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    響應(yīng)面法優(yōu)化秦嶺黑木耳多糖提取工藝及抗氧化性研究

    2022-10-17 02:45:04楊夢佳韓曉江
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年17期
    關(guān)鍵詞:抗氧化性面法木耳

    楊夢佳,韓曉江,王 濤,張 念

    (商洛學(xué)院健康管理學(xué)院,陜西 商洛 726000)

    0 引言

    木耳(Auricularia auricula),又稱黑菜、桑耳、本菌、樹雞等,是一種藥食同源真菌,不僅可以食用,還可以作為藥用,營養(yǎng)豐富且具有很好的保健效果,被稱為“黑色瑰寶”和“人體的清道夫”[1-4]。其主要生理活性成分是木耳多糖,具有較強(qiáng)的抗氧化性[5],還可以抗腫瘤[6]、抗?jié)?、抑菌[7]、抗衰老、降血糖[8]、降血脂[9]、提高機(jī)體免疫力,對人體組織有一定的保護(hù)作用。秦嶺山區(qū)之中,獨特的氣候條件生長出的黑木耳不僅作為“小木耳,大產(chǎn)業(yè)”助力脫貧致富,更賦予了該地區(qū)黑木耳獨特的口感、營養(yǎng)價值、生理活性等[10-11]。

    通過熱水浸提輔助超聲波提取木耳多糖,經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝得到提取木耳多糖的最佳工藝參數(shù),同時對當(dāng)?shù)靥崛〉哪径嗵沁M(jìn)行抗氧化研究,為秦嶺地區(qū)黑木耳食物資源的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    陜西秦嶺特產(chǎn)柞水黑木耳;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供;苯酚(5%苯酚溶液)、濃硫酸、無水乙醇等,均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DFY-500C 型搖擺式高速粉碎機(jī),溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品;721 型可見光分光光度計,上海菁華科技有限公司產(chǎn)品;TD4-WS 型低速離心機(jī)、HH-S4 型四孔恒溫水浴鍋,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品;KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 木耳多糖提取工藝

    將從秦嶺深處柞水購買的黑木耳除去雜質(zhì),烘干后密封保存。

    黑木耳→烘干→粉碎→熱水浸提(超聲輔助)→抽濾→濃縮→5%苯酚溶液→濃硫酸→蒸餾水定容→冷卻→測定。

    1.3.2 單因素試驗

    根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-16],結(jié)合試驗研究,最終確定超聲時間20 min,超聲溫度60 ℃,浸提溫度80 ℃,浸提時間60 min,研究料液比分別為1∶40,1∶50,1∶60,1∶70,1∶80 時對多糖提取率的影響。

    確定料液比為1∶60,超聲溫度為60℃,浸提時間為60 min,浸提溫度為80 ℃。同時,超聲時間單因素試驗條件定為10,20,30,40,50 min。

    確定料液比為1∶60,浸提時間為60min,超聲時間為20min,浸提溫度為80℃。同時,超聲溫度分別設(shè)置為20,30,40,50,60 ℃。

    確定料液比為1∶60,超聲時間為20 min,浸提時間為60 min,超聲溫度為60 ℃。同時,設(shè)置浸提溫度分別為50,60,70,80,90 ℃。

    確定料液比為1∶60,超聲時間為20 min,浸提時間為60 min,超聲溫度為60 ℃。同時,設(shè)置浸提時間為 15,30,45,60,75 min。

    1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

    通過單因素試驗,確定了提取木耳多糖的最佳料液比為1∶60,最佳熱水浸提時間為80 ℃。利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗,試驗因素確定為超聲時間、超聲溫度、浸提時間。水平設(shè)置為三水平,超聲時間分別為40,50,60 min;超聲溫度分別為20,30,40 ℃;浸提時間設(shè)置為75,80,85 min。

    1.3.4 多糖提取率計算公式

    本試驗采用硫酸-苯酚法[17-18]測定多糖的含量。

    式中:C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的木耳多糖的質(zhì)量濃度,mg/mL;

    V——定容后的體積,mL;

    N——溶液最終的稀釋倍數(shù);

    m——木耳粉質(zhì)量,g。

    1.3.5 木耳多糖的抗氧化性

    試驗采用體外方法1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼(DPPH 法) 測多糖的抗氧化性[19-20]。

    配制DPPH 溶液。準(zhǔn)確稱取0.8 mg 的DPPH 試劑,溶液用無水乙醇,溶解DPPH 試劑并定容至100 mL 的棕色容量瓶中,得到濃度為0.008 mmoL/L的DPPH 溶液,放入冰箱中避光保存。

    取濃度為 0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL的木耳多糖溶液1 mL 放入具塞試管里,再加3 mL DPPH 溶液,避光反應(yīng)20 min,用無水乙醇作空白,于波長517 nm 處測吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    單因素曲線采用Excel 處理,響應(yīng)面使用Design Expert 11 軟件處理[21-22]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗

    2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

    料液比對多糖提取率的影響見圖1。

    圖1 料液比對多糖提取率的影響

    由圖1 可知,木耳多糖的提取率隨著料液比的增加先增加后下降,最低提取率為22.29%時,料液比為1∶40;最高提取率為22.41%時,料液比為1∶60,極差是0.12%。經(jīng)過料液比的單因素試驗,可以確定出在該試驗中提取秦嶺黑木耳多糖的最佳料液比為1∶60。

    2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

    超聲時間對多糖提取率影響結(jié)果見圖2。

    由圖2 可知,木耳多糖的提取率隨著超聲時間的增加呈上升趨勢,但在20~50 min 時多糖提取率的增加偏緩,只有在超聲時間由10 min 變?yōu)?0 min時,多糖的提取率有顯著的提升,隨著超聲時間延長,可能會有其他雜質(zhì)隨著多糖一起流入溶液中,影響多糖的測定。在不同超聲時間下,作為響應(yīng)面法研究的影響木耳多糖提取率的單因素之一,以此確定最佳的超聲時間。

    圖2 超聲時間對多糖提取率影響結(jié)果

    2.1.3 超聲溫度對多糖提取率的影響

    超聲溫度對多糖提取率影響結(jié)果見圖3。

    圖3 超聲溫度對多糖提取率影響結(jié)果

    由圖3 可知,超聲溫度為20~50 ℃時木耳多糖的提取率直線下降。超聲溫度為60 ℃時,木耳多糖的提取率又突然升高,這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因為超聲溫度越高,對細(xì)胞的破壞性就越大,細(xì)胞中的多種內(nèi)容物就融入到了溶液中,導(dǎo)致測多糖溶液的吸光度突然升高。同時,考慮和其他因素的交互作用,選擇多糖提取率最高的3 個溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗,以此確定超聲溫度提取黑木耳多糖的最佳溫度。

    2.1.4 浸提溫度對多糖提取率的影響

    浸提溫度對多糖提取率影響結(jié)果見圖4。

    圖4 浸提溫度對多糖提取率影響結(jié)果

    由圖4 可知,浸提溫度為80 ℃時,木耳多糖的提取率達(dá)到最高,為23.64%。浸提溫度對多糖提取的影響趨勢有規(guī)律可循,選擇水提法的浸提最佳溫度為80 ℃。

    2.1.5 浸提時間對多糖提取率的影響

    浸提時間對多糖提取率影響結(jié)果見圖5。

    圖5 浸提時間對多糖提取率影響結(jié)果

    由圖5 可知,熱水提取黑木耳多糖時對黑木耳多糖的提取率影響很大,但沒有規(guī)律可循。當(dāng)浸提時間為30~60 min 時,多糖提取率突然降低,當(dāng)浸提時間為75 min 時,多糖提取率突然上升,不能確定隨著時間延長多糖得率變化趨勢,但浸提時間對多糖提取率極差在0.2%以內(nèi),考慮因素交互作用,選擇浸提時間作為響應(yīng)面法因素進(jìn)行優(yōu)化。

    2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

    2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    響應(yīng)面分析試驗設(shè)計表1。

    表1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

    通過單因素試驗,其中有2 個因素的試驗結(jié)果顯著,即料液比1∶60,提取溫度80℃,其余3 個因素超聲時間、超聲溫度和浸提時間有待進(jìn)一步確定。單因素試驗結(jié)果表明,超聲時間在50 min 時,木耳多糖的提取率最高,所以在設(shè)計響應(yīng)面試驗時,超聲時間設(shè)置為50 min 左右2 個水平,即40,50,60 min。超聲溫度和浸提時間水平選擇原理一樣,但由于超聲波清洗儀溫度設(shè)置太低容易受到室內(nèi)溫度的影響,因此選擇超聲溫度為20,30,40 ℃。通過響應(yīng)面法設(shè)計試驗,共設(shè)計17 組試驗。

    響應(yīng)面分析試驗設(shè)計見表2。

    表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

    用Design Expert 11 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,得到以下回歸方程:

    為了檢驗黑木耳多糖提取工藝的回歸模型有效性,對該模型進(jìn)行檢驗和方差分析(見表3)。該回歸模型的p<0.01,表明這個回歸模型極顯著,并且失擬項p=0.112 9>0.05,表示不顯著,說明該模式成立??梢杂迷撃J竭M(jìn)行木耳多糖的最佳工藝優(yōu)化。

    方差分析結(jié)果見表3。

    表3 方差分析結(jié)果

    2.2.2 響應(yīng)面因素交互作用分析

    任意兩因素之間的相互作用結(jié)果見圖6。

    圖6 任意兩因素之間的相互作用結(jié)果

    響應(yīng)面的等高線顏色從藍(lán)變紅表示提取的物質(zhì)含量由少到多,2 個因素的相互作用越大,等高線形成的形狀越趨近橢圓,離心率就越大。等高線所形成的橢圓越扁,則表明這2 個因素的交互作用越明顯。由圖6 可知,超聲時間和浸提時間相互作用的等高線形狀是橢圓形,說明這2 個因素的交互作用較大,超聲時間和超聲溫度的交互作用不是很明顯。木耳多糖的影響因素還可以通過觀察曲線的走勢來判斷。曲線的走勢越陡,說明該因素對木耳多糖的提取率越大,反之則越小。由圖6 可知,影響木耳多糖提取含量的重要因素是超聲溫度,其次是浸提時間,最后是超聲時間。這個結(jié)果和表3 一致。由響應(yīng)面法回歸模型預(yù)測的木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲溫度26.813 ℃,浸提時間75.776 min,超聲時間50.856 min,最大的多糖提取率預(yù)測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷,將響應(yīng)面法模型優(yōu)化的提取條件設(shè)置為整數(shù),即超聲溫度26 ℃,浸提時間75 min,超聲時間50 min。在改變條件的情況下,進(jìn)行3 次平行驗證試驗,3 次木耳多糖提取率的平均結(jié)果是24.95%,與模型預(yù)測的結(jié)果相差不大。因此,試驗?zāi)P涂梢暂^好地模擬和預(yù)測木耳多糖的浸提率和最優(yōu)條件。

    2.3 木耳多糖抗氧化性結(jié)果與分析

    木耳多糖對DPPH 自由基清除率見圖7。

    圖7 木耳多糖對DPPH 自由基清除率

    由圖7 可知,木耳多糖有一定的抗氧化性,其抗氧化能力隨多糖含量的提高而提高,與現(xiàn)在有文獻(xiàn)的結(jié)論基本一致[23]。在木耳多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時,對自由基的清除率高達(dá)60.4%。木耳多糖的抗氧化性的發(fā)現(xiàn)和研究可以使木耳的銷路更好,使木耳的產(chǎn)業(yè)鏈更加完整,可將其加入到保健食品中,對緩解人體的衰老速度具有積極的意義。

    3 結(jié)論

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對木耳多糖的最佳提取工藝條件進(jìn)行研究,響應(yīng)面法回歸模型預(yù)測木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲時間50.856 min,超聲溫度26.813 ℃,浸提時間75.776 min,最大的多糖提取率預(yù)測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷,將響應(yīng)面法模型優(yōu)化的提取條件設(shè)置為整數(shù),即超聲溫度26 ℃,浸提時間75 min,超聲時間50 min,進(jìn)行3 次平行驗證試驗,3 次木耳多糖提取率的平均結(jié)果為24.95%,與模型預(yù)測的結(jié)果相差不大。木耳多糖的抗氧化性采用DPPH 法對其進(jìn)行測定,不同質(zhì)量濃度的多糖溶液的抗氧化性不同,質(zhì)量濃度越大,抗氧化性越強(qiáng)。當(dāng)木耳多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時,對DPPH 自由基的清除率達(dá)到60.4%。

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