一例豬副豬嗜血桿菌病的診斷

吳 芳 福建省漳州市龍海區(qū)隆教畜牧獸醫(yī)站 福建 漳州 363100

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病或革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起。該病臨床上以體溫升高、四肢腫脹、呼吸困難、纖維素性多發(fā)性炎癥和高病死率為特征[1]。HPS是一種非溶血性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型、兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陰性短小桿菌[2]。HPS只感染豬，臨床上2周～4月齡豬均可感染，發(fā)病率可達(dá)40%，病死率可達(dá)50%[3]?，F(xiàn)將一例副豬嗜血桿菌病的診斷情況報(bào)道如下。

1 發(fā)病情況

2019年3月，連續(xù)陰雨，氣溫驟降。福建省某養(yǎng)殖場的12棟保育舍（每棟飼養(yǎng)600頭斷乳仔豬），飼養(yǎng)員關(guān)閉卷簾對豬群進(jìn)行保溫，使得保育舍白天夜晚均處于密閉狀態(tài)。室內(nèi)溫度高于室外溫度，空氣不流通并且潮濕。3周齡～2月齡保育仔豬表現(xiàn)為飲食欲不振、精神沉郁、耳朵發(fā)紫、行走緩慢、不愿站立，較為嚴(yán)重的患豬關(guān)節(jié)腫脹、跛行。

2 臨床癥狀

發(fā)病初期，仔豬表現(xiàn)為短促咳嗽，體溫達(dá)40.5～42℃，精神沉郁，食欲不振，畏寒?dāng)D臥。中期，仔豬喘氣加劇，呼吸急促，眼瞼水腫，鼻孔流膿性分泌物；患豬后肢關(guān)節(jié)腫脹，行走困難，無法站立，呈“犬”坐姿，甚至癱瘓；患豬扎堆而睡；部分患豬皮膚潮紅，耳尖發(fā)紺。后期，患豬表現(xiàn)為飲食欲廢絕，逐漸消瘦；皮膚蒼白，被毛粗亂；呼吸困難，四肢腫脹，共濟(jì)失調(diào)，最終死亡。

3 剖檢病變

剖檢患豬，發(fā)現(xiàn)頜下淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)均出血腫大；胸腔內(nèi)有大量積水；心臟表面有一層絨毛樣被膜覆蓋；打開腹腔見大量纖維素性滲出物附著于腸黏膜和肝、脾等組織器官表面，呈淡黃色條索狀；肝瘀血腫大；肺臟腫脹并瘀血，觸之有實(shí)變；胃潰瘍；腦膜充血水腫；切開關(guān)節(jié)腫脹處有膠凍樣物流出。

4 實(shí)驗(yàn)室檢查

4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采集疑似患豬的肺臟、氣管、關(guān)節(jié)積液，接種于含NAD和5%犢牛血清的TSA平板以及無NAD的TSA平板上，置37℃培養(yǎng)24～48 h（病原菌送至省農(nóng)科院檢測，已經(jīng)排除有其他病原共感染）。結(jié)果在含NAD和5%犢牛血清的TSA平板中可觀察到圓形、光滑濕潤、無色透明的菌落；無NAD的TSA平板上沒有菌落生長。

4.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察 挑取單個菌落分別劃線接種5%新生犢牛血清TSA固體培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中燭缸厭氧培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。結(jié)果分離菌在麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基中均未見生長；在兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長差，只有極少數(shù)菌落生長；在巧克力瓊脂平板、5%新生犢牛血清TSA固體培養(yǎng)基中生長最好，可見大量光滑濕潤、無色透明的菌落生長。

4.3 涂片染色鏡檢 挑取部分菌落均勻涂布于滴有生理鹽水的載玻片上。固定載玻片后，革蘭氏染色，鏡檢[4]。可觀察到革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，無芽孢，個別菌株呈兩極濃染的球桿狀。

4.4 生化試驗(yàn) 細(xì)菌純化培養(yǎng)后，分別接種系列生化培養(yǎng)基，置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果分離株對NAD依賴性、接觸酶、丙二鹽、葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、枸櫞糖、D-核糖、果糖、山梨醇、木糖呈現(xiàn)陽性；對溶血性、尿酶、硫化氫、硝酸鹽、吲哚呈現(xiàn)陰性。

4.5 PCR鑒定 將純化好的菌株接種到TSB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。取1 mL混合液放入1.5 mL離心管中，煮沸15 min，在20 μL反應(yīng)體系中10×buffer 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、rTaq酶0.2 μL、20 mmol/L上游引物P1和下游引物P2（參照Simone Oliveira等[5]發(fā)表的報(bào)告中的合成引物：P1（5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′）、P2（5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′））各0.5 μL、模 板2.0 μL、滅菌雙蒸水13.2 μL。在滅菌EP管中依次加入以上試劑，離心混勻。經(jīng)過94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)中可觀察到一條約在800 bp的特異性條帶，其大小與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小相符（見圖1）。

圖1 分離菌的PCR鑒定結(jié)果

5 小結(jié)與討論

1）根據(jù)患豬的臨床癥狀、病理剖檢，再結(jié)合培養(yǎng)的分離菌株的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性，初步鑒定該分離菌為HPS。用HPS序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得一條符合該病菌的特異性條帶。經(jīng)過上述檢查，確診該病為副豬嗜血桿菌病。

2）HPS感染在臨床上很容易與傳染性胸膜肺炎、豬偽狂犬病以及豬瘟等發(fā)生共感染，導(dǎo)致豬群病死率高達(dá)90%[6]。此外，該病的臨床癥狀、剖檢病變與豬鏈球菌病極其相似。副豬嗜血桿菌病常表現(xiàn)關(guān)節(jié)腫痛、跛行和共濟(jì)失調(diào)等，常會被誤診為豬鏈球菌病。然而兩種疫病不同的是，HPS感染具有皮膚潮紅、耳朵發(fā)紺癥狀，患豬的關(guān)節(jié)面有漿液，為纖維素性化膿性炎癥，潤滑液增多；而豬鏈球菌病不會出現(xiàn)副豬嗜血桿菌病的典型癥狀，大多呈化膿性關(guān)節(jié)炎，觸摸為硬的實(shí)性炎癥。

3）目前，副豬嗜血桿菌病經(jīng)常繼發(fā)于其他病毒性疾病，在實(shí)際生產(chǎn)中，較大一部分管理者會將重心放在治療其他病毒性疫病上，而忽視該病的防控與治療，最終使得較多的豬只免疫力下降，最終死亡于此類細(xì)菌性疫病。又因?yàn)镠PS有多種血清型，臨床上很難針對某一血清型研發(fā)疫苗預(yù)防該病。副豬嗜血桿菌病發(fā)生主要與各種應(yīng)激有關(guān)。在集約化養(yǎng)殖模式下，部分養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖理念還是未能跟上科學(xué)養(yǎng)豬的要求，導(dǎo)致飼養(yǎng)管理上的不足，比如用過的針頭、注射器隨處擺放；多頭患豬共用1個針頭；豬群斷乳轉(zhuǎn)群時(shí)，為爭奪領(lǐng)地互相打斗，傷口往往會被忽視，細(xì)菌容易從傷口進(jìn)入豬只機(jī)體中，引起細(xì)菌性疫??；此外豬舍消毒不完全，清洗后未晾干，飼料潮濕等應(yīng)激因素，也增加豬群患該病的幾率。

4）大量臨床資料表明，完善病毒性疫病的免疫防控和合理應(yīng)用藥物防治可明顯降低該病的發(fā)病率和病死率。防控措施主要有以下幾個方面：（1）在豬群中發(fā)現(xiàn)疑似該病的臨床癥狀時(shí)，應(yīng)結(jié)合相關(guān)的技術(shù)確診，及時(shí)治療。（2）減少應(yīng)激。（3）定期消毒，徹底清理豬舍衛(wèi)生。防治該病還是要做到“養(yǎng)防結(jié)合”，加強(qiáng)豬群的飼養(yǎng)管理，營造舒適的環(huán)境，這樣既可以減少不必要的死亡與經(jīng)濟(jì)損失，也能使豬群健康成長。