膿毒癥大鼠腸黏膜Slit2/Robo4蛋白表達及其與血管生成的關(guān)系

陳盈泰 吳昊 張森 李文放 王慮

膿毒癥是臨床急危重癥患者的常見病死原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的病理生理進程中，胃腸道發(fā)揮著重要作用。在嚴重感染情況下，致病因素造成腸黏膜屏障損害，可以使腸道微生物和內(nèi)毒素遷移到腸系膜淋巴結(jié)、血液以及某些腸外臟器，發(fā)生腸源性膿毒癥[2]。腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持主要依賴腸黏膜微循環(huán)及微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能。血管結(jié)構(gòu)的維持有賴于血管內(nèi)皮細胞，起到分隔組織和血液的作用，防止血液里的蛋白和細胞透入血管壁[3]。血管內(nèi)皮細胞的存活和增殖有賴于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），是開啟和形成新生血管過程中的重要分子。神經(jīng)遷移因子Slit 及其受體Robo 蛋白屬于分泌蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)，亞型Slit2 蛋白有促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移及體外血管生成的作用，Robo4 具有血管表達特異性，在血管新生活躍區(qū)域附近的血管內(nèi)皮細胞上高表達，因此Slit2/Robo4 信號在血管新生及內(nèi)皮細胞遷移過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，slit2/Robo4可以抑制血管內(nèi)皮細胞遷移、成管，增加內(nèi)皮細胞完整性，增強血管穩(wěn)定性，減少血管通透性，從而使腸黏膜屏障得到保護[4]。本研究通過Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管內(nèi)皮細胞的表達及其與血管內(nèi)皮生長因子的關(guān)系，探討其維護腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞功能和保護腸黏膜屏障的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級成年健康雄性SD 大鼠16 只，體質(zhì)量230～250 g，由海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供（動物許可證號：Sc2k 滬2020-016）。隨機分為假手術(shù)組（n=8）、膿毒癥組（n=8），膿毒癥組模型制備采用盲腸末端結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法。制模前大鼠先予12 h 的禁食，不禁水。腹腔麻醉使用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）。大鼠予放置仰臥位，在腹部手術(shù)部位備皮。等麻醉藥物起效后，取下腹部正中切口，切開約1 cm，逐層分離直至進入腹腔，整個手術(shù)過程嚴格遵循無菌原則。找到并確認盲腸后，細致游離盲腸腸系膜，使用鑷子將腸內(nèi)容物推向盲腸遠端，使用手術(shù)絲線游離盲腸總長度的50%左右，隨后予以結(jié)扎。在已結(jié)扎的盲腸的游離端用針頭對穿一次，同時擠出少量腸內(nèi)容物。假手術(shù)組不進行盲腸結(jié)腸及穿孔操作，余操作方法同膿毒癥組。24 h 后處死大鼠，用4%多聚甲醛固定實驗用回腸末端組織約5 cm。

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 Slit2/Robo4、VEGF mRNA表達量檢測 采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法，首先進行DEPC水（DEPC處理水，基爾頓生物R1600）配置：在1 000 mL的ddH2O中加入1 mL DEPC原液，磁力攪拌器攪拌過夜。高壓滅菌備用。隨后進行總RNA提取，將大鼠腸組織放入1 mL的Trizol勻漿管中勻漿（電動勻漿機FLUKO PRO200）20 s，隨后溫育5 min，離心10 min，靜止后吸取上清液，在上清液中加入600 μL異丙醇（國藥集團，貨號：80109218）混合均勻，室溫靜置15 min，4℃，12 000 r/min，離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%無水乙醇（國藥集團，貨號：100092680）漂洗沉淀、靜止和離心，重復一次后，棄去上清液后添加DEPC水40 μL，放入冰箱（-80℃）備用。接著進行第一條cDNA的合成，先去除總RNA中的DNA，隨后進行逆轉(zhuǎn)錄（試劑盒購自Fermentas，貨號：#K1622）。最后將制備好的cDNA進行PCR擴增（試劑盒購自Thermo，貨號：#K0223）。以Primer F 5' CTTGTGCTGATGGGTTTG3'；Primer R 5'AGTTCGCCTGTGTATTCC 3'作為上下引物擴增Slit2 mRNA，擴增大小為142 bps；以Primer F 5' GAGGTCGGGAACTTACTGTG3'；Primer R 5' GGAAGGAGCCATCAGAAGAG 3'為上下引物擴增Robo4 mRNA，擴增大小為148 bps；以Primer F 5' AGACCCTGGTGGACATCTTC3'；Primer R 5' TGTGCTGGCTTTGGTGAG 3'為上下引物擴增VEGF mRNA，擴增大小為183 bps。以Primer F 5' GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC3'；Primer R 5' ATGAGCCCTTCCACGATGC 3'為上下引物擴增GAPDH，擴增大小為237 bps。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Software。

1.2.2 Slit2/Robo4 蛋白的表達 采用Western 印跡法，首先將大鼠腸組織放入裂解液中進行裂解，隨后勻漿離心（4℃，1 200 r/min，15 min），靜止后取上清，蛋白質(zhì)定量后保存于冰箱（-80℃）。細胞樣品用PBS 液洗滌兩次，離心取上清，蛋白質(zhì)定量后備用。其次進行蛋白定量（BCA 蛋白定量試劑盒Thermo，PICPI23223），吸光度在波長562 nm 處測定，采用橫坐標為吸光值，縱坐標為蛋白濃度（μg/μL）繪制標準曲線，然后測定樣品吸光值，計算出樣品實際濃度。隨后選取不同的凝膠濃度制備PAGE 膠。緊接著進行上樣及電泳、半干轉(zhuǎn)膜、膜上蛋白檢測。隨后進行膜的封閉，根據(jù)說明書Slit（abcam ab134166）1∶1 000、robot（Santa Cruz sc-166872）1∶500、GAPDH（CST#5174）1∶1 000稀釋抗體，制備一抗。隨后稀釋HRP（羊抗小鼠HRP 標記二抗：中山金橋ZB-2305；羊抗兔HRP 標記二抗：中山金橋ZB-2301）標記的二抗，與膜同時37℃孵育1 h。用TBST 洗滌3 次，完成抗體孵育。最后進行ECL 化學發(fā)光顯色（發(fā)光液：Millipore WBKLS0100），放入成像系統(tǒng)（Tanon Tanon-5200）進行掃描。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗，Slit2/Robo4 蛋白表達與VEGF 表達的相關(guān)性采用Pearson 秩相關(guān)檢驗，以α=0.05 作為檢驗水準，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Slit2 的表達量

通過PCR 及Western 實驗發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達，膿毒癥組蛋白表達量明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義[CT值：（25.51±0.33）vs.（2 4.4 3±0.2 5），t=-7.679，P＜0.001；mRNA：（0.020±0.004）vs.（0.040±0.008），t=6.168，P＜0.001；灰度值：（10 601.15±1 438.07）vs.（16 482.38±1 671.07），t=-5.830，P＜0.001]，見圖1～4。

2.2 Robo4 的表達量

PCR及Western實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Robo4蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達，在膿毒癥組蛋白表達量明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義[CT值：（25.80±0.62）vs.（2 4.5 3±0.2 9），t=-4.737，P＜0.001；mRNA：（0.016±0.004）vs.（0.037±0.006），t=8.330，P＜0.001；灰度值：（12 206.99±129.52）vs.（20 089.75±1 535.14），t=8.462，P＜0.001]，見圖1～4。

圖1 slit2、robo4 蛋白Western 表達

2.3 VEGF 的表達量

同樣采用PCR 的方法，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組均有表達，在膿毒癥組蛋白表達量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義[CT 值：（23.81±0.35）vs.（25.34±0.31），t=13.217，P＜0.001；mRNA：（0.064±0.018）vs.（0.021±0.003），t=-6.338，P＜0.001），見圖3～4。

圖2 slit2、robo4 蛋白灰度表達

圖3 slit2、robo4、VEGF 蛋白CT 值

圖4 slit2、robo4、VEGF 蛋白mRNA

2.4 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量的相關(guān)性

在PCR 實驗中Slit2 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關(guān)（CT 值：r=-0.744，P=0.001；mRNA 值：r=-0.688，P=0.003），Robo4 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關(guān)（CT 值：r=-0.674，P=0.004；mRNA 值：r=-0.836，P＜0.001），見表1。Slit2 蛋白表達量與Robo4 蛋白表達量呈正相關(guān)（CT 值：r=0.814，P＜0.001；mRNA 值：r=0.805，P＜0.001），見表2。

表1 Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量之間的相關(guān)性

表2 Slit2/Robo4 蛋白表達量之間的相關(guān)性

3 討論

膿毒癥的病理、生理學機制復雜，涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)控、凝血障礙和神經(jīng)/內(nèi)分泌系統(tǒng)等[5]。腸道作為全身重要的消化吸收器官，具有豐富的微生物群體，這也是機體從感染發(fā)展到膿毒癥重要因素。腸道微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的破壞是腸源性膿毒癥發(fā)生機制之一[6]。目前研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 具有抑制血管內(nèi)皮細胞遷移、成管，增加內(nèi)皮細胞完整性，增強血管穩(wěn)定性，降低血管通透性的作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 在膿毒癥模型大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞中存在表達，提示Slit2/Robo4蛋白可以保護膿毒癥模型大鼠腸黏膜屏障，避免腸源性膿毒癥的發(fā)生。

目前在膿毒癥治療新方法的研究中，London 等[8]研究發(fā)現(xiàn)Slit 蛋白對滲漏的血管具有超級黏膠樣作用，從而加強機體承受其自身免疫攻擊的能力。同樣在袁熙等[9]研究中提示Slit 蛋白與其受體Robo 結(jié)合可以穩(wěn)定血管系統(tǒng)，避免過度的炎癥反應(yīng)對正常組織的損傷。Weng 等[10]在輸血相關(guān)的急性肺損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 蛋白在肺微血管內(nèi)皮細胞上有表達，且表達量明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)，Slit2/Robo4 蛋白在膿毒癥組及假手術(shù)組腸道血管內(nèi)皮細胞上均有表達。結(jié)果顯示Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關(guān)，并且在膿毒癥組表達量明顯下降（P＜0.05），提示該蛋白參與了腸源性膿毒癥的病理、生理過程，其減少原因可能存在消耗性減少。Qin 等[11]在內(nèi)毒素導致的膿毒癥模型研究中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象與本研究結(jié)果相似，證實了本研究的結(jié)果和推測。

本研究結(jié)果顯示，VEGF 在兩組實驗大鼠中均有表達，且在膿毒癥組表達量明顯增加（P＜0.05）。因為VEGF 可促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，保持內(nèi)皮細胞的活性，提高血管通透性，在新生血管形成和開啟過程中有著重要作用。當膿毒癥發(fā)生時，血管內(nèi)皮功能遭受破壞，血管通透性增加，從而發(fā)生血管滲漏。因此在膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管組織中VEGF 蛋白表達量明顯增加，促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，進一步加重內(nèi)皮損傷，增加血管的通透性，這與本研究結(jié)果相吻合。

本研究結(jié)果還顯示，Slit2/Robo4 蛋白表達量與VEGF 蛋白表達量呈負相關(guān)（P＜0.05）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Slit2/Robo4 在體外能抑制VGEF、FGFs 誘導的內(nèi)皮細胞遷移，同時在體內(nèi)可以抑制血管的新生和滲透[12]，有研究表明[13]，增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血管膜中VEGF 和Robo4 共表達，Robo4 對于血管的生成起促進作用。本研究中，Robo4 蛋白表達量下降，VEGF 蛋白表達量增加，兩者之間呈負相關(guān)。同樣，目前有學者認為Slit2/Robo4 信號能對抗VEGF/VEGF 受體信號，血管新生及內(nèi)皮細胞遷移，減少血管通透性，保持血管內(nèi)平衡。因此從Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關(guān)、與VEGF 蛋白表達量呈負相關(guān)這一結(jié)果，可以推斷在膿毒癥模型大鼠腸黏膜上存在Slit2/Robo4 蛋白抑制VEGF 所產(chǎn)生的血管新生、內(nèi)皮遷移和血管通透性增加的作用，從而保護腸黏膜屏障功能，防止腸源性膿毒癥的發(fā)生。目前已有研究證實Slit2 能降低VEGF 誘導的血管通透性上調(diào)[14]，有研究發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白依賴Robo4 發(fā)揮功能，且Robo4 通過一種非導向機制，抑制促血管生成因子誘導的新生血管芽及內(nèi)皮通透性增加來維持成熟血管網(wǎng)的屏障功能[15]，從而佐證本研究的推斷。

在下一步的研究中，擬構(gòu)建膿毒癥Slit2 基因敲除動物模型和人重組Slit2 組動物模型，進一步探討Slit2/Robo4 蛋白能否通過抑制血管內(nèi)皮生長因子，減少因炎癥細胞因子所致的血管滲漏，保持血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性。同時，擬在膿毒癥動物模型上檢測多個時間點內(nèi)Slit2/Robo4 蛋白和VEGF 蛋白的表達水平，以動態(tài)觀察其變化趨勢，探索其在膿毒癥中的表達規(guī)律。

綜上所述，通過在膿毒癥模型大鼠中檢測腸黏膜血管組織中Slit2/Robo4 與VEGF 的蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型大鼠的腸黏膜血管組織中Slit2、Robo4 蛋白表達量明顯下降，VEGF 蛋白表達量明顯增加。同時Slit2/Robo4 蛋白表達量呈正相關(guān)，VEGF 蛋白表達量與Slit2/Robo4 蛋白表達量呈負相關(guān)。膿毒癥模型大鼠腸黏膜血管中Slit2/Robo4 與VEGF 蛋白表達量的變化，與腸黏膜屏障系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，這為探討腸黏膜屏障保護機制提供了研究方向。