• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代1 000代的穩(wěn)定性研究

    2022-10-16 11:55:52劉福東桑躍洪維鍊趙雯張紅星
    中國奶牛 2022年9期
    關(guān)鍵詞:傳代干酪益生菌

    劉福東,桑躍,洪維鍊,趙雯,張紅星

    (1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),蘭州市 730070;3.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,呼和浩特 010110;4.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,呼和浩特 010110)

    益生菌(Probiotics)是指通過攝入一定的數(shù)量,對宿主的身體健康有益的活的微生物。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、抗氧化、降血糖、降血脂、改善骨骼健康等多種益生作用[1~4]。

    目前,益生菌已廣泛應(yīng)用于食品等各個(gè)領(lǐng)域,對其穩(wěn)定性的研究也越來越受到關(guān)注,焦點(diǎn)主要集中在以下幾個(gè)方面:①益生菌添加到產(chǎn)品中其存活的穩(wěn)定性;②益生菌的生理學(xué)特征及穩(wěn)定性;③益生菌遺傳和表達(dá)的穩(wěn)定性。高穩(wěn)定性益生菌能夠更好地發(fā)揮其功效,為益生菌的加工生產(chǎn)以及菌株安全性提供保障[5]。

    副干酪乳桿菌ET-22分離自健康人體腸道,具有免疫調(diào)節(jié)[6]、緩解腸道炎癥和便秘[7,8]、促進(jìn)骨骼健康[9]等多種益生功能,目前已在發(fā)酵乳制品、益生菌制劑及保健品等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了應(yīng)用。為研究ET-22菌株的傳代穩(wěn)定性,本文從細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力及全基因組變異情況6個(gè)方面進(jìn)行了考察,對ET-22在連續(xù)傳代過程中的表型特征和遺傳信息穩(wěn)定性進(jìn)行了研究分析,以期為ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供一定的理論參考和指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株

    副干酪乳桿菌ET-22由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供,保藏于中國普通微生物菌種保藏中心,保藏編號(hào)為CGMCC No.15077。

    1.1.2 試劑與儀器

    試劑:MRS培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;脫脂乳粉,恒天然合作社集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、瓊脂粉等常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

    儀器:潔凈工作臺(tái)(DJ-CJ-2ND1),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(SPX-300),寧波樂電儀器制造有限公司產(chǎn)品;智能高速冷凍離心機(jī)(3H16RI),湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品;pH計(jì)(FE28),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;超純水系統(tǒng)(SMART-N),上??道追治鰞x器有限公司產(chǎn)品;紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2808),尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;全自動(dòng)高壓滅菌器(LDZX-75L),上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(CX31),日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;場發(fā)射掃描電鏡(SU8020),日本日立公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌株的連續(xù)傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算[10]

    將0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行長期連續(xù)傳代培養(yǎng)至1 000代。以12h為1個(gè)傳代周期,按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量連續(xù)傳代培養(yǎng)。副干酪乳桿菌ET-22的一個(gè)單細(xì)胞經(jīng) n次分裂增殖后細(xì)菌數(shù)為2n個(gè)。在每個(gè)傳代周期(12h)內(nèi),菌體近似幾何級(jí)數(shù)(2n)增殖。通過測定菌株生長曲線可知,當(dāng)接種量為2%時(shí),菌數(shù)約增長50倍,則每個(gè)周期內(nèi)的生長代數(shù)(即細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù))為log250≈5.64 代。

    1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,對菌株進(jìn)行一次光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察。

    光學(xué)顯微鏡觀察:培養(yǎng)周期末將培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后革蘭氏染色,100倍油鏡觀察細(xì)胞形態(tài),拍照并記錄。

    掃描電鏡觀察:培養(yǎng)周期末將菌液離心收集菌體,使用PBS緩沖液重懸離心2~3次,2.5%戊二醛固定菌體,臨界點(diǎn)干燥脫水,掃描電鏡觀察細(xì)胞完整度和細(xì)胞表面褶皺程度,拍照并記錄。

    1.2.3 菌落形態(tài)觀察

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,即將培養(yǎng)液按10倍稀釋法稀釋到合適梯度,涂布于MRS固體培養(yǎng)基,37℃倒置培養(yǎng)48h,觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等特征,拍照并記錄。

    1.2.4 活菌數(shù)檢測

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定發(fā)酵活菌數(shù)一次,檢測3個(gè)平行。將培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇適當(dāng)?shù)?~3個(gè)梯度進(jìn)行傾注平板,37℃倒置培養(yǎng)48h,選取菌落總數(shù)在30~300范圍內(nèi)平板作為活菌計(jì)數(shù)的指標(biāo)。

    1.2.5 濁度檢測

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定一次培養(yǎng)液濁度,檢測3個(gè)平行。以未接菌的MRS培養(yǎng)基作為空白對照,使用紫外分光光度計(jì)檢測培養(yǎng)液在600nm處的吸光度。

    1.2.6 菌株發(fā)酵活力的測定[11]

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定一次菌體發(fā)酵活力,檢測3個(gè)平行。菌體發(fā)酵活力可以通過菌株發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生酸的量來測定,將菌體以1×107CFU/mL濃度接種于10mL滅菌脫脂乳中,37℃恒溫培養(yǎng)24h,取出后立即放入冰浴,每樣加20mL蒸餾水稀釋,用0.1 mol/L NaOH滴定pH至8.50~8.55,維持30s穩(wěn)定,記錄消耗NaOH體積,計(jì)算樣品中的乳酸濃度,換算為活力單位。

    滅菌脫脂乳制作:10%脫脂乳粉,2%葡萄糖,121℃滅菌15min,急冷,4℃冰箱中存放備用。

    發(fā)酵活力:以每1000萬(107)個(gè)菌體細(xì)胞在以上條件下發(fā)酵1mL脫脂乳產(chǎn)生1μmol乳酸計(jì)為1個(gè)活力單位(U)。

    1.2.7 遺傳穩(wěn)定性測定

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,提取菌體基因組DNA一次,進(jìn)行基因組重測序分析。0代菌體采用二代+三代的測序方式獲得基因組完成圖,200~1 000代菌體采用二代測序獲得基因組掃描圖,分別將200~1 000代基因組掃描圖與0代基因組完成圖進(jìn)行比對,分析菌株ET-22在連續(xù)傳代過程中遺傳信息的變化。副干酪乳桿菌ET-22基因組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 傳代過程中菌株細(xì)胞形態(tài)觀察

    副干酪乳桿菌ET-22屬于乳桿菌屬中的干酪乳桿菌組群,是革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,長度0.9~3.1μm,單個(gè)、成對或成短鏈排列[12]。圖1為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的顯微鏡照片,照片中顯示ET-22在傳代過程中菌體細(xì)胞均為成對或成鏈桿狀排列,細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化。圖2為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的掃描電鏡照片,可以看出,細(xì)胞表面光滑、結(jié)構(gòu)完整,不同代數(shù)細(xì)胞之間無明顯差異。

    圖1 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程光學(xué)顯微鏡照片

    圖2 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程掃描電鏡照片

    2.2 菌株傳代過程中菌落形態(tài)觀察

    圖3為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的涂布平皿菌落形態(tài)照片。照片顯示,不同代數(shù)副干酪乳桿菌ET-22的菌落形態(tài)一致,呈圓形,直徑1~3mm,顏色為白色,表面光滑、隆起,邊緣整齊,符合副干酪乳桿菌菌落特征[12]。說明副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代過程中,菌落形態(tài)無明顯變化,穩(wěn)定性較好。

    圖3 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程菌落形態(tài)照片

    2.3 生長周期末活菌數(shù)變化情況

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間,不同代數(shù)各菌株活菌數(shù)變化情況見表1。根據(jù)顯著性分析結(jié)果顯示,不同培養(yǎng)代數(shù)菌株活菌數(shù)無顯著性差異(P〉0.05),表明隨著傳代次數(shù)的增加,沒有改變菌株的生長特性。

    表1 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間的活菌數(shù)變化情況

    圖4顯示副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代培養(yǎng)1 000代期間活菌數(shù)的變化趨勢。圖中顯示,不同代數(shù)各菌株的活菌數(shù)隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈小幅度波動(dòng)性變化,總數(shù)基本維持不變。

    圖4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間活菌數(shù)變化趨勢

    2.4 生長周期末濁度變化情況

    菌株發(fā)酵液的濁度變化反映總生物量的變化情況。在連續(xù)培養(yǎng)1 000代過程中,副干酪乳桿菌ET-22的OD600值變化情況見表2。表中顯示,副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中OD600值無顯著性變化(P〉0.05)。

    表2 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化情況

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代期間的OD600值變化趨勢如圖5所示。圖中顯示,連續(xù)傳代過程中,OD600值隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化,幅度較小,說明在本試驗(yàn)條件下,連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌體發(fā)酵液的總生物量沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

    圖5 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化

    2.5 菌株發(fā)酵活力

    菌株的發(fā)酵活力是評價(jià)其發(fā)酵性能的重要指標(biāo),其穩(wěn)定性是開發(fā)和研制直投式發(fā)酵劑的必備條件[13]。菌株發(fā)酵活力很容易受到外界不利條件的影響,導(dǎo)致其生物活性降低,從而影響發(fā)酵劑的穩(wěn)定性和保質(zhì)期[14]。定期檢測菌株在傳代過程中的產(chǎn)酸活力變化,是菌種穩(wěn)定性研究的一項(xiàng)重要工作,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[11]。

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間,不同代數(shù)各菌株發(fā)酵活力變化情況見表3。從表中可知,副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中發(fā)酵活力無顯著性變化(P〉0.05)。副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢如圖6所示,可以看出連續(xù)傳代過程中,菌株發(fā)酵活力隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化,但幅度較小,說明連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌株發(fā)酵活力沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

    表3 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化情況

    圖6 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢

    2.6 遺傳信息的穩(wěn)定性

    細(xì)菌基因組重測序,即從頭測序,是在不依賴任何參考序列的情況下對基因組進(jìn)行測序,并利用生物信息學(xué)手段從頭組裝得到基因組序列。根據(jù)最終基因組組裝的完整程度不同,分為完成圖測序和掃描圖測序。

    本研究對0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行了基因組完成圖測序,結(jié)果可知ET-22全基因組總長度3 078 179bp,編碼基因總數(shù)量為3 141個(gè),其中包含60個(gè)tRNA和15個(gè)rRNA編碼基因,在整個(gè)基因組水平上的平均GC含量為46.33%。

    經(jīng)對200~1 000代ET-22進(jìn)行掃描圖測序分析,并與0代完成圖進(jìn)行比較基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析(表4),發(fā)現(xiàn)ET-22在0~600代內(nèi)SNP、MNP、IMS、DEL、INV以及DUP位點(diǎn)均為0,800~1 000代內(nèi)僅出現(xiàn)最多4個(gè)SNP位點(diǎn)。

    表4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間基因組突變信息統(tǒng)計(jì)

    SNP分析是評價(jià)菌株遺傳信息差異的重要手段[15-16],相比較傳統(tǒng)的16SrRNA 基因[17]、pheS/atpD 功能基因[18]、平均核苷酸一致性(ANI)[19]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[20]等分析技術(shù),分析信息更全面,應(yīng)用范圍更廣。PIGHTLING等人認(rèn)為SNP差異小于21是判斷為同一菌株的標(biāo)準(zhǔn)[21],副干酪乳桿菌ET-22在傳代過程中SNP差異較小(SNP<5),符合同一菌株標(biāo)準(zhǔn),表明菌株在連續(xù)傳代1 000代期間遺傳信息維持穩(wěn)定。

    3 結(jié)論

    菌株生理和遺傳穩(wěn)定是其商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ),近年來國內(nèi)外學(xué)者對多種益生菌及發(fā)酵劑菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了大量研究。烏云等[11]考察了1株益生乳酸菌P-8在連續(xù)傳代1 000~2 000代期間的表型特征變化,表明P-8經(jīng)過長時(shí)間不間斷連續(xù)傳代其表型特征穩(wěn)定。劉天偉等[20]研究了乳酸菌發(fā)酵劑的遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果表明發(fā)酵劑在長時(shí)間儲(chǔ)藏和傳代培養(yǎng)過程中基因組信息以及蛋白表達(dá)無明顯變化,具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

    本文對副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代1 000代期間的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力和全基因組變異系數(shù)的變化情況進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明ET-22表型特征和遺傳學(xué)信息在長期傳代過程中具有良好的穩(wěn)定性。本文結(jié)論可以為副干酪乳桿菌ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo),也可為其他益生菌株和發(fā)酵菌株的開發(fā)提供實(shí)踐參考。

    猜你喜歡
    傳代干酪益生菌
    嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對其益生特性及貨架期菌數(shù)的影響
    副干酪乳桿菌RS26培養(yǎng)條件優(yōu)化
    副干酪乳桿菌RS26培養(yǎng)基優(yōu)化
    塞尼卡病毒A在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng)條件探索
    益生元和益生菌促進(jìn)豬生長和健康
    益生菌別貪多
    幸福(2017年18期)2018-01-03 06:34:45
    神奇的小小腸道益生菌
    微生物實(shí)驗(yàn)室菌種復(fù)蘇傳代保存流程分析
    中國益生菌網(wǎng)
    羊睪丸原代細(xì)胞傳代試驗(yàn)
    草食家畜(2013年3期)2013-06-05 15:23:53
    x7x7x7水蜜桃| 亚洲专区字幕在线| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲免费av在线视频| 69av精品久久久久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久草成人影院| 国产亚洲精品一区二区www| 国产精品 国内视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品国产国语对白av| 国产一区二区三区综合在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一区在线观看完整版| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品人妻在线不人妻| 亚洲专区字幕在线| 久9热在线精品视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产免费男女视频| 亚洲欧美激情综合另类| 天堂√8在线中文| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产麻豆69| 欧美激情极品国产一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 成年女人毛片免费观看观看9| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久中文字幕人妻熟女| 老汉色∧v一级毛片| 在线播放国产精品三级| 香蕉国产在线看| 亚洲av电影在线进入| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久国产成人精品二区 | av有码第一页| 999久久久精品免费观看国产| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 91老司机精品| 操美女的视频在线观看| 国产成人影院久久av| 美女高潮到喷水免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久久久久免费高清国产稀缺| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美三级三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜影院日韩av| 激情在线观看视频在线高清| 怎么达到女性高潮| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成+人综合+亚洲专区| av片东京热男人的天堂| 高清黄色对白视频在线免费看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产一区二区三区视频了| 国产精品野战在线观看 | 黄色女人牲交| 午夜影院日韩av| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 99精品在免费线老司机午夜| 十分钟在线观看高清视频www| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久9热在线精品视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av天堂久久9| 中文欧美无线码| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 午夜视频精品福利| 看黄色毛片网站| 9色porny在线观看| 日本三级黄在线观看| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产亚洲欧美精品永久| 久久这里只有精品19| av视频免费观看在线观看| 国产乱人伦免费视频| 视频区图区小说| 18美女黄网站色大片免费观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜91福利影院| 久久精品成人免费网站| av有码第一页| 国产av一区二区精品久久| 97碰自拍视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产1区2区3区精品| bbb黄色大片| 啦啦啦 在线观看视频| 一二三四在线观看免费中文在| 成人影院久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品人妻在线不人妻| 妹子高潮喷水视频| 麻豆一二三区av精品| 欧美中文日本在线观看视频| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩乱码在线| 亚洲av成人av| 波多野结衣高清无吗| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲avbb在线观看| www.www免费av| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲全国av大片| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| xxx96com| e午夜精品久久久久久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产高清激情床上av| 神马国产精品三级电影在线观看 | 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av熟女| 久久香蕉国产精品| 国产三级在线视频| 又紧又爽又黄一区二区| 日本wwww免费看| 一级,二级,三级黄色视频| 天天添夜夜摸| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产av在哪里看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精品在线美女| 又黄又粗又硬又大视频| 狂野欧美激情性xxxx| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲少妇的诱惑av| 女性被躁到高潮视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| av网站在线播放免费| 99久久综合精品五月天人人| 香蕉国产在线看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| a级毛片在线看网站| 欧美激情高清一区二区三区| 天天添夜夜摸| 日韩视频一区二区在线观看| 国产免费现黄频在线看| 日韩欧美国产一区二区入口| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人成视频在线观看免费观看| av在线天堂中文字幕 | 人妻久久中文字幕网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝袜美腿诱惑在线| 国产深夜福利视频在线观看| 手机成人av网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 首页视频小说图片口味搜索| 99在线视频只有这里精品首页| 91国产中文字幕| 国产成人影院久久av| 国产成人影院久久av| 一区二区三区精品91| 国产精品 国内视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产有黄有色有爽视频| 成人免费观看视频高清| 精品一区二区三卡| 午夜视频精品福利| 一级a爱视频在线免费观看| 免费在线观看日本一区| 人妻久久中文字幕网| 99久久国产精品久久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 级片在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 99久久国产精品久久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 黑人猛操日本美女一级片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美成人免费av一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| www.熟女人妻精品国产| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩国内少妇激情av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄片播放在线免费| 成人亚洲精品av一区二区 | av片东京热男人的天堂| 日韩有码中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费在线观看影片大全网站| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看免费视频网站a站| 乱人伦中国视频| 亚洲国产精品999在线| 国产乱人伦免费视频| 黄色成人免费大全| 欧美最黄视频在线播放免费 | 99在线视频只有这里精品首页| 久久久精品欧美日韩精品| 日本a在线网址| 国产精品国产av在线观看| 丝袜在线中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜91福利影院| 精品高清国产在线一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久 成人 亚洲| 美国免费a级毛片| 欧美中文综合在线视频| 久久影院123| 国产色视频综合| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人手机av| 成人国语在线视频| 成人影院久久| 脱女人内裤的视频| 精品久久久精品久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 亚洲免费av在线视频| cao死你这个sao货| 国产精品九九99| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 搡老岳熟女国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 97碰自拍视频| 欧美日韩黄片免| 精品电影一区二区在线| 男人舔女人的私密视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男女午夜视频在线观看| 国产av在哪里看| 新久久久久国产一级毛片| av中文乱码字幕在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜免费成人在线视频| 黄色女人牲交| 久久精品影院6| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜精品在线福利| 国产精品av久久久久免费| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美黑人精品巨大| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲黑人精品在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久热爱精品视频在线9| 丝袜在线中文字幕| 91成人精品电影| 午夜免费观看网址| 视频区欧美日本亚洲| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 免费观看人在逋| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲精品一二三| 成人免费观看视频高清| 午夜福利在线免费观看网站| 在线观看免费视频网站a站| 欧美激情极品国产一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 国产黄色免费在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 人妻久久中文字幕网| 窝窝影院91人妻| 不卡av一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| ponron亚洲| 男女床上黄色一级片免费看| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美激情 高清一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费观看人在逋| 男女下面插进去视频免费观看| 99riav亚洲国产免费| 香蕉国产在线看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲免费av在线视频| av天堂久久9| 精品福利观看| 亚洲第一av免费看| 视频区欧美日本亚洲| 欧美激情高清一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 男人操女人黄网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲avbb在线观看| 久久人妻av系列| 咕卡用的链子| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美乱色亚洲激情| 黄色 视频免费看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线视频色国产色| 日本黄色日本黄色录像| 在线看a的网站| 欧美乱妇无乱码| tocl精华| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄片播放在线免费| 精品国产国语对白av| 激情在线观看视频在线高清| 国产亚洲av高清不卡| 午夜精品国产一区二区电影| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产成人精品在线电影| 又大又爽又粗| 久久这里只有精品19| 夫妻午夜视频| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品福利观看| 波多野结衣高清无吗| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99热只有精品国产| 日本 av在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| videosex国产| 电影成人av| 免费在线观看黄色视频的| 久久久久精品国产欧美久久久| 丁香六月欧美| 亚洲伊人色综图| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 热re99久久国产66热| 欧美成人午夜精品| 两个人免费观看高清视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 老司机午夜十八禁免费视频| 中文字幕高清在线视频| 国产野战对白在线观看| 国产成人精品无人区| 狂野欧美激情性xxxx| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩人妻精品一区2区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 国产成人欧美| 久久久精品欧美日韩精品| 精品欧美一区二区三区在线| 九色亚洲精品在线播放| 久久中文看片网| 视频区图区小说| 咕卡用的链子| 日本欧美视频一区| 亚洲黑人精品在线| 中文字幕最新亚洲高清| ponron亚洲| 亚洲自拍偷在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久性视频一级片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产熟女xx| 三上悠亚av全集在线观看| 两个人免费观看高清视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜老司机福利片| 久久午夜综合久久蜜桃| 激情在线观看视频在线高清| 无遮挡黄片免费观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人国语在线视频| 国产亚洲精品一区二区www| 成人三级黄色视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久人人人人人| 久久精品人人爽人人爽视色| 性欧美人与动物交配| 成年版毛片免费区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 丰满的人妻完整版| 成年人黄色毛片网站| 丝袜美足系列| 美女午夜性视频免费| 麻豆av在线久日| 国产高清videossex| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品国产美女av久久久久小说| 嫁个100分男人电影在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99热只有精品国产| tocl精华| 久久影院123| 午夜精品国产一区二区电影| 极品教师在线免费播放| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲中文字幕日韩| 啦啦啦 在线观看视频| 女人精品久久久久毛片| 亚洲色图av天堂| 久久精品国产清高在天天线| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久人人精品亚洲av| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看| 18禁观看日本| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一级黄色大片毛片| 久久香蕉国产精品| 大码成人一级视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 中文字幕人妻丝袜制服| 多毛熟女@视频| 91字幕亚洲| 日本a在线网址| 脱女人内裤的视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线观看66精品国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| √禁漫天堂资源中文www| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丝袜美足系列| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 不卡一级毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 不卡av一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 欧美乱妇无乱码| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜免费观看网址| 久久九九热精品免费| 国产免费男女视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一级作爱视频免费观看| 国产精品野战在线观看 | 99久久国产精品久久久| 午夜91福利影院| 国产又爽黄色视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99国产综合亚洲精品| 成人三级做爰电影| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜亚洲福利在线播放| 人人澡人人妻人| 国产xxxxx性猛交| 久久久国产成人免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲在线自拍视频| 日本欧美视频一区| 99热国产这里只有精品6| 女同久久另类99精品国产91| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产成人影院久久av| 搡老熟女国产l中国老女人| 1024香蕉在线观看| 精品久久久久久成人av| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 18禁美女被吸乳视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久人人人人人| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 自线自在国产av| 国产精品久久视频播放| 亚洲欧美一区二区三区久久| 免费在线观看完整版高清| 精品欧美一区二区三区在线| 成人av一区二区三区在线看| 人成视频在线观看免费观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 色在线成人网| 麻豆国产av国片精品| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利免费观看在线| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品一区av在线观看| tocl精华| 国产精品1区2区在线观看.| 成在线人永久免费视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品一区二区三卡| 精品无人区乱码1区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲国产欧美网| 天堂动漫精品| 国产高清国产精品国产三级| 精品久久久久久,| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 在线国产一区二区在线| 91精品三级在线观看| 高清在线国产一区| avwww免费| 国产亚洲欧美98| 久久婷婷成人综合色麻豆| 最近最新免费中文字幕在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品二区激情视频| 成人亚洲精品av一区二区 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 正在播放国产对白刺激| 男女午夜视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 曰老女人黄片| 中文字幕人妻丝袜制服| 一级毛片高清免费大全| 老汉色av国产亚洲站长工具| 丰满迷人的少妇在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品综合久久久久久久免费 | 乱人伦中国视频| 操出白浆在线播放| 国产99白浆流出| 一区二区三区精品91| 久热爱精品视频在线9| 免费观看人在逋| 国产精品野战在线观看 | 国产97色在线日韩免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 丝袜人妻中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 成年人免费黄色播放视频| 欧美久久黑人一区二区| 精品一区二区三卡| 免费在线观看亚洲国产| 波多野结衣高清无吗| 久久精品亚洲av国产电影网| www日本在线高清视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 天天影视国产精品| 免费在线观看亚洲国产| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美乱妇无乱码| 午夜两性在线视频| 最近最新免费中文字幕在线| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产伦一二天堂av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品乱码久久久久久99久播| 正在播放国产对白刺激| 在线永久观看黄色视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一进一出好大好爽视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品久久久久久久毛片微露脸| 热re99久久国产66热| 亚洲精品一二三| 中文字幕色久视频| 在线视频色国产色| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲国产看品久久| √禁漫天堂资源中文www| 两个人免费观看高清视频| 亚洲成国产人片在线观看| 国产在线观看jvid|