苓、萆薢配伍富集的疾病共有145種。其中，潛在靶標數(shù)目≥3個的有16種。見表9。與痛風相關的疾病有非特指的疼痛（pain，unspecified）等。

表9 核心處方配伍疾病富集分析

2.5.2 核心處方配伍的潛在作用信號通路分析 在潛在靶標的生物信息學分析結果中，6藥配伍富集的生物學通路有48條，其中潛在參與的靶標數(shù)≥3個的通路見表10。其中與痛風相關通路為神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、嘌呤代謝通路（purine metabolism）。

表10 KEGG通路分析

3 討論

本研究通過檢索權威數(shù)據(jù)庫收錄的中醫(yī)藥治療濕熱痹阻型GA的臨床文獻，共搜集醫(yī)案處方483首。分析發(fā)現(xiàn)，治療濕熱痹阻型GA的中藥類別以清熱藥、利水滲濕藥、補虛藥、活血化瘀藥、祛風濕藥等為主，體現(xiàn)了清熱利濕、健脾化濕、解毒泄?jié)?、活血化瘀止痛、祛風濕通經(jīng)絡的治法特色。性味歸經(jīng)方面，性寒為主，溫為輔，寒以清熱、涼血、解毒、利尿，溫以活血通絡。五味以甘、苦為主，其次為辛，甘能補、能緩，健脾緩急止痛；苦能瀉、能燥，清泄火熱燥濕；辛能行、能散，以行氣活血。歸經(jīng)以脾（胃）經(jīng)為主，這與GA脾虛濕盛、濕熱濁瘀毒為患的病機及其治療原則相符合[6]?；陉P聯(lián)規(guī)則的用藥規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，用藥頻次較高的藥物組合為土茯苓-萆薢、蒼術-黃柏、薏苡仁-蒼術，土茯苓-萆薢是解毒利濕、泄?jié)岢缘某Ｓ媒M合，蒼術-黃柏清熱利濕健脾，為《丹溪心法》中經(jīng)典名方二妙散，其他組合也多為二妙、三妙、四妙與土茯苓、萆薢的配伍。關聯(lián)組合分析提示，常用中藥的二項關聯(lián)、三項關聯(lián)組合，基本是以清熱藥、利水滲濕藥、活血通絡藥、化濕藥、祛風濕藥為主的相互組合，如清熱藥與利水滲濕藥配伍：土茯苓→萆薢，土茯苓→澤瀉+萆薢，土茯苓→威靈仙+萆薢；清熱藥與活血通絡藥的配伍：土茯苓→地龍，土茯苓→山慈菇+牛膝，土茯苓→赤芍+牛膝；清熱藥與祛風濕藥配伍主要有：土茯苓→秦艽，土茯苓→虎杖+萆薢等，體現(xiàn)了以清熱利濕健脾為核心，解毒泄?jié)岢?、活血通絡止痛、祛風濕利關節(jié)諸法相配的組方規(guī)律。

通過Ward方法構建樹狀聚類，共得到12組藥物聚類組合，C1、C2、C9以清熱利濕、健脾益腎為主，脾腎相互協(xié)調(diào)，若脾失健運，運化失職，則水液輸布異常；若腎氣虧虛，氣化失司，濁氣不降，則痰濁內(nèi)生凝滯關節(jié)，痹阻經(jīng)絡，引發(fā)痛風[7]。C4、C5、C8、C10以清熱解毒消腫、利濕泄?jié)岢詾橹?，可以改善濕熱痹阻型GA發(fā)作期關節(jié)紅腫熱痛，兼全身熱毒之象。其中大黃能減輕堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在尿酸性腎病腎組織中的表達，具有一定保護腎臟的作用[8]；虎杖能穩(wěn)定線粒體功能、抑制黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）活性，從而減少體內(nèi)尿酸的合成[9]?！额愖C治裁》云“久而不痊……濕痰敗血，瘀滯經(jīng)絡”[10]，痰濁阻滯，瘀血內(nèi)生，凝聚骨節(jié)，致痛風漸重，所以化瘀通絡之品至關重要，C3、C6正是以和血通痹止痛為主?！度f病回春》載“痛風者……血氣、風濕、痰火……皆令作痛”[11]，而C11、C12藥物聚類具有祛風濕、利關節(jié)、通絡止痛的功效。

結合復雜網(wǎng)絡分析結果和聚類C1可以發(fā)現(xiàn)，核心處方用藥為黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁、土茯苓、萆薢，也是用藥頻次最高的藥物。以上核心處方由四妙丸加土茯苓、萆薢而成，構成了中醫(yī)藥治療濕熱痹阻型GA的基本處方框架，具有清熱解毒、健脾利濕、泄?jié)岢灾12]。方中黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，擅除己土下焦之濕熱。蒼術性溫而燥，能除濕下安太陰。牛膝可強筋、通絡、利尿，《神農(nóng)本草經(jīng)》云“主寒濕痿痹……拘攣，膝痛不可屈”[13]。薏苡仁健脾利濕、解毒除痹，《本草新編》曰“薏仁最善利水……凡濕盛在下身者，最宜用之”[14]。土茯苓既可解毒除濕，又能通利關節(jié)；萆薢利濕祛濁，善治筋脈痹痛，兩者大劑量使用可增加尿酸排泄，降低血尿酸，為治療GA之要藥。六藥合用，為治下焦?jié)駸岜酝粗罘剑cGA的病機特點相契合?，F(xiàn)代研究表明，黃柏的各類炮制品均能夠降低尿酸鹽晶體（monosodium urate，MSU）所致的GA大鼠踝關節(jié)腫脹程度，并具有降低尿酸和肌酐水平的作用[15]?！吧n術-黃柏”藥對的作用機制可能與調(diào)控雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）的表達有關[16]。萆薢總皂苷不僅對炎癥因子具有良好的抑制作用，而且在降低血尿酸水平的同時，可發(fā)揮良好的腎臟保護作用[17]。由此可見，上述以數(shù)據(jù)挖掘方法挖掘出的高頻核心中藥亦具有現(xiàn)代藥理研究基礎。

進一步利用中藥作用機制分析工具BATMANTCM，挖掘此核心處方配伍治療濕熱痹阻型GA的內(nèi)在機制，結果提示在這6種藥物配伍所富集的疾病中，疼痛與濕熱痹阻型GA的關系最大；在這6種藥物配伍所富集的信號通路中，神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路、γ-氨基丁酸能突觸、5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）能突觸、嘌呤代謝通路所參與的靶標數(shù)量較多。目前研究發(fā)現(xiàn)，GA的發(fā)病機制主要與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號轉導通路的調(diào)控，以及NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體的激活對白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的影響有關[18]。尿酸濃度過高可能導致炎癥因子IL-1β升高，而當IL-1β被NLRP3炎癥小激活后能進一步擴大炎癥反應。GA以嘌呤代謝異常為特點，本研究發(fā)現(xiàn)核心處方中的6種藥物配伍富集的靶標與嘌呤代謝密切相關。現(xiàn)代研究證實，土茯苓可能通過抑制XOD發(fā)揮降尿酸作用[19]；薏苡仁的多種提取物對XOD均有不同程度的抑制作用[20]。γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能通過調(diào)控Ca2+通道，減少神經(jīng)末梢遞質(zhì)釋放而減輕痛覺。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)介質(zhì)，能夠直接致痛，但必須通過相應的受體介導，方能產(chǎn)生作用。研究發(fā)現(xiàn)，蒼術及其活性成分β-桉葉醇對5-HT3受體具有一定阻斷作用[21]。由此可以推測，核心處方藥物可能通過嘌呤代謝通路抑制XOD，從而發(fā)揮降尿酸作用；通過神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路，調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)，從而發(fā)揮止痛作用。

綜上所述，本研究通過醫(yī)家病案文獻數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡藥理學研究，對名老中醫(yī)治療濕熱痹阻型GA的醫(yī)案處方進行分析，發(fā)現(xiàn)整體上處方用藥以清熱利濕健脾為核心，針對濕濁瘀毒的病機特點，常常配以解毒泄?jié)岢?、活血通絡止痛、祛風濕利關節(jié)諸法。本研究結果可為濕熱痹阻型GA的臨床用藥提供具有一定價值的參考，亦為治療濕熱痹阻型GA的新藥開發(fā)提供重要的思路，但核心處方的具體作用機制還需動物實驗與臨床觀察進一步驗證與探討。