基于農(nóng)藝性狀的山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

董俊美， 李錦超， 賈凱旋， 孟義江， 楊太新， 葛淑俊

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000)

山藥(Thunb.)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬多年生纏繞性藤本植物，是我國最古老的作物之一，產(chǎn)量高且適應(yīng)性強(qiáng)，至今廣泛分布于各地。山藥根莖中營養(yǎng)成分含量豐富，是中華人民共和國衛(wèi)生部首批公布的藥食同源的中藥材之一，也是出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)品。近年來，山藥的栽培面積不斷擴(kuò)大，對優(yōu)異種質(zhì)的需求也日漸增多，但是目前山藥地方性品種居多，種質(zhì)資源混亂且同名異物或同物異名情況嚴(yán)重。

為了促進(jìn)山藥種質(zhì)資源的高效利用，亟需開展更多山藥遺傳多樣性的鑒評。目前山藥種質(zhì)資源鑒評主要集中在形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記2個方面。在形態(tài)學(xué)方面，吳金平等采用類平均聚類法將66份山藥種質(zhì)資源分為薯蕷、參薯2種類型，通過主成分分析提取出5個主因子，其中第1主成分反映了高產(chǎn)株型綜合因子；覃維治等對44份山藥種質(zhì)資源的19個農(nóng)藝性狀進(jìn)行質(zhì)量、數(shù)量性狀的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，遺傳多樣性指數(shù)最高的是葉形、薯塊長度，數(shù)量性狀的遺傳變異主要來自單株產(chǎn)量，各性狀間具有較高的多樣性；許念芳等以30份山藥品種為材料進(jìn)行差異性及聚類分析，發(fā)現(xiàn)各形態(tài)指標(biāo)間的變異較大，將參試種質(zhì)劃分為北方山藥、日本山藥與南方山藥3類，并提到在植物學(xué)或園藝學(xué)分類中，應(yīng)考慮結(jié)合種質(zhì)的形態(tài)及生態(tài)特性；張武君等根據(jù)山藥葉、根的形態(tài)學(xué)差異，將山藥種質(zhì)分為薯蕷、參薯、黃獨(dú)、福州薯蕷4類。在分子標(biāo)記方面，研究者已經(jīng)采用DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、簡單重復(fù)序列(SSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AELP)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)等一系列技術(shù)手段對山藥種質(zhì)資源的分子遺傳水平進(jìn)行了研究，為山藥種質(zhì)資源利用奠定了基礎(chǔ)。Padhan等對9份山藥資源的遺傳多樣性水平進(jìn)行鑒定，采用5個簡單序列重復(fù)標(biāo)記，在材料的5個標(biāo)記位點(diǎn)上檢測到10條多態(tài)性條帶，表明薯蕷()、、與參薯()具有較高的遺傳相似性；Cao等通過測定褐苞薯蕷葉綠體全基因組序列，得出其GC含量為37.01%，預(yù)測出129個基因，其中包含84個蛋白編碼基因、8個rRNA基因、37個tRNA基因。通過上述及一些其他有關(guān)生物核型與品質(zhì)方面的研究得出山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性的豐富程度，為山藥種質(zhì)的進(jìn)一步評價與利用提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

山藥種質(zhì)資源豐富，基于形態(tài)學(xué)的遺傳多樣性評價更為基礎(chǔ)且簡單直觀，是衡量物種多樣性的重要指標(biāo)和研究內(nèi)容。本研究收集了各主產(chǎn)區(qū)的43份山藥種質(zhì)資源，對其進(jìn)行農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)采集，通過多種統(tǒng)計方法分析山藥的遺傳多樣性，旨在明確不同山藥資源及性狀指標(biāo)間的遺傳多樣性水平，為山藥種質(zhì)資源的篩選和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的山藥材料為43份，主要來自河北省、河南省、山東省和福建省等地，名稱及來源見表1。

表1 供試山藥資源的基本信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)所用山藥于2019—2020年種植于河北省安國市中藥都藥博園試驗(yàn)基地，土壤為沙壤土。，每年4月下旬播種，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共3次重復(fù)，采用開溝起壟立架的栽培方式種植，行長 5 m，行距40 cm，株距15 cm。將根莖切段后種植，每段40 g左右。種植前施用4 500 kg/hm腐熟有機(jī)底肥，生長中期施肥2次，每次追施600 kg/hm，其他田間管理措施同常規(guī)大田栽培。

1.2.2 鑒定指標(biāo)及方法 每種山藥資源隨機(jī)選取無病蟲害、無機(jī)械損傷的5個單株，掛牌標(biāo)記。在根莖形成期調(diào)查地上部形態(tài)指標(biāo)(葉片與零余子)，地下部形態(tài)指標(biāo)(根莖)的調(diào)查于山藥收獲期進(jìn)行，采收掛牌植株的根莖進(jìn)行考種。在鑒定質(zhì)量性狀指標(biāo)時，應(yīng)遵循最大相似原則，記錄結(jié)果并分級賦值。表型性狀及鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《山藥種質(zhì)資源描述和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》執(zhí)行，詳見表2。

表2 山藥農(nóng)藝性狀鑒定項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖，用SPSS Statistics 25.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計、相關(guān)性分析、主成分分析及系統(tǒng)聚類，參照杜榮騫的組距式分組法對數(shù)值型性狀進(jìn)行分級。鑒于部分資源無零余子，除描述統(tǒng)計外，其余分析使用部分農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的分布

2.1.1 質(zhì)量性狀的頻率分布 對43份山藥種質(zhì)資源的9個質(zhì)量性狀進(jìn)行頻率分析，由圖1可以看出，各性狀在不同級別上的分布不均勻。在葉片形狀上，心形葉片最多，占74.4%；其次為矛形葉片，占16.3%；戟形葉片占比最少。在葉色上，深綠色的葉片最多，占58.1%；其次為綠色葉片，占25.6%；淺綠色葉片多數(shù)為南方資源，占比少，葉片較嫩。在葉缺裂上，淺裂葉片資源最多，占53.5%；其次為全緣葉片，占比為32.6%。葉腋處結(jié)有零余子的資源最多，占76.7%；南方資源多數(shù)無零余子。零余子形狀以球形為主，占51.5%；其次為橢圓形、不規(guī)則形，分別占33.3%、12.1%。根莖形狀以棍狀、 棒狀為主，分別為37.2%、34.9%。根莖表皮光滑的資源占比達(dá)58.1%，其余均為表面粗糙型資源。薯皮顏色以黃褐色為主，占比達(dá)30.2%。葉脈數(shù)分為7條(90.7%)、9條(9.3%)2種類型。

2.1.2 數(shù)量性狀的分布頻次 由圖2可以看出，各數(shù)量性狀的分布頻次存在差異，其中葉面積在 25.5～67.5 cm的分布頻次最高，此類種質(zhì)有小白嘴、白玉等；葉綠素含量(SPAD值)在>2.4～2.7分布頻次占比最高，分布相對均勻，此類種質(zhì)有棒藥、太古等；葉形指數(shù)在1.42～1.54范圍內(nèi)的分布頻次最高，此類種質(zhì)有紫山藥、佛手等；零余子球形指數(shù)在0.84～1.16范圍的分布頻次占比最高，此類種質(zhì)有華山、貴港山藥等；百粒質(zhì)量在>35.5～57.5 g 的分布頻次最高，此類種質(zhì)有黃皮、隴山藥1號等；根莖全長在>68.5～88.5 cm范圍的分布頻次占比最高，為44.19%，此類種質(zhì)有靳家?guī)X2號、偃野1號等；莖粗在17.5～34.5 mm范圍的分布頻次最高，此類種質(zhì)有山東2號、晉城2號等；蘆頭長在>12.5～24.5 cm范圍的分布頻次最高，此類種質(zhì)有白皮、鐵棍山藥等。

2.2 山藥種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的變異特征

由表3可知，山藥種質(zhì)資源性狀指標(biāo)間變異豐富，平均變異系數(shù)達(dá)到38.95%，變異范圍在9.32%～79.86%之間。農(nóng)藝性狀中除葉形指數(shù)、SPAD值及零余子直徑外，其他性狀的變異系數(shù)均大于25%，葉片性狀中變異系數(shù)最大的是葉面積，達(dá)79.86%，南方種質(zhì)資源的葉面積相對較大，且葉形指數(shù)較大，表示葉片較狹長。在零余子性狀中，變異系數(shù)較大的為零余子百粒質(zhì)量、球形指數(shù)，分別為48.83%、30.30%，球形指數(shù)接近1，代表零余子呈現(xiàn)出圓形。在根莖性狀中，變異系數(shù)較大的為蘆頭長、莖粗，分別為56.10%、51.97%，其次為單株質(zhì)量，為51.16%，其余性狀的變異系數(shù)均大于35%。北方資源的蘆頭較長，蘆頭占比最高達(dá)36.47%；南方資源的蘆頭較短，最小占比僅為7.08%。由此可見，蘆頭占比是品種選育時的重要指標(biāo)。

表3 山藥種質(zhì)資源的主要性狀

總體來說，山藥種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀間均存在較大變異，地下部相關(guān)性狀的變異幅度大于地上部相關(guān)性狀，表明其種質(zhì)資源的遺傳多樣性較豐富，為優(yōu)良種質(zhì)的選擇和育種創(chuàng)造了條件。

2.3 山藥主要農(nóng)藝性狀與小區(qū)產(chǎn)量的相關(guān)性分析

對供試山藥資源的主要農(nóng)藝性狀與小區(qū)產(chǎn)量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，葉色、根莖全長與小區(qū)產(chǎn)量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.408、0.429；葉缺裂與小區(qū)產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.354；其余性狀與產(chǎn)量間的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平(表4)。表明葉色深綠、根莖粗長及單莖高質(zhì)量是高產(chǎn)山藥種質(zhì)資源的特征，在進(jìn)行品種選育時要注意選擇有此類特征的資源。

表4 山藥主要農(nóng)藝性狀與小區(qū)產(chǎn)量的相關(guān)性

分別對供試的南北方山藥種質(zhì)資源的主要農(nóng)藝性狀與小區(qū)產(chǎn)量進(jìn)行相關(guān)性分析，表5結(jié)果表明，在南方種質(zhì)資源中，莖粗、葉色與小區(qū)產(chǎn)量呈顯著或極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.244、0.369；葉面積與小區(qū)產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。由此可見，在實(shí)際生產(chǎn)中，南方資源在北方生態(tài)區(qū)域環(huán)境條件的影響下，產(chǎn)量會有一定變化。在北方種質(zhì)資源中，葉色、根莖形狀、莖粗與小區(qū)產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.480、0.466、0.437，蘆頭占比與產(chǎn)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 -0.360，表明蘆頭占比越大，產(chǎn)量越低，因此蘆頭長度也是影響山藥產(chǎn)量的重要因素。

表5 山藥不同來源種質(zhì)主要農(nóng)藝性狀與小區(qū)產(chǎn)量的相關(guān)性

2.4 山藥主要農(nóng)藝性狀的主成分分析

對山藥種質(zhì)資源的21個主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析，表6結(jié)果顯示，前5個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.705%，特征值總和為16.949，表明前5個主成分覆蓋了農(nóng)藝性狀的大部分信息。

表6 山藥部分農(nóng)藝性狀的主成分分析

第1主成分的特征值為10.833，貢獻(xiàn)率為51.584%，特征向量中載荷值較高且為正值的有零余子有無、葉長及葉周長等，說明此類性狀主要反映地上部植株長勢，在品種選育時應(yīng)選擇長勢旺、光合利用率良好的品種，在一定范圍內(nèi)有利于實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。第2主成分的特征值為2.510，貢獻(xiàn)率為11.951%，特征向量中載荷值較高且為正值的是單株質(zhì)量，載荷值高達(dá)0.951，這類因子被稱作高產(chǎn)因子。第3主成分的特征值為1.375，貢獻(xiàn)率為6.546%，特征向量中載荷值較高且為正值的為葉形、葉形指數(shù)，此類性狀反映了植株葉片在不同地區(qū)生長環(huán)境與資源間的差異，因此在進(jìn)行不同生態(tài)區(qū)域的引種時應(yīng)注意此類性狀的選擇。第4主成分的特征值為1.138，主要反映了山藥種質(zhì)的薯皮顏色。第5主成分的特征值為1.093，反映了山藥的葉脈數(shù)因子。

2.5 山藥種質(zhì)資源的聚類分析

采用組間聯(lián)接法對種質(zhì)進(jìn)行聚類，在遺傳距離為6.5處將供試山藥材料分為四大類群。

由表7、圖3可以看出，第Ⅰ大類群包括33份資源，占供試材料總數(shù)的76.7%，主產(chǎn)于北方地區(qū)。這類材料的特征如下：長勢一般；葉片中淺裂且相對較??；葉色深綠，多為心形；結(jié)有零余子；根莖形狀多為棍、棒狀且多數(shù)根莖、蘆頭長度分別為68.8～88.5、12.5～24.5 cm；表皮較光滑且呈黃褐色。第Ⅱ類群包括2份資源，占供試材料總數(shù)的4.7%，主產(chǎn)于南方地區(qū)。這類材料的特征如下：長勢中等；葉片全緣、葉色淺綠，無零余子；根莖、蘆頭長度分別為8.5～28.5、0.5～6.5 cm，表皮粗糙，呈褐紫色。第Ⅲ類群包括5份資源，占供試材料總數(shù)的比例為11.6%，這類材料的特征如下：長勢較好，藤蔓粗長；無零余子；根莖粗壯，呈不規(guī)則短圓形，粗度為70～100 mm；蘆頭較短。第Ⅳ類群包含3份資源，占供試材料總數(shù)的比例為7%，這類材料的特征如下：葉面積最大，生長最為旺盛，其余特點(diǎn)均與第Ⅱ、Ⅲ類群相似。在遺傳距離為4.0處可將第Ⅰ類群分為2個亞類，第2亞類的根莖比第1亞類粗長，產(chǎn)量相對較高。

表7 山藥種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀的分類

3 討論

明確種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平是開展育種工作的基礎(chǔ)和前提，山藥在長期栽培過程中積累了豐富的種質(zhì)資源類型，尤其是山藥地方性品種，雖然有關(guān)產(chǎn)量性狀不如部分育成品種，但在某一特定性狀上保持著較高的遺傳多樣性水平。目前，山藥的育種方法主要有選擇育種和誘變育種2種，其中選擇育種是山藥的主要育種手段，而群體內(nèi)的變異是選擇育種的前提。在本研究中，山藥種質(zhì)資源類型表現(xiàn)出了較高的遺傳多樣性水平，為選育出適合河北省種植的山藥品種奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成山藥產(chǎn)量的主要因子為葉色、葉缺裂、根莖全長。舒銳等通過對山藥種薯的研究也得出過類似的結(jié)果。葉面積是影響植物光合效能的重要豐產(chǎn)指標(biāo)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉面積性狀與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，因此對南北方類型資源各自進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，北方資源中葉面積與產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系，南方資源中葉面積與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此可見，在生產(chǎn)中，在北方生態(tài)環(huán)境條件的影響下，南方資源的產(chǎn)量可能會產(chǎn)生一定差異。

本研究通過主成分分析，將山藥的主要農(nóng)藝性狀簡化為植株長勢因子、產(chǎn)量因子、區(qū)域性因子、薯皮顏色與葉脈數(shù)因子，該結(jié)果與吳金平等的研究結(jié)果基本一致，不同主成分反映的性狀存在差異，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意對前3個主成分的選擇。聚類結(jié)果顯示，在遺傳距離6.5處可將山藥分為四大類群，與覃維治等的分類結(jié)果相似，尤其是第一大類群，符合北方區(qū)域資源特征，其余3類全部符合南方區(qū)域特征，由于個別形態(tài)差異被劃分開，反映了不同地域資源間的類型差異及遺傳多樣性，通過差異性聚類，為山藥綜合分類提供了參考。在實(shí)際育種工作中，建議通過引種馴化增加當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源，提高其產(chǎn)量及質(zhì)量，同時加強(qiáng)不同類群間的親本互配及種質(zhì)交流。

基于形態(tài)學(xué)性狀的鑒定方法易受外界環(huán)境影響，因此在進(jìn)行多年多點(diǎn)鑒定的同時，還應(yīng)結(jié)合分子標(biāo)記、生理生化等多技術(shù)手段，進(jìn)行更深層的基因組學(xué)等方面的研究。通過加大種質(zhì)資源收集力度，并采用多鑒定手段使山藥種質(zhì)的一系列遺傳信息逐步揭示和完善，從而達(dá)到全方位、更準(zhǔn)確的鑒定。

4 結(jié)論

本研究通過對不同山藥種質(zhì)資源進(jìn)行農(nóng)藝性狀鑒定，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)性狀指標(biāo)間存在豐富的遺傳多樣性。綜合相關(guān)性和主成分分析，篩選出葉面積、根全長、莖粗等性狀，可作為山藥鑒定的重要參考指標(biāo)。聚類分析結(jié)果反映了不同地域資源間的類型差異，為山藥后續(xù)種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用及優(yōu)良品種選育奠定了基礎(chǔ)。