基于Keap-1/Nrf2信號通路探究異甘草酸鎂改善非酒精性脂肪性肝病大鼠糖脂代謝紊亂的作用機制

趙文明，趙飛，宋志玉，左興盛

（河南省人民醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 450000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是臨床常見的慢性肝臟疾病，以發(fā)病隱匿、病程發(fā)展緩慢為主要特征，可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌，并參與代謝綜合征、心腦血管疾病發(fā)病進程[1]。隨著生活方式及膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國NAFLD患病人數(shù)大幅度增加，患病率已超過20%，且趨向年輕化，其防治工作已成為我國公共衛(wèi)生事業(yè)的重大難題[2]。目前，對于NAFLD的臨床治療尚處于探索階段，多以維生素E、熊去氧膽酸抑制過氧化，但效果緩慢且尚未得到大量樣本驗證。異甘草酸鎂是中藥單體甘草酸的異構(gòu)體鎂鹽，作為一種保肝劑，常被用于治療慢性病毒性肝炎及化療、手術(shù)所致肝損傷[3]。然而，目前關于其對NAFLD的治療作用研究尚少，且缺乏對應的機制研究。本研究通過建立NAFLD大鼠模型，觀察異甘草酸鎂對NAFLD糖脂代謝的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠46只，SPF級，雄性，6周齡，體質(zhì)量（160±15）g，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0010。大鼠實驗前適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于SPF級動物房，倫理委員會批準號：HNSRMYY20210058。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

異甘草酸鎂注射液（規(guī)格：10 mL，50 mg，生產(chǎn)批號H20051942，正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司）；核因子E2相關因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）抑制劑ML385（批號：846557-71-9，美國Sigma公司）；空腹胰島素（fasting serum insulin,FINS，生產(chǎn)批號：FT-PD8326S，上海梵態(tài)生物科技有限公司）；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（hHDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lLDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（生產(chǎn)批號分別為SBJ-R0195、SBJ-R0142、SBJR0126、SBJ-R0128、SBJ-R0116、SBJ-R0806、SBJR0704、SBJ-R0154，南京森貝伽生物科技有限公司）；兔抗大鼠Nrf2、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）一抗（生產(chǎn)批號：ab62352、ab119403，美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的二抗（生產(chǎn)批號：A21010，武漢艾美捷科技有限公司）。

AU480全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；E100顯微鏡（德國Nikon公司）；ACCU-CHEK ACTIVE羅氏血糖儀（德國Roche Diagnostics GmbH公司）；1658001 Mini-PROTEAN小型蛋白垂直電泳槽、ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 模型的建立

大鼠適應性基礎飼料喂養(yǎng)1周后參照文獻[4]建立NAFLD模型，高脂高糖飼料喂養(yǎng)，分別于第4、6、8周末隨機數(shù)字法處死造模大鼠2只，HE染色觀察肝組織病理，若肝細胞腫脹明顯且細胞脂肪變性比例超過1/3，則判定建模成功。

1.4 分組與給藥

36只大鼠建立NAFLD模型，除去驗證大鼠，剩余30只成功建模，隨機數(shù)字法分為NAFLD組、異甘草酸鎂組、聯(lián)合組，每組10只；另取10只大鼠基礎飼料喂養(yǎng)，設為正常對照組。聯(lián)合組大鼠腹腔注射異甘草酸鎂注射液（100 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水）[5]，2 h后腹腔注射ML385（30 mg/kg溶于5 mL DMSO）[6]；異甘草酸鎂組大鼠腹腔注射異甘草酸鎂注射液（100 mg/kg），2 h后腹腔注射5 mL DMSO；正常對照組、NAFLD組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，2 h后腹腔注射5 mL DMSO，每日1次，干預4周。除正常對照組外，其余3組仍以高脂高糖飼料喂養(yǎng)。

1.5 組織取材

末次干預后次晨，稱取大鼠體質(zhì)量，稱重后腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg深度麻醉，抽取空腹腹主動脈血，一份低溫離心5 min（3 000 r/min，r=8 cm）取血清，用于檢測血脂及肝功能指標，另一份4℃冷藏保存用于血糖指標檢測，采血后脊椎脫臼處死大鼠，冰上開腹取其肝臟，稱取肝濕質(zhì)量，計算肝指數(shù)=（大鼠肝濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量）×100%；切取同位置少量右側(cè)肝組織，置于4%（φ）多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切4 μm厚度切片用于病理觀察；另取部分肝組織投入液氮中保存，用于免疫印跡實驗。

1.6 血糖檢測[7]

取大鼠空腹腹主動脈血液，血糖儀檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）；放射免疫法檢測FINS；計算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）=（FPG×FINS）/22.5。

1.7 血脂及肝功能檢測

取冷藏保存的腹主動脈血清，經(jīng)全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平，按照試劑盒說明書檢測。

1.8 血清氧化應激指標檢測

取冷藏保存的腹主動脈血清，分別以TBA法、WST-8法檢測血清MDA水平及SOD活性，根據(jù)試劑盒說明書要求操作進行，計算血清MDA濃度及SOD活性。

1.9 HE染色觀察肝組織病理變化

取肝組織切片，脫蠟至水，蒸餾水沖洗，經(jīng)蘇木精液染色5 min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸酒精分化，碳酸氫鈉溶液漂洗、伊紅液浸染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，置于顯微鏡下觀察肝組織病理改變并拍照記錄。

1.10 油紅O染色觀察肝組織脂質(zhì)沉積

4%（φ）多聚甲醛固定10 min后蒸餾水充分沖洗；60%（φ）異丙醇浸泡180 s；導入油紅O儲液60 mL、蒸餾水40 mL 30 min；60%異丙醇分色，蒸餾水充分沖洗；蘇木精對比染色120 s，蒸餾水充分沖洗；水性封片機固封，常溫陰干后顯微鏡下觀察。

1.11 免疫印跡法檢測肝組織Nrf2、Keap1蛋白表達量

取液氮保存的肝組織，剪碎后移至研磨器研磨，PBS勻漿，加入預冷RIPA裂解液，注入離心管，4℃離心15 min（10 000 r/min，r=12 cm）取上清，BCA法定量蛋白。取50 μg蛋白樣本，與5倍量上樣緩沖液混勻，水浴沸騰5 min，離心取上清，電泳分離后濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h，混合稀釋體積比（1∶500）兔抗大鼠Nrf2、Keap1一抗，4℃冷藏過夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，發(fā)光液發(fā)光，暗室顯色，成像分析儀掃描并分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，分析Nrf2、Keap1蛋白相對表達水平。

1.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件，計量資料以表示，多樣本資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本采用LSD-t比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量及肝指數(shù)比較

與正常對照組比較，NAFLD組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)均升高（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)均降低（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)均升高（P＜0.05）。見表1。

表1 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量及肝指數(shù)的影響Table 1 Effects of magnesium isoglycyrrhizate on body mass，liver wet weight and liver index in NAFLD rats(±s,n=10)

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05；與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組體質(zhì)量/g 389.17±12.49 502.65±21.62*426.43±19.44#466.09±20.42@肝濕質(zhì)量/g 11.46±1.37 21.48±1.65*14.56±1.77#17.02±1.60@肝指數(shù)/%2.73±0.30 4.15±0.46*3.30±0.38#3.76±0.40@

2.2 各組血糖指標比較

與正常對照組比較，NAFLD組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平升高（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平降低（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠大鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR水平的影響Table 2 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum FPG，F(xiàn)INS and HOMA-IR in NAFLD rats(±s,n=10)

表2 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清FPG、FINS、HOMA-IR水平的影響Table 2 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum FPG，F(xiàn)INS and HOMA-IR in NAFLD rats(±s,n=10)

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05；與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組c（FPG）/（mmol·L-1）5.41±0.52 7.22±1.29*6.91±0.55#6.98±0.95@ρ（FINS）/（μu·mL-1）93.78±10.64 141.15±12.07*105.83±15.77#126.66±14.29#@HOMA-IR 22.38±2.34 98.00±7.88*30.47±4.08#57.83±5.62#@

2.3 各組血脂指標比較

與正常對照組比較，NAFLD組大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C水平升高（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠TG、TC、LDL-C水平降低（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠大鼠TG、TC、LDL-C水平升高（P＜0.05）。NAFLD組、異甘草酸鎂組、聯(lián)合組HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平的影響Table 3 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum TG，TC，HDL-C and LDL-C in NAFLD rats(±s,n=10) c/（mmol·L-1）

表3 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平的影響Table 3 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum TG，TC，HDL-C and LDL-C in NAFLD rats(±s,n=10) c/（mmol·L-1）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05；與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組TG 0.26±0.03 1.79±0.25*0.42±0.04#1.04±0.09@TC 1.70±0.19 3.60±0.52*1.93±0.21#2.49±0.38@HDL-C 1.85±0.28 0.54±0.06 0.55±0.06 0.56±0.04 LDL-C 0.29±0.03 0.91±0.14*0.41±0.05#0.58±0.07@

2.4 各組肝功能指標比較

與正常對照組比較，NAFLD組大鼠AST、ALT水平升高（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠AST、ALT水平降低（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠大鼠AST、ALT水平升高（P＜0.05）。見表4。

表4 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清AST、ALT水平的影響Table 4 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels ofserum AST and ALT in NAFLD rats(±s,n=10)ρ/（u·L-1）

表4 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清AST、ALT水平的影響Table 4 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels ofserum AST and ALT in NAFLD rats(±s,n=10)ρ/（u·L-1）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。；

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組AST 136.87±14.35 182.41±18.09*142.66±14.95#165.35±19.14@ALT 45.81±6.15 89.43±12.07*51.43±5.74#67.08±8.70@

2.5 各組血清氧化應激指標比較

與正常對照組比較，NAFLD組大鼠血清MDA水平升高，SOD活性降低（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠血清MDA水平降低，SOD活性升高（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠血清MDA水平升高，SOD活性降低（P＜0.05）。見表5。

表5 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清MDA水平、SOD活性的影響Table 5 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum MDA level and SOD activity in NAFLD rats(±s,n=10)

表5 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠血清MDA水平、SOD活性的影響Table 5 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the levels of serum MDA level and SOD activity in NAFLD rats(±s,n=10)

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05；與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組0.75±0.09 3.59±0.48*1.15±0.13#1.98±0.14@46.88±3.55 15.47±1.44*36.36±5.22#26.45±2.85@c（MDA）/（nmol·mL-1）ρ（SOD）/（u·mL-1）

2.6 肝組織病理變化

HE染色顯示，正常對照組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)均正常，未見細胞脂肪變性；NAFLD組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴重，邊界不清，細胞體積增大且脂肪變性嚴重，可見大量脂肪空泡及炎癥細胞浸潤；異甘草酸鎂組、聯(lián)合組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)破壞不明顯，細胞體積趨于正常，脂肪變性程度減輕，脂肪空泡及炎癥細胞減少，異甘草酸鎂組較聯(lián)合組病理改善更佳。NAFLD組、異甘草酸鎂組、聯(lián)合組肝組織病理學變化評分分別為（3.05±0.41）分、（1.69±0.25）分、（2.21±0.39）分，與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組大鼠肝組織病理學變化評分降低（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組大鼠肝組織病理學變化評分升高（P＜0.05）。

油紅O染色顯示，正常對照組肝組織幾乎未觀察到脂滴聚集，NAFLD組可觀察到橘紅色脂滴呈現(xiàn)彌漫性分布及大泡性脂肪變，異甘草酸鎂組、聯(lián)合組橘紅色脂滴顯著減少，異甘草酸鎂組少于聯(lián)合組。見圖1、圖2。

2.7 肝組織Nrf2、Keap1蛋白表達量

與正常對照組比較，NAFLD組肝組織Nrf2蛋白表達量升高，Keap1蛋白表達量降低（P＜0.05）；與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組肝組織Nrf2蛋白表達量降低，Keap1蛋白表達量升高（P＜0.05）；與異甘草酸鎂組比較，聯(lián)合組肝組織Nrf2蛋白表達量升高，Keap1蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表6、圖3。

圖3 肝組織Nrf2、Keap1蛋白表達Figure 3 Expressions of Nrf2 and Keap1 proteins in liver tissue

表6 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠肝組織Nrf2、Keap1蛋白表達量的影響Table 6 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the expressions of Nrf2 and Keap1 proteins in liver tissue of NAFLD rats (±s,n=10)

表6 異甘草酸鎂對NAFLD大鼠肝組織Nrf2、Keap1蛋白表達量的影響Table 6 Effects of magnesium isoglycyrrhizinate on the expressions of Nrf2 and Keap1 proteins in liver tissue of NAFLD rats (±s,n=10)

與正常對照組比較：*P＜0.05；與NAFLD組比較：#P＜0.05；與異甘草酸鎂組比較：@P＜0.05。

組別正常對照組NAFLD組異甘草酸鎂組聯(lián)合組Nrf2 0.03±0.01 0.41±0.04*0.12±0.01#0.22±0.03@Keap1 0.91±0.09 0.10±0.01*0.43±0.05#0.28±0.03@

3 討論

NAFLD是以非酒精及外部因素導致肝細胞脂肪過度沉積為特征的臨床綜合征，起初表現(xiàn)為單純性脂肪肝，肝小葉內(nèi)肝細胞大泡性脂肪變性，后可擴大至75%以上肝細胞變性，后出現(xiàn)細胞炎癥，引發(fā)腺泡點灶狀壞死，蔓延至門管區(qū)造成周圍橋接纖維化，最終肝小葉原結(jié)構(gòu)嚴重破壞，出現(xiàn)廣泛性纖維化，從而導致肝硬化[8]。肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、慢性腎病及高血壓等是NAFLD的高危因素，其發(fā)病機制復雜，多認為是肝細胞脂質(zhì)積累、氧化應激損傷、過量炎癥反應、胰島素抵抗等因素相互關聯(lián)所致，其中胰島素抵抗及氧化應激被認為是其主要機制[9]。胰島素敏感性降低促使肝細胞攝入大量游離脂肪酸，脂肪過載變性引發(fā)低度炎癥反應，變性肝細胞線粒體發(fā)生脂質(zhì)過氧化，肝細胞膜被破壞，氧化產(chǎn)物聚集，進一步加劇氧化應激，加劇肝細胞胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)，促進炎癥反應及肝纖維化的發(fā)生[10]。因此，抑制過量氧化應激是治療NAFLD的關鍵。

中醫(yī)將NAFLD歸屬于“肝癖”、“積聚”、“肝脹”等癥范疇，病位在于肝、脾、腎，其主要病機為嗜食肥甘、脾失健運、腎失氣化、津液聚而生痰，濕熱中阻、蘊結(jié)于肝、脈絡壅滯，久病成瘀、瘀血痰濁相結(jié)、發(fā)為肝癖，故化痰祛瘀、補益肝脾是其治療之道[11]。中藥甘草為豆科植物甘草、脹果甘草及光果甘草干燥根與根莖，具有補脾、保肝、清熱的功效，異甘草酸鎂是以其為主要原料合成的第4代甘草酸制劑，具有良好的親脂性，可與肝細胞膜受體蛋白及固醇類激素結(jié)合，抑制膜脂質(zhì)過氧化，降低細胞膜通透性，從而改善肝功能[12-13]。Li等[14]研究認為，異甘草酸鎂可抑制肝臟HepaRG細胞脂質(zhì)過度積累，減輕氧化應激損傷，保護線粒體完整性，改善肝細胞代謝紊亂，發(fā)揮其降低肝脂毒性的功效，提示異甘草酸鎂對肝細胞脂肪變性具有改善作用，或可成為脂肪性肝病潛在治療藥物。本研究結(jié)果顯示，與NAFLD組比較，異甘草酸鎂組血清FPG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C、AST、ALT水平均降低，SOD活性升高，提示異甘草酸鎂可改善血糖、血脂代謝紊亂，抑制氧化應激，改善NAFLD大鼠肝功能。

Nrf2/ARE信號通路是機體重要的氧化應激調(diào)節(jié)通路，參與神經(jīng)、血管及多種器官組織病變過程，其中Nrf2是細胞抗氧化關鍵介導因子，Keap1是其抑制蛋白[15]。在穩(wěn)態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合形成復合體隔離于細胞質(zhì)中，參與構(gòu)成肌動蛋白架構(gòu)，Nrf2活性被抑制并被泛素化降解，在氧化應激狀態(tài)下，Nrf2自復合物中解離移至胞核，激活核內(nèi)ARE復合物啟動子，誘導下游相關還原酶轉(zhuǎn)錄，降低氧自由基濃度，從而發(fā)揮其抑制肝細胞氧化應激損傷的功效[16-17]。Saeedi等[18]認為，激活Nrf2/ARE通路可調(diào)節(jié)肝臟對氧化損傷易感性，從而治療由對乙酰氨基酚及乙醇誘發(fā)的急性肝損傷，提示Nrf2或可成為肝臟疾病的治療新靶點。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，NAFLD組肝組織Nrf2蛋白表達量升高，Keap1蛋白表達量降低，經(jīng)異甘草酸鎂干預后肝組織Nrf2蛋白表達量降低，Keap1蛋白表達量升高，且聯(lián)合應用Nrf2/ARE通路抑制劑ML385可減弱異甘草酸鎂對NAFLD的治療作用，提示Nrf2/ARE通路活性在NAFLD中有所降低，異甘草酸鎂能通過激活該通路治療NAFLD大鼠。

綜上所述，異甘草酸鎂可改善NAFLD大鼠糖脂代謝紊亂，抑制氧化應激并改善肝功能，其作用機制可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關。