干擾長鏈非編碼RNA MALAT1對結(jié)腸癌SW480細胞生長、侵襲和裸鼠成瘤的影響

裴正浩，王耿澤，夏西超，張虎，王鈞，郝陽

（1.南陽市中心醫(yī)院胃腸外科，河南 南陽 473000；2.平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 平頂山 467000）

結(jié)腸癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，盡管其臨床診療已經(jīng)取得了長足進展，但對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌仍缺乏有效的治療手段，患者一般預(yù)后較差[1-2]。最近研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）是長度約8 000核苷酸的lncRNA，MALAT1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中表達上調(diào)。在人類結(jié)腸癌中MALAT1表達升高，其高表達與結(jié)腸癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)[5]，但其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相關(guān)機制尚不完全清楚。因此本研究通過使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）敲低結(jié)腸癌SW480細胞的MALAT1基因表達，并觀察其對細胞增殖、侵襲等生物學(xué)特性以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響，旨在了解MALAT1基因在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及實驗動物結(jié)腸癌SW480細胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雄/雌BALB/c-nu品系裸鼠10只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），SPF級，體質(zhì)量15～20 g，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0009；本研究根據(jù)實驗動物管理與保護的有關(guān)規(guī)定飼養(yǎng)動物并進行實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器MALAT1-shRNA、shRNANC真核質(zhì)粒載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；miR-145 mimic、miR-145 inhibitor（美國Invitrogen公司）；Western blot檢測一抗（Abcam公司）；HRP標記的IgG二抗（美國Jackson公司）；PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（寶生物工程有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（賽默飛世爾科技公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；7500RTPCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染取SW480細胞接種于含10%（φ）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長匯合率達85%以上傳代培養(yǎng)。取生長良好的細胞用于轉(zhuǎn)染和后續(xù)試驗。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-369-3 pmimic、mimic-NC、pcDNA、pc-RAB10重組質(zhì)粒、mimic+pc-RAB10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549、H1299細胞，分別記為mimic組、mimic-NC組、pcDNA組、pc-RAB10組及pc-RAB10+mimic組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）分析使用Trizol試劑從收集的組織和細胞株提取總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參，按照試劑盒操作方法檢測目標mRNA表達水平，采用2-ΔΔCt法計算目標mRNA相對表達量。

1.2.3 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灢捎肨argetScan軟件預(yù)測MALAT1與miR-145的靶向關(guān)系；根據(jù)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測的可能結(jié)合位點體外合成該位點的DNA片段（MALAT1 wt）以及包含該位點突變體的DNA片段（MALAT1 mut），退火后克隆到雙熒光素酶啟動子載體Pgl3。將該質(zhì)粒和miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染SW480細胞，培養(yǎng)48 h后，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性變化。

1.2.4 Brdu法檢測細胞增殖于24孔板中置入蓋玻片，SW480細胞消化后以2×104個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L Brdu繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出細胞爬片以4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，然后以0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3次，3%BSA室溫封閉1 h后，PBS洗3次；滴加Brdu一抗4℃過夜后，采用預(yù)溫的PBS輕輕清洗細胞，然后加入3%BSA稀釋的二抗，室溫避光孵育1 h后PBS洗3次，加入1 μg/mL DAPI室溫避光染色20 min；中性樹膠封片，熒光顯微鏡下取5個視野，統(tǒng)計Brdu陽性細胞數(shù)。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲Matrigel基質(zhì)膠以無血清培養(yǎng)基稀釋（體積比1∶6）后，取100 μL至Transwell小室上室，37℃孵育至基質(zhì)膠為固態(tài)。待轉(zhuǎn)染后各組細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)消化細胞，無血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為1×105個/mL。取200 μL細胞懸液加入上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細胞，用結(jié)晶紫對侵襲至小室下層的細胞進行染色，每孔隨機選取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達收集的各組細胞以PBS沖洗后使用細胞裂解液冰上充分裂解提取總蛋白。BCA法定量蛋白樣品后，加入適量上樣緩沖液，取40 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，以GAPDH為內(nèi)參，分別加入JAK2，STAT3、p-STAT3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；最后加二抗室溫下孵育2 h，ECL法顯色，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 免疫熒光檢測Vimentin蛋白表達于24孔板中置入蓋玻片，SW480細胞消化后以2×104個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24～48 h后取出細胞爬片，參照“1.2.4”方法進行固定、染色，滴加抗體為Vimentin抗體。中性樹膠封片后，熒光顯微鏡下取5個視野，統(tǒng)計Vimentin陽性細胞數(shù)。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤實驗10只裸鼠分為Control組和shRNA-MALAT1組各5只，取對數(shù)生長期的SW480細胞，調(diào)整細胞密度1×106個/mL，對照組裸鼠于皮下注射未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW480細胞200 μL，shRNA-MALAT1組于皮下注射轉(zhuǎn)染shRNA-MALAT1的SW480細胞200 μL；每間隔5 d標尺測量腫瘤體積，30 d后處死裸鼠，剝離瘤體，稱量移植瘤體積并拍照。取10%（φ）甲醛溶液固定移植瘤組織，洗滌后進行常規(guī)的脫水、透明、包埋和4 mm連續(xù)切片。

1.2.9 免疫組織化學(xué)法檢測移植瘤組織中蛋白表達移植瘤組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后采用3%H2O2孵育5 min后，加入5%山羊血清孵育20 min，甩去多余液體，加入適當稀釋的Ki67、VEGF抗體4℃下孵育過夜，PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG二抗，37℃下孵育20 min，PBS沖洗后滴加SABC，37℃下孵育30 min。采用DAB顯色，控制顯色時間，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察染色結(jié)果。400倍鏡下每張切片隨機選取5個視野，利用Motic Images Advanced 3.2圖像采集系統(tǒng)分析每個視野陽性細胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 7作圖，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1與miR-145靶向關(guān)系

TargetScan分析miR-145與MALAT1的結(jié) 合位點見圖1（A）；轉(zhuǎn)染后，與Control組比較，shRNAMALAT1組MALAT1表達水平顯著下降（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-145 mimic和野生型MALAT1報告基因載體后，SW480細胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 MALAT1與miR-145靶向關(guān)系Figure 1 Targeted relationship between MALAT1 and miR-145

2.2 敲低MALAT1對SW480細胞增殖、侵襲的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組Brdu陽性細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），miR-145 inhibitor組Brdu陽性細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與miR-145 inhibitor組比較，shRNA-MALAT1+miR-145 inhibitor組Brdu陽 性 細胞數(shù)及侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 敲低MALAT1通過上調(diào)miR-145抑制SW480細胞增殖、侵襲Figure 2 Knockdown of MALAT1 inhibits the proliferation and invasion of SW480 cells by upregulating miR-145

2.3 敲低MALAT1對SW480細胞侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；miR-145 inhibitor組N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05）。與miR-145 inhibitor組比較，shRNA-MALAT1+miR-145 inhibitor組E-cadherin蛋白表達顯著增加（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 敲低MALAT1對SW480細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響Figure 3 Effect of MALAT1 knockdown on the expression of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in SW480 cells

圖4 敲低MALAT1對Vimentin蛋白表達的影響Figure 4 Effect of MALAT1 knockdown on the expression of Vimentin in SW480 cells

2.4 敲低MALAT1對SW480細胞JAK2/STAT3信號通路的影響

與Control組 比 較，shRNA-MALAT1組JAK2、p-STAT3/STAT3比值顯著降低（P＜0.05），提示敲低MALAT1表達抑制JAK2/STAT3信號通路激活。見圖5。

圖5 敲低MALAT1對SW480細胞JAK2/STAT3信號通路的影響Figure 5 Effect of MALAT1 knockdown on JAK2/STAT3 pathway in SW480 cells

2.5 敲低MALAT1對SW480細胞裸鼠成瘤能力的影響

與Control組比較，shRNA-MALAT1組成瘤體積顯著降低（P＜0.05）；qRT-PCR檢測顯示，與Control組比較，shRNA-MALAT1組移植瘤組織中MALAT1表達顯著降低，miR-145表達顯著增加（P＜0.05）；免疫組化染色顯示，shRNA-MALAT1組移植瘤組織中Ki67、VEGF蛋白表達較Control組顯著降低（P＜0.05），見圖6。

圖6 敲低MALAT1對SW480細胞裸鼠成瘤能力的影響Figure 6 Effect of MALAT1 knockdown on tumorigenicity of SW480 cells in nude mice

3 討論

lncRNA作為一類長度大于200 nt的非編碼RNA，其異常表達在多種癌癥的起始和進展中起重要作用，在諸多研究中顯示出其作為腫瘤調(diào)控因子和治療靶標的潛能。在急性單核細胞白血病中，MALAT1上調(diào)導(dǎo)致預(yù)后不良，影響細胞增殖和凋亡[6]；MALAT1上調(diào)導(dǎo)致非小細胞肺癌預(yù)后較差，可誘發(fā)腫瘤生長和遷移[7]；MALAT1在人類結(jié)腸癌中表達被上調(diào)，其高表達與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切密切相關(guān)[5]；此外，抑制MALAT1表達能抑制結(jié)腸癌進展[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默MALAT1顯著抑制了SW480細胞的生長和侵襲，與本實驗結(jié)果一致的是，之前的研究[9]亦表明，MALAT1的高表達通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

miRNA是一類短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，由18～25個核苷酸組成，能通過與目標RNA互補配對干擾其合成從而達到調(diào)控靶基因的目的[10-11]。本研究結(jié)果顯示，miR-145在結(jié)腸癌細胞中則顯示出與MALAT1相反的作用，與本研究結(jié)果一致的是，相關(guān)報道[12]顯示，在結(jié)直腸癌臨床樣本中發(fā)現(xiàn)了miR-145，并通過體外實驗證實miR-145通過靶向ETS相關(guān)基因削弱癌細胞的遷移和侵襲能力。通過靶向基因預(yù)測軟件和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾緈iR-145是MALAT1的結(jié)合靶點，結(jié)合以往研究推測MALAT1可能作為一種競爭性內(nèi)源RNA結(jié)合miR-145并抑制其作用，而在結(jié)腸癌進展中發(fā)揮重要作用。

向正常組織浸潤和侵襲是惡性腫瘤細胞的基本生物學(xué)特征，該過程包括腫瘤細胞的脫落、黏附、降解、移動等。隨著腫瘤微環(huán)境的惡化，腫瘤細胞首先脫離原發(fā)部位，侵入到ECM、基底膜和細胞間質(zhì)中[13-15]。筆者通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，敲低MALAT1的SW480細胞表現(xiàn)出的侵襲性明顯降低。在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）是重要的始動因素，在EMT過程中，負責(zé)上皮細胞黏附連接的蛋白如E-cadherin能被提供更大連接靈活性的蛋白如N-cadherin等取代，從而導(dǎo)致細胞分離和運動性增強，使得腫瘤細胞易于侵入血管，并穿過血管壁外滲形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶。在功能上，本研究發(fā)現(xiàn)體外敲低MALAT1能抑制SW480細胞的侵襲和EMT過程。miRNAs通過靶向其下游分子調(diào)控癌變，因此預(yù)測和確認miR-145的下游作用靶點對于揭示miR-145抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。JAK2是蛋白酪氨酸激酶JAK家族成員，在癌變過程中發(fā)揮著多種功能。已有研究[16]表明，JAK2在結(jié)直腸癌等多種腫瘤中通過調(diào)節(jié)STAT3的磷酸化發(fā)揮致癌基因的作用；JAK2/STAT3通路在結(jié)直腸癌細胞轉(zhuǎn)移和EMT中起關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示，MALAT1在SW480細胞中可能通過調(diào)控miR-145抑制JAK2/STAT3通路的激活從而調(diào)控其下游靶點的表達，包括E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，而此三者是人結(jié)腸癌細胞中EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。然而在進行靶基因預(yù)測時，本研究并未發(fā)現(xiàn)miR-145與JAK2存在潛在結(jié)合靶點，miR-145是否通過與JAK2/STAT3通路的上游因子靶向結(jié)合而調(diào)節(jié)該信號通路從而影響結(jié)腸癌細胞的EMT過程和侵襲轉(zhuǎn)移有待于進一步研究。

綜上所述，在結(jié)腸癌細胞中，MALAT1作為一種競爭性內(nèi)源RNA負向調(diào)節(jié)miR-145功能，敲低MALAT1可通過負調(diào)控miR-145功能從而抑制結(jié)直腸癌SW480細胞的增殖、侵襲及體內(nèi)成瘤能力。