不同射流霧化器對(duì)銀黃吸入溶液體外霧化特性評(píng)價(jià)的影響

李翠，溫遠(yuǎn)珍，曹暉，華杰，李婷，楊靜，許彥

[1.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司/國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心新型遞藥系統(tǒng)分中心/廣東省霧化吸入制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519000；3.浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000]

吸入液體制劑系指供霧化器用的液體制劑，即通過霧化器產(chǎn)生連續(xù)供吸入用氣溶膠的溶液、吸入混懸液、吸入用溶液（需稀釋后使用的濃溶液）和吸入用粉末（需溶解后使用的無菌藥物粉末）[1]。吸入液體制劑具有局部給藥，起效迅速、使用方便，避免肝臟首過效應(yīng)，減少全身給藥可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是治療哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺?。–OPD）等疾病較為有效的途徑，因此市場前景廣闊[2-3]。

銀黃注射液由金銀花、黃芩提取物組成，被廣泛應(yīng)用于上呼吸道感染、急慢性咽炎、急慢性扁桃體炎等外感性疾病的治療，國內(nèi)臨床上有將其霧化吸入用于治療呼吸系統(tǒng)疾病的報(bào)道，療效顯著[4]。目前，國內(nèi)尚無中藥霧化吸入溶液上市。盡管臨床上有不少中藥注射液采用霧化吸入給藥，治療呼吸道疾病效果良好的報(bào)道，但均為超說明書范圍使用，存在安全隱患。銀黃吸入溶液在已上市銀黃注射液的基礎(chǔ)上改良開發(fā)而成，含金銀花、黃芩提取物，目前處于臨床前研究階段。

吸入液體制劑的療效除與藥物自身理化性質(zhì)有關(guān)外，所使用霧化器的性能亦是重要的組成部分。目前，市售霧化器按照工作原理分為射流霧化器、超聲霧化器和振動(dòng)篩孔霧化器3類，其中射流霧化器是使用最廣泛的霧化器，主要有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：①可使藥液微粒直徑在5 μm以下，到達(dá)小氣道及肺泡，達(dá)到高效的吸入；②不產(chǎn)生高溫，無藥物應(yīng)用限制；③藥液量較少，最大藥液量一般為8 mL；④霧化時(shí)間較短[5-6]。

遞送速率、遞送總量和空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布是評(píng)價(jià)體外霧化特性的重要指標(biāo)。空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布是評(píng)估吸入制劑是否有效霧化的關(guān)鍵體外質(zhì)量控制項(xiàng)目，《中國藥典》2020年版使用新一代撞擊器（NGI）作為吸入溶液劑空氣動(dòng)力粒徑分布（aerodynamic particle size distribution,APSD）的測(cè)量儀器。目前，常用的空氣動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)參數(shù)微細(xì)粒子劑量（fine particle dose,FPD）、微細(xì)粒子分?jǐn)?shù)（fine particle fraction,FPF）、空氣動(dòng)力學(xué)質(zhì)量中值粒徑（mass median aero-dynamic diameter，MMAD）和幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差（geometric standard deviation,GSD）。遞送速率及遞送總量是評(píng)價(jià)藥物遞送效率的重要依據(jù)[7-8]。本研究采用呼吸模擬裝置模擬正常成人的呼吸模式，考察5種不同品牌、型號(hào)的射流霧化器對(duì)銀黃吸入溶液體外評(píng)價(jià)的影響，以期優(yōu)選出適合銀黃吸入溶液性能的最佳霧化器，為中藥霧化吸入給藥的體外評(píng)價(jià)提供借鑒。

1 儀器與試藥

1260 InfinityⅡ超高液相液相色譜儀（配備二極管陣列檢測(cè)器，Open-LAB工作站，美國安捷倫公司）；SQP型（十萬分之一）電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；BRS2100呼吸模擬器（英國科普利公司）；SB-1637新一代藥物撞擊器（NGI，英國科普利公司）；LCP-5真空泵（英國科普利公司）；TPK-2100流量控制器（英國科普利公司）；冷卻裝置（英國科普利公司）；DFM2000電子流量計(jì)（英國科普利公司）；Master-s15型純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）；BRS濾膜（英國科普利公司）；MOC濾膜（英國科普利公司）。

霧化器A、B、C、D、E分別是市場上常用的5種品牌或型號(hào)射流霧化器。

銀黃吸入溶液[批號(hào)：CP-201229-01，盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司]；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%，中國食品藥品檢定研究院）；水為去離子水，甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件Welch Ultimate?XB-C18為色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-磷酸（體積比50∶50∶0.2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為274 nm；進(jìn)樣量為10 μL。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中黃芩苷含量，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。色譜圖見圖1。

圖1 銀黃吸入溶液的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Yinhuang solution for inhalation

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備取黃芩苷對(duì)照品10.56 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備精密量取本品1 mL置10 mL量瓶中，加入50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密量取不同體積的黃芩苷對(duì)照品適量，加50%甲醇稀釋至刻度，并制成質(zhì)量濃度為12.26、24.52、49.04、98.08、201.5 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=33.762 6X-76.094 6（r=0.999 7），線性范圍為0.122 6～2.015 μg。

2.1.5 精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷峰面積的RSD＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批銀黃吸入溶液，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果黃芩苷含量的RSD＜2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批銀黃吸入溶液，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、16、24、36、48 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD＜2.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已知黃芩苷含量的銀黃吸入溶液，加入一定量的對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為98.66%，RSD為2.0%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 霧化特性測(cè)定洗滌溶液的考察

含量測(cè)定中使用50%甲醇作為供試品溶液制備的稀釋溶劑，由于甲醇毒性較大，采用甲醇溶液作為洗滌溶劑會(huì)對(duì)操作員的身體造成傷害，因此，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，稀釋溶劑分別為20%乙醇溶液與50%甲醇溶液，對(duì)比兩種溶液對(duì)黃芩苷含量測(cè)定的影響，結(jié)果20%乙醇溶液與50%甲醇溶液黃芩苷含量分別為4.703 mg/mL和4.796 mg/mL，兩者偏差＜2%，說明無明顯差異，選擇20%乙醇溶液作為洗滌溶液。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 微細(xì)粒子空氣動(dòng)力學(xué)特性的測(cè)定

參照2020年版《中國藥典》四部通則0951測(cè)定法[1]進(jìn)行檢測(cè)。預(yù)先使冷柜降至5℃，將NGI放置冷柜中90 min，開啟真空泵并調(diào)節(jié)流速至15 min/L。精密量取銀黃吸入溶液2 mL，置入霧化杯中，連接裝置，開啟霧化器霧化15 min，關(guān)閉霧化器和真空泵。分別用20%乙醇洗滌各部件，霧化器洗滌液置50 mL量瓶，人工喉、Stage1～2、Stage7和MOC洗滌液置5 mL量瓶，Stage3、Stage6洗滌液置10 mL量瓶，Stage4、Stage5洗滌液置20 mL量瓶，用20%乙醇稀釋至刻度，使用高效液相色譜法測(cè)定各部件洗滌液中黃芩苷含量。按上述方法選用不同霧化器進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)霧化器平行測(cè)定3次，將各部件洗滌液測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入到CopleyCitdas V3.10軟件計(jì)算，可得FPD、FPF、MMAD及GSD。測(cè)定裝置見圖2，測(cè)定結(jié)果見表1及圖3。

圖2 微細(xì)粒子空氣動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定裝置Figure 2 Device for measuring aerodynamic characteristics of fine particles

圖3 不同霧化器的微細(xì)粒子空氣動(dòng)力學(xué)特性氣泡圖Figure 3 Bubble chart of fine particle aerodynamic characteristics of different nebulizers

表1 不同霧化器的空氣動(dòng)力學(xué)分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

表1 不同霧化器的空氣動(dòng)力學(xué)分析Table 1 Aerodynamic analysis of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列數(shù)據(jù)比較，不同字母間表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P＜0.05。

霧化器霧化器A霧化器B霧化器C霧化器D霧化器E FPD/mg 4.212±0.8a 2.802±6.0b 2.664±3.9b 2.682±6.9b 1.755±9.4c FPF/%69.753±2.3a 50.995±2.9b 51.896±2.7b 50.062±4.0c 46.882±3.3d MMAD/μm 3.534±2.9a 4.776±3.9b 4.676±2.6b 4.832±3.6c 5.096±3.1d GSD 1.896±0.3a 2.148±1.7b 2.136±0.5b 2.150±1.5b 2.068±0.8b

根據(jù)結(jié)果可知，霧化器A和霧化器E與其他型號(hào)霧化器差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，氣泡圖顯示為離散點(diǎn)。霧化器B、霧化器C和霧化器D霧化器之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，氣泡圖顯示為聚集點(diǎn)。綜合空氣動(dòng)力學(xué)結(jié)果最佳的是霧化器A，測(cè)得MMAD及GSD值最小，F(xiàn)PD及FPF值最大，說明MMAD最小，粒徑分布最窄，小于5 μm的氣溶膠藥物的質(zhì)量及占比最大?？諝鈩?dòng)力學(xué)結(jié)果最差的是霧化器E。霧化器B、霧化器C和霧化器D 3個(gè)型號(hào)霧化器結(jié)果介于兩者中間。

2.5 遞送速率和遞送總量的測(cè)定

參照2020年版《中國藥典》四部通則0111的方法[1]，組裝過濾器和呼吸模擬器。將2 mL本品注入霧化杯中，由適配器連接霧化器與過濾裝置，確保所有連接處密封。調(diào)節(jié)呼吸模擬器按成人模式運(yùn)行（潮氣量500 mL，吸呼比1∶1，頻率：15 r/min，波形：正弦曲線）。同時(shí)開啟霧化器和呼吸模擬器，60 s時(shí)關(guān)閉霧化器，取出吸入濾膜1，用20%乙醇溶液沖洗稀釋至10 mL。更換新的吸入濾膜2，同時(shí)開啟霧化器和呼吸模擬器，直至霧化結(jié)束（霧化15 min），關(guān)閉霧化器，用20%乙醇溶液沖洗霧化杯、吸入濾膜2及呼出濾膜，稀釋至50 mL。采用高效液相色譜法測(cè)定上述洗滌液中黃芩苷含量，遞送速率為吸入濾膜1中黃芩苷含量與霧化時(shí)間的比值，遞送總量為吸入濾膜1和2中黃芩苷含量之和，呼出總量為呼出濾膜中黃芩苷含量，藥杯殘留為霧化杯中黃芩苷含量，回收率為測(cè)得總量（各部件中黃芩苷含量總和）與給藥量的百分比。按上述方法選用不同霧化器進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)霧化器平行測(cè)定3次。測(cè)定裝置見圖4，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同霧化器的遞送數(shù)據(jù)Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

表2 不同霧化器的遞送數(shù)據(jù)Table 2 Delivery data of different nebulizers（±s,n=3）

注：同一列數(shù)據(jù)比較，不同字母間表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即P＜0.05。

霧化器霧化器A霧化器B霧化器C霧化器D霧化器E遞送速率/（μg·s-1）7.258±3.3a 14.334±2.1b 14.766±10.7b 7.526±8.2a 7.955±9.6a遞送總量/mg 2.806±5.2a 3.580±3.2b 2.649±7.2a 2.826±7.0a 1.276±9.9c呼出總量/mg 0.526±16.6a 1.262±7.3b 0.434±11.4a 0.509±12.1a 0.097±8.7c藥杯殘留/mg 6.219±4.4a 5.592±2.4b 5.209±0.42b 5.000±14.0b 6.090±3.2a回收率/%95.50±0.9a 104.39±0.7b 82.93±3.1c 83.603±4.7c 74.69±1.5d

圖4 遞送速率和遞送總量測(cè)定裝置圖Figure 4 Device diagram for measuring delivery rate and total delivery

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，霧化器C遞送速率最快，與霧化器B的遞送速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余3款霧化器的遞送速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由遞送總量和呼出總量結(jié)果可知，霧化器B最高，霧化器E最低，其余3款霧化器差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。霧化器E遞送總量和呼出總量值低的原因是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)該款霧化杯無上蓋，不能密封，在霧化過程中，大量霧化液滴從霧化杯上口噴出，導(dǎo)致收集到活性物質(zhì)少。藥杯中殘留量最少的是霧化器D，霧化器D、霧化器B和霧化器C藥杯殘留量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，霧化器A藥杯中殘留量最多。霧化器A及霧化器B的回收率均大于95%，說明該霧化器上蓋的設(shè)計(jì)可有效阻止霧化液滴在呼氣時(shí)噴出，且采用上述洗滌方式可以將各部件中的黃芩苷收集完全，濾膜對(duì)藥物無吸附作用。

3 討論

霧化吸入療法是呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的重要治療手段之一，因其臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)被國內(nèi)外廣泛使用。肺部是霧化吸入給藥的重要作用部位，但并非所有藥液經(jīng)霧化后，霧化顆粒都能沉積肺部，進(jìn)入呼吸道的粒子會(huì)發(fā)生慣性碰撞、沉降和擴(kuò)散，粒子的粒徑、形態(tài)和密度是決定粒子沉積的重要因素[9-10]。霧化顆粒直徑對(duì)藥物沉積位置有直接影響，有效霧化顆粒直徑應(yīng)在0.5～10 μm。其中粒徑5～10 μm的霧粒主要沉積于口咽部，粒徑3～5 μm的霧粒主要沉積于肺部，粒徑1～3 μm的霧粒50%～60%沉積于肺泡，而粒徑＜1 μm的微粒吸入肺內(nèi)后大部分又隨氣流呼出。綜上，粒徑1～5 μm的粒子在肺部沉降率最高，一般被選作霧化吸入制劑的主要組成部分，能夠發(fā)揮最大的臨床療效[11-13]。

空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布（APSD）可反映已形成的藥物霧滴在人體肺部環(huán)境中的粒徑分布情況，有利于評(píng)估吸入藥物在臨床應(yīng)用中的安全性及有效性；可確定霧粒進(jìn)入口腔并能到達(dá)肺部的粒子比例，還預(yù)測(cè)粒子在肺部發(fā)生沉積的位點(diǎn)。APSD的主要指標(biāo)有FPD（微細(xì)粒子劑量）、FPF（微細(xì)粒子分?jǐn)?shù)）、MMAD（空氣動(dòng)力學(xué)質(zhì)量中直徑）和GSD（幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差）。FPD為空氣動(dòng)力學(xué)粒徑小于5 μm的氣溶膠藥物粒子的質(zhì)量，描述了可能進(jìn)入肺部的藥物粒子的質(zhì)量。FPF通常指藥物在肺部沉積百分比。MMAD是指大于和小于該空氣動(dòng)力學(xué)直徑的粒子質(zhì)量各占總質(zhì)量的一半，是衡量“平均”粒徑的有效工具。GSD為累積分布低于84.1%和15.9%粒子的空氣動(dòng)力學(xué)直徑（μm）比值，理想氣溶膠的GSD值為1，但大多數(shù)藥物的氣溶膠是非均相的，GSD值一般在1.5～2.5[8]。本研究選用的5種射流霧化器均能產(chǎn)生MMAD≤5 μm的霧化效果。

目前，上市的空氣射流霧化器品種眾多，本研究選擇了目前市場上常用的5種品牌或型號(hào)壓縮空氣式霧化器對(duì)銀黃吸入溶液的遞送速率、遞送總量和APSD進(jìn)行測(cè)定，綜合各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)可知，不同霧化器的體外霧化特性有顯著差異，可能是由于不同霧化器所配備的壓縮機(jī)功率不同及霧化杯的構(gòu)造不同造成。如霧化器E配套的霧化杯無上蓋，霧化過程有霧粒噴出，導(dǎo)致遞送總量和呼出總量值偏低；霧化器A和霧化器B為采用同一壓縮機(jī)，只是位于霧化杯內(nèi)部的內(nèi)芯不同，體外霧化特性也有明顯差異，霧化器A的APSD各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于霧化器B，但遞送速率、遞送總量均小于霧化器B。綜合比較遞送速率、遞送總量和APSD等指標(biāo)測(cè)評(píng)結(jié)果，霧化器B和霧化器C的有效微細(xì)粒子沉積較多，粒徑分布較窄，遞送速率和遞送總量較大，適合銀黃吸入溶液的臨床使用。

另外，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)同一種類型的霧化器進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)采用同一種模型藥物得出的結(jié)果有顯著性差異，因此建議在霧化吸入制劑研發(fā)過程中，應(yīng)考慮到不同類型、品牌、型號(hào)霧化器對(duì)霧化性能效果的影響，對(duì)擬選用的霧化器進(jìn)行全面性能考察，以確保霧化吸入制劑臨床使用的療效。