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    副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代1 000代的穩(wěn)定性研究

    2022-10-16 11:55:52劉福東桑躍洪維鍊趙雯張紅星
    中國奶牛 2022年9期
    關(guān)鍵詞:傳代干酪益生菌

    劉福東,桑躍,洪維鍊,趙雯,張紅星

    (1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),蘭州市 730070;3.內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司,呼和浩特 010110;4.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司,呼和浩特 010110)

    益生菌(Probiotics)是指通過攝入一定的數(shù)量,對宿主的身體健康有益的活的微生物。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、抗氧化、降血糖、降血脂、改善骨骼健康等多種益生作用[1~4]。

    目前,益生菌已廣泛應(yīng)用于食品等各個(gè)領(lǐng)域,對其穩(wěn)定性的研究也越來越受到關(guān)注,焦點(diǎn)主要集中在以下幾個(gè)方面:①益生菌添加到產(chǎn)品中其存活的穩(wěn)定性;②益生菌的生理學(xué)特征及穩(wěn)定性;③益生菌遺傳和表達(dá)的穩(wěn)定性。高穩(wěn)定性益生菌能夠更好地發(fā)揮其功效,為益生菌的加工生產(chǎn)以及菌株安全性提供保障[5]。

    副干酪乳桿菌ET-22分離自健康人體腸道,具有免疫調(diào)節(jié)[6]、緩解腸道炎癥和便秘[7,8]、促進(jìn)骨骼健康[9]等多種益生功能,目前已在發(fā)酵乳制品、益生菌制劑及保健品等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了應(yīng)用。為研究ET-22菌株的傳代穩(wěn)定性,本文從細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力及全基因組變異情況6個(gè)方面進(jìn)行了考察,對ET-22在連續(xù)傳代過程中的表型特征和遺傳信息穩(wěn)定性進(jìn)行了研究分析,以期為ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供一定的理論參考和指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株

    副干酪乳桿菌ET-22由內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供,保藏于中國普通微生物菌種保藏中心,保藏編號(hào)為CGMCC No.15077。

    1.1.2 試劑與儀器

    試劑:MRS培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;脫脂乳粉,恒天然合作社集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、瓊脂粉等常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

    儀器:潔凈工作臺(tái)(DJ-CJ-2ND1),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;生化培養(yǎng)箱(SPX-300),寧波樂電儀器制造有限公司產(chǎn)品;智能高速冷凍離心機(jī)(3H16RI),湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品;pH計(jì)(FE28),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品;超純水系統(tǒng)(SMART-N),上??道追治鰞x器有限公司產(chǎn)品;紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2808),尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;全自動(dòng)高壓滅菌器(LDZX-75L),上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(CX31),日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;場發(fā)射掃描電鏡(SU8020),日本日立公司產(chǎn)品。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌株的連續(xù)傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)代數(shù)計(jì)算[10]

    將0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行長期連續(xù)傳代培養(yǎng)至1 000代。以12h為1個(gè)傳代周期,按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量連續(xù)傳代培養(yǎng)。副干酪乳桿菌ET-22的一個(gè)單細(xì)胞經(jīng) n次分裂增殖后細(xì)菌數(shù)為2n個(gè)。在每個(gè)傳代周期(12h)內(nèi),菌體近似幾何級(jí)數(shù)(2n)增殖。通過測定菌株生長曲線可知,當(dāng)接種量為2%時(shí),菌數(shù)約增長50倍,則每個(gè)周期內(nèi)的生長代數(shù)(即細(xì)菌進(jìn)行分裂的次數(shù))為log250≈5.64 代。

    1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,對菌株進(jìn)行一次光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察。

    光學(xué)顯微鏡觀察:培養(yǎng)周期末將培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,然后革蘭氏染色,100倍油鏡觀察細(xì)胞形態(tài),拍照并記錄。

    掃描電鏡觀察:培養(yǎng)周期末將菌液離心收集菌體,使用PBS緩沖液重懸離心2~3次,2.5%戊二醛固定菌體,臨界點(diǎn)干燥脫水,掃描電鏡觀察細(xì)胞完整度和細(xì)胞表面褶皺程度,拍照并記錄。

    1.2.3 菌落形態(tài)觀察

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,即將培養(yǎng)液按10倍稀釋法稀釋到合適梯度,涂布于MRS固體培養(yǎng)基,37℃倒置培養(yǎng)48h,觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等特征,拍照并記錄。

    1.2.4 活菌數(shù)檢測

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定發(fā)酵活菌數(shù)一次,檢測3個(gè)平行。將培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇適當(dāng)?shù)?~3個(gè)梯度進(jìn)行傾注平板,37℃倒置培養(yǎng)48h,選取菌落總數(shù)在30~300范圍內(nèi)平板作為活菌計(jì)數(shù)的指標(biāo)。

    1.2.5 濁度檢測

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定一次培養(yǎng)液濁度,檢測3個(gè)平行。以未接菌的MRS培養(yǎng)基作為空白對照,使用紫外分光光度計(jì)檢測培養(yǎng)液在600nm處的吸光度。

    1.2.6 菌株發(fā)酵活力的測定[11]

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,測定一次菌體發(fā)酵活力,檢測3個(gè)平行。菌體發(fā)酵活力可以通過菌株發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生酸的量來測定,將菌體以1×107CFU/mL濃度接種于10mL滅菌脫脂乳中,37℃恒溫培養(yǎng)24h,取出后立即放入冰浴,每樣加20mL蒸餾水稀釋,用0.1 mol/L NaOH滴定pH至8.50~8.55,維持30s穩(wěn)定,記錄消耗NaOH體積,計(jì)算樣品中的乳酸濃度,換算為活力單位。

    滅菌脫脂乳制作:10%脫脂乳粉,2%葡萄糖,121℃滅菌15min,急冷,4℃冰箱中存放備用。

    發(fā)酵活力:以每1000萬(107)個(gè)菌體細(xì)胞在以上條件下發(fā)酵1mL脫脂乳產(chǎn)生1μmol乳酸計(jì)為1個(gè)活力單位(U)。

    1.2.7 遺傳穩(wěn)定性測定

    菌株ET-22連續(xù)傳代過程中,每培養(yǎng)200代,提取菌體基因組DNA一次,進(jìn)行基因組重測序分析。0代菌體采用二代+三代的測序方式獲得基因組完成圖,200~1 000代菌體采用二代測序獲得基因組掃描圖,分別將200~1 000代基因組掃描圖與0代基因組完成圖進(jìn)行比對,分析菌株ET-22在連續(xù)傳代過程中遺傳信息的變化。副干酪乳桿菌ET-22基因組測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 傳代過程中菌株細(xì)胞形態(tài)觀察

    副干酪乳桿菌ET-22屬于乳桿菌屬中的干酪乳桿菌組群,是革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,長度0.9~3.1μm,單個(gè)、成對或成短鏈排列[12]。圖1為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的顯微鏡照片,照片中顯示ET-22在傳代過程中菌體細(xì)胞均為成對或成鏈桿狀排列,細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化。圖2為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的掃描電鏡照片,可以看出,細(xì)胞表面光滑、結(jié)構(gòu)完整,不同代數(shù)細(xì)胞之間無明顯差異。

    圖1 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程光學(xué)顯微鏡照片

    圖2 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程掃描電鏡照片

    2.2 菌株傳代過程中菌落形態(tài)觀察

    圖3為副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代期間的涂布平皿菌落形態(tài)照片。照片顯示,不同代數(shù)副干酪乳桿菌ET-22的菌落形態(tài)一致,呈圓形,直徑1~3mm,顏色為白色,表面光滑、隆起,邊緣整齊,符合副干酪乳桿菌菌落特征[12]。說明副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代1 000代過程中,菌落形態(tài)無明顯變化,穩(wěn)定性較好。

    圖3 副干酪乳桿菌ET-22傳代過程菌落形態(tài)照片

    2.3 生長周期末活菌數(shù)變化情況

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間,不同代數(shù)各菌株活菌數(shù)變化情況見表1。根據(jù)顯著性分析結(jié)果顯示,不同培養(yǎng)代數(shù)菌株活菌數(shù)無顯著性差異(P〉0.05),表明隨著傳代次數(shù)的增加,沒有改變菌株的生長特性。

    表1 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間的活菌數(shù)變化情況

    圖4顯示副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代培養(yǎng)1 000代期間活菌數(shù)的變化趨勢。圖中顯示,不同代數(shù)各菌株的活菌數(shù)隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈小幅度波動(dòng)性變化,總數(shù)基本維持不變。

    圖4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間活菌數(shù)變化趨勢

    2.4 生長周期末濁度變化情況

    菌株發(fā)酵液的濁度變化反映總生物量的變化情況。在連續(xù)培養(yǎng)1 000代過程中,副干酪乳桿菌ET-22的OD600值變化情況見表2。表中顯示,副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中OD600值無顯著性變化(P〉0.05)。

    表2 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化情況

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代期間的OD600值變化趨勢如圖5所示。圖中顯示,連續(xù)傳代過程中,OD600值隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化,幅度較小,說明在本試驗(yàn)條件下,連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌體發(fā)酵液的總生物量沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

    圖5 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間OD600值變化

    2.5 菌株發(fā)酵活力

    菌株的發(fā)酵活力是評價(jià)其發(fā)酵性能的重要指標(biāo),其穩(wěn)定性是開發(fā)和研制直投式發(fā)酵劑的必備條件[13]。菌株發(fā)酵活力很容易受到外界不利條件的影響,導(dǎo)致其生物活性降低,從而影響發(fā)酵劑的穩(wěn)定性和保質(zhì)期[14]。定期檢測菌株在傳代過程中的產(chǎn)酸活力變化,是菌種穩(wěn)定性研究的一項(xiàng)重要工作,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[11]。

    副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)培養(yǎng)1 000代期間,不同代數(shù)各菌株發(fā)酵活力變化情況見表3。從表中可知,副干酪乳桿菌ET-22在連續(xù)傳代過程中發(fā)酵活力無顯著性變化(P〉0.05)。副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢如圖6所示,可以看出連續(xù)傳代過程中,菌株發(fā)酵活力隨培養(yǎng)代數(shù)的增加呈波動(dòng)性變化,但幅度較小,說明連續(xù)傳代培養(yǎng)的菌株發(fā)酵活力沒有隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而發(fā)生改變。

    表3 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化情況

    圖6 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間發(fā)酵活力變化趨勢

    2.6 遺傳信息的穩(wěn)定性

    細(xì)菌基因組重測序,即從頭測序,是在不依賴任何參考序列的情況下對基因組進(jìn)行測序,并利用生物信息學(xué)手段從頭組裝得到基因組序列。根據(jù)最終基因組組裝的完整程度不同,分為完成圖測序和掃描圖測序。

    本研究對0代副干酪乳桿菌ET-22進(jìn)行了基因組完成圖測序,結(jié)果可知ET-22全基因組總長度3 078 179bp,編碼基因總數(shù)量為3 141個(gè),其中包含60個(gè)tRNA和15個(gè)rRNA編碼基因,在整個(gè)基因組水平上的平均GC含量為46.33%。

    經(jīng)對200~1 000代ET-22進(jìn)行掃描圖測序分析,并與0代完成圖進(jìn)行比較基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析(表4),發(fā)現(xiàn)ET-22在0~600代內(nèi)SNP、MNP、IMS、DEL、INV以及DUP位點(diǎn)均為0,800~1 000代內(nèi)僅出現(xiàn)最多4個(gè)SNP位點(diǎn)。

    表4 副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代期間基因組突變信息統(tǒng)計(jì)

    SNP分析是評價(jià)菌株遺傳信息差異的重要手段[15-16],相比較傳統(tǒng)的16SrRNA 基因[17]、pheS/atpD 功能基因[18]、平均核苷酸一致性(ANI)[19]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[20]等分析技術(shù),分析信息更全面,應(yīng)用范圍更廣。PIGHTLING等人認(rèn)為SNP差異小于21是判斷為同一菌株的標(biāo)準(zhǔn)[21],副干酪乳桿菌ET-22在傳代過程中SNP差異較小(SNP<5),符合同一菌株標(biāo)準(zhǔn),表明菌株在連續(xù)傳代1 000代期間遺傳信息維持穩(wěn)定。

    3 結(jié)論

    菌株生理和遺傳穩(wěn)定是其商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ),近年來國內(nèi)外學(xué)者對多種益生菌及發(fā)酵劑菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了大量研究。烏云等[11]考察了1株益生乳酸菌P-8在連續(xù)傳代1 000~2 000代期間的表型特征變化,表明P-8經(jīng)過長時(shí)間不間斷連續(xù)傳代其表型特征穩(wěn)定。劉天偉等[20]研究了乳酸菌發(fā)酵劑的遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果表明發(fā)酵劑在長時(shí)間儲(chǔ)藏和傳代培養(yǎng)過程中基因組信息以及蛋白表達(dá)無明顯變化,具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

    本文對副干酪乳桿菌ET-22連續(xù)傳代1 000代期間的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、活菌數(shù)、濁度、菌株發(fā)酵活力和全基因組變異系數(shù)的變化情況進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明ET-22表型特征和遺傳學(xué)信息在長期傳代過程中具有良好的穩(wěn)定性。本文結(jié)論可以為副干酪乳桿菌ET-22的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo),也可為其他益生菌株和發(fā)酵菌株的開發(fā)提供實(shí)踐參考。

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