RP-HPLC法測(cè)定胃得安膠囊中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚3種成分的含量

黃牧坤，王衛(wèi)東，李明杰

（三二〇一醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 漢中 723000）

胃得安膠囊具有和胃止痛、健脾消食等功效，常用于治療慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病。胃得安膠囊由白術(shù)、澤瀉、枳實(shí)、厚樸等25味藥材，采用粉碎、煎煮、制粒、干燥等工藝制備而成的中藥成方制劑[1-4]。25味藥材中，澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效[5-7]；枳實(shí)具有破氣消積、化痰散痞等功效[8-10]；厚樸具有燥濕消痰、下氣除滿等功效[11-13]。目前，隨著生活、工作壓力越來(lái)越大，缺乏鍛煉等，我國(guó)患有胃病的人數(shù)越來(lái)越多，“十人九胃”正在逐漸成為現(xiàn)實(shí)。胃得安膠囊現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3—B—3636—98，僅有性狀和檢查項(xiàng)目，沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)目。本研究參照文獻(xiàn)[14-19]，建立了RPHPLC法測(cè)定胃得安膠囊中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚3種成分的含量，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent infinity 1260型反向高效液相色譜儀，配置在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、全自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫科技公司）；梅特勒AE 200S型電子分析天平（萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Milli-Q advantage A10型純水器（美國(guó)密理博科技有限公司）；KH-700 TDB型超聲波儀（昆山禾超儀器有限公司）。

23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%，批號(hào)111846-202006）、辛弗林對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，批號(hào)110727-202110）、厚樸酚對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，批號(hào)110729-202015）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；胃得安膠囊（金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠，規(guī)格每粒裝0.275 g，批號(hào)20211211、20210708、20220114）；乙腈、甲醇（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）；其他試劑（分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Spherisorb ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯 度 洗 脫（0～4 min，5%A；4～7 min，5%～22%A；7～10 min，22%～62%A；10～16 min，62%～74%A；16～23 min，74%～81%A；23～28 min，81%A；28～28.5 min，5%A）；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；采用儀器波長(zhǎng)切換功能，分別設(shè)定3種成分的檢測(cè)波長(zhǎng)：23-乙酰澤瀉醇B（208 nm）、辛弗林（275 nm）、厚樸酚（294 nm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0 mL/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備稱取23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚對(duì)照品適量，準(zhǔn)確稱定，分別置3個(gè)棕色量瓶中，用75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成23-乙酰澤瀉醇B 196.6 μg/mL、辛弗林299.4 μg/mL和厚樸酚396.0 μg/mL的單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取“2.2.1”項(xiàng)下23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻。

2.2.3 供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1.0 g，準(zhǔn)確稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇約20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min（功率230 W，頻率70 kHz），放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備按胃得安膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方和制備方法，分別制備澤瀉、枳實(shí)和厚樸陰性樣品，同“2.2.3”項(xiàng)下方法制備澤瀉、枳實(shí)和厚樸陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測(cè)，采集譜圖，典型色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，在與對(duì)照品溶液譜圖中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚相應(yīng)的保留時(shí)間位置，供試品溶液譜圖中均有相對(duì)應(yīng)的吸收峰；在陰性樣品溶液中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚色譜峰對(duì)應(yīng)位置無(wú)干擾峰；3種待測(cè)物分離良好，理論塔板數(shù)均大于2 500。

圖1 對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液HPLC色譜圖Figure 1 HPLC spectrum of control,test and negative control solutions

2.3.2 線性關(guān)系考察取“2.2.1”項(xiàng)下23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別準(zhǔn)確移取0.01、0.05、0.1、0.5、1 mL，置5個(gè)10 mL棕色量瓶中，用75%甲醇定容，搖勻；按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行檢測(cè)，采集譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性擬合，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 Standard curve equation,correlation coefficient and linear range

2.3.3 精密度試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測(cè)得23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚峰面積RSD值分別為1.5%、1.4%和1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取胃得安膠囊（批號(hào)：20211211），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置0、3、6、9、12、18、24 h后分別取樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚峰面積RSD值分別為1.2%、1.8%和1.3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同批次胃得安膠囊（批號(hào)：20211211），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)譜圖中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚峰面積計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測(cè)得23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林、厚樸酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.141 2、0.921 5、1.507 5 mg/g，RSD值分別為1.6%、2.1%和1.8%，表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚含量的胃得安膠囊（批號(hào)：20211211），共取20粒，去除膠囊殼，內(nèi)容物研細(xì)，取約1.0 g，準(zhǔn)確稱定，置25 mL量瓶中，同法稱取6份，根據(jù)樣品中3種成分含量，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備加標(biāo)溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery test results

2.4 方法應(yīng)用

取胃得安膠囊（批號(hào)：20211211、20210708、20220114），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份供試品平行制備2份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL進(jìn)行檢測(cè)，采集譜圖，外標(biāo)法計(jì)算供試品中23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 胃得安膠囊中3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Determinations of 3 ingredients in Weidean capsules w/（mg·粒-1）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚對(duì)照品溶液在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚最大吸收波長(zhǎng)分別在208、275、294 nm，差異較大，為提高檢測(cè)效率，采用程序波長(zhǎng)切換技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在同一色譜條件下，在3種活性成分最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其指標(biāo)性成分的含量。

3.2 流動(dòng)相的選擇

中藥活性成分檢測(cè)常用的流動(dòng)相體系有甲醇和乙腈體系，其中甲醇紫外吸收最大波長(zhǎng)在210 nm附近，乙腈紫外吸收最大截止波長(zhǎng)在190 nm附近。本研究中，23-乙酰澤瀉醇B最大吸收波長(zhǎng)在208 nm左右，因此甲醇體系不適用。分別考察采用乙腈-水體系和乙腈-0.5%磷酸溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，3種成分的分離、檢測(cè)時(shí)間和基質(zhì)干擾情況，結(jié)果顯示選擇乙腈-水體系時(shí)，辛弗林色譜峰峰型較差，定量準(zhǔn)確性偏低；選擇乙腈-0.5%磷酸溶液時(shí)，3種成分分離良好，無(wú)基質(zhì)干擾，且分析時(shí)間較短。

3.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

胃得安膠囊系由25種藥材組成，藥材種類較多，基質(zhì)復(fù)雜，為提高檢測(cè)準(zhǔn)確度和縮短分析時(shí)間，有必要對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化。分別考察提取溶劑為甲醇、75%甲醇溶液和50%甲醇溶液時(shí)，對(duì)23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚3種成分提取的影響，再分別考察超聲功率（210、230、250 W）和提取時(shí)間（15、20、25 min）的影響，結(jié)果選擇75%甲醇溶液作為提取劑，超聲功率設(shè)置230 W，時(shí)間20 min為最佳提取條件。

采用高效液相色譜配備二極管陣列檢測(cè)器法定性、定量檢測(cè)的分析方法，測(cè)定胃得安膠囊中的23-乙酰澤瀉醇B、辛弗林和厚樸酚中的3種活性成分，對(duì)方法的線性、溶液穩(wěn)定性、重復(fù)性等進(jìn)行了系統(tǒng)考察，結(jié)果顯示方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以用于胃得安膠囊供試品的質(zhì)量控制，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)完善制定提供技術(shù)參考。