一例豬藍(lán)耳病與豬圓環(huán)病毒病及多重細(xì)菌共感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

黃喜榮 陳羽璇 張鑫杰 薛少華 呂紫欣 蒙 寧 戴愛玲,2,3＊

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 福建 龍巖 364000；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心 福建 龍巖 364000；3.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建 龍巖 364000）

豬藍(lán)耳病又稱為豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的高度接觸性傳染病。可通過唾液、公豬精液、糞便、母豬垂直傳播等方式傳播，傳播范圍很廣，極難防控。我國華北地區(qū)于1995年從加拿大進(jìn)口的種豬中首次分離出該病毒[1]。豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus，PCV）為目前發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一，無囊膜，含共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA。目前已報(bào)道四種豬圓環(huán)病毒。豬圓環(huán)病毒1型無致病性，2型具有致病性，并且二者在豬群中廣泛存在，3型、4型的致病性尚不確定[2]。2型是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病 （Porcine circovirus associated disease，PCVAD）的主要病原體，極易感染哺乳期和保育期的豬而致病，一般不造成直接死亡，而是導(dǎo)致豬免疫力下降，耐過后終身帶毒。斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）是PCVAD的最常見形式，感染早期的PMWS豬群平均病死率為20%～40%，晚期PMWS感染最初發(fā)生在8～12周齡，主要臨床癥狀是腹瀉，一般與沙門氏菌共感染，其病死率高達(dá)80%[3-4]。在豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病中以斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）影響最為嚴(yán)重，給世界豬業(yè)帶來巨大損失，同時(shí)在PMWS發(fā)生過程中豬繁殖與呼吸綜合征病毒也起著非常重要的作用。豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒病都是免疫抑制病，能導(dǎo)致患豬對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)降低，進(jìn)一步增加對(duì)其他傳染病的易感性，使動(dòng)物長期處于亞臨床狀態(tài)[5]。Rovira A等[6]通過共感染試驗(yàn)證明，PRRSV感染可促進(jìn)PCV2的增殖，Harms P A等[7]發(fā)現(xiàn)PCV2能夠加重PRRSV引起的支氣管肺炎病理變化，這是引起二者共感染并造成巨大危害的主要原因。有研究對(duì)華東四個(gè)省份127份母豬繁殖障礙、仔豬呼吸困難的病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PRRSV與PCV2共感染病例占52.3%，表明二者有極高的共感染率[8]。

本研究對(duì)2021年福建省龍巖市某規(guī)模豬場發(fā)生的一例保育豬出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、消瘦等癥狀的病例進(jìn)行綜合診斷。該豬場存欄1 000頭，其中母豬200頭，2021年10月保育豬出現(xiàn)體溫升高、精神低迷、呼吸困難、食欲不振、消瘦等臨床癥狀，部分仔豬皮膚發(fā)紺，嚴(yán)重的腹式呼吸、腹瀉、高熱，個(gè)別仔豬死亡速度快，死前有四肢劃動(dòng)的神經(jīng)癥狀，發(fā)病率達(dá)30%左右，病死率達(dá)60%以上。臨床解剖發(fā)病保育仔豬，發(fā)現(xiàn)氣管有大量膿性黏液，肺臟腫脹、肺臟表面有纖維素性滲出，心包炎，全身淋巴結(jié)腫脹，肺門淋巴結(jié)出血；肝臟、腎臟表面有少許出血點(diǎn)；膀胱、扁桃體、脾臟無明顯臨床眼觀病變。該豬場豬瘟、豬偽狂犬病均按照正常的免疫程序進(jìn)行免疫接種；藍(lán)耳病采取一年統(tǒng)一免疫三次藍(lán)耳病滅活疫苗、二次活疫苗（PC株）的免疫方式，仔豬不免疫；豬圓環(huán)病毒2型疫苗采取母豬不免疫，仔豬14～15日齡免疫基因工程疫苗（原核表達(dá)）的免疫方式；全場沒有免疫相關(guān)細(xì)菌性疫苗。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與處理 對(duì)龍巖市某規(guī)?；i場送檢的3頭患豬進(jìn)行臨床剖檢，無菌采集發(fā)病豬的肝臟、肺臟深層組織，接種于含血清和NAD的TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。

無菌采集患豬肝臟、肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟，按照剖檢順序進(jìn)行編號(hào)，-80℃凍存、備用。

1.2 主要儀器ABI Veriti 96孔梯度PCR儀，購自ABI公司；MiniProTM EpBasic基礎(chǔ)型電泳儀，購自翌圣生物科技有限公司。

1.3 主要試劑 病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購自青島英賽特有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、2×Taq Master plus Mix、2×Phanta Flash Master Mix、膠回收試劑盒及DH5α，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL 2000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；革蘭氏染色試劑，購自北京陸橋技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank已公布的多個(gè)不同PCV2基因型序列設(shè)計(jì)用于PCV2檢測(cè)的引物；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[9]合成能夠擴(kuò)增PCV2基因組1 154 bp長度（序列分析）的引物對(duì)；根據(jù)PRRSV多個(gè)參考毒株設(shè)計(jì)用于PRRSV檢測(cè)并能同時(shí)擴(kuò)增ORF5全長的引物；細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)進(jìn)行合成[10]，CSFV和PRV檢測(cè)用引物分別根據(jù)文獻(xiàn)[11]和標(biāo)準(zhǔn)[12]合成，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。各引物信息見表1。

表1 引物信息

1.5 方法

1.5.1 病毒核酸提取 將采集的組織病料剪碎后置于2 mL EP管中，加入等體積滅菌PBS，置于組織研磨儀研磨，經(jīng)反復(fù)凍融3次，離心取出上清，上清組織懸液立即用于核酸提取或置于-80℃保存。

參照病毒DNA/RNA共提取試劑盒說明書，提取樣品DNA/RNA，DNA/RNA立即用于PCR反應(yīng)或置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書對(duì)提取的樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA立即用于RT-PCR試驗(yàn)或置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR或RT-PCR檢測(cè) 以提取的樣品DNA為模板對(duì)PCV2、PRV進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，樣品DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PCV2及PRV檢測(cè)的上下游引物各1 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，61℃/65℃（PCV2/PRV）退火30 s，72℃延伸45 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸5 min。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板對(duì)PRRSV、CSFV進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，RT-PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，樣品cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PRRSV及CSFV檢 測(cè) 的 上 下 游 引 物 各1 μL；RT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃/55℃（PRRSV/CSFV）退 火30 s，72℃延伸50 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸5 min。PCR和RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.5.3 目的片段的克隆及序列分析 使用高保真酶分別對(duì)PCV2、PRRSV及所分離細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增。以陽性樣品DNA為模板對(duì)PCV2目的片段進(jìn) 行PCR擴(kuò) 增，PCR擴(kuò) 增 體 系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣 品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PCV2目的片段擴(kuò)增上下游引物各2 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，62℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸1 min。

以陽性樣品cDNA為模板對(duì)PRRSV ORF5進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣品cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PRRSV目的片段擴(kuò)增上下游引物各2 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，53℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸1 min。

挑取24 h過夜培養(yǎng)的單菌落，應(yīng)用水煮模板法提取細(xì)菌核酸。以提取的細(xì)菌核酸為模板對(duì)細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，樣品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，目的片段擴(kuò)增上下游引物各2 μL；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，61℃退火5 s，72℃延伸20 s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸1 min。應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

根據(jù)膠回收試劑盒說明書對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物鏈接至pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌落。將陽性菌落送至廣東睿博興科公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件的Megalin進(jìn)行序列分析，并應(yīng)用MEGA7軟件的鄰接法繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定 無菌采集發(fā)病豬的肝臟、肺臟深層組織進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果顯示，肉眼觀察到血平板上出現(xiàn)三種形態(tài)不同的菌落，經(jīng)革蘭氏染色后1號(hào)和3號(hào)菌株為革蘭氏陰性菌，2號(hào)菌為革蘭氏陽性菌。

2.2 PCR或RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)3份患豬組織樣品的PRRSV和PCV2核酸進(jìn)行檢測(cè)。PRRSV檢測(cè)結(jié)果顯示，1號(hào)樣品在750 bp左右出現(xiàn)目的條帶（見圖1a），2號(hào)、3號(hào)樣品均未擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶；PCV2檢測(cè)結(jié)果顯示，1～3號(hào)樣品均在666 bp處有特異性條帶（見圖1b），均與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)樣品CSFV、PRV核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示3份樣品CSFV、PRV病原核酸均為陰性。結(jié)果表明1號(hào)患豬檢出了PRRSV和PCV-2病毒核酸，2號(hào)、3號(hào)患豬檢出了PCV2病毒核酸。

圖1 PRRSV、PCV2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 PCV2、PRRSV同源性序列分析與遺傳進(jìn)化分析

2.3.1 PRRSV序列分析 將測(cè)序所得1號(hào)樣品毒株命名為ZGD-PRRSV，通過Genbank上所公布PRRSV參考毒株的ORF5基因序列進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所獲得ZGD-PRRSV ORF5序列長度為603 bp，為美洲型毒株。序列比對(duì)結(jié)果顯示，ZGDPRRSV株與國內(nèi)HP-PRRSV代表毒株JXA1、JAX1-p170、HuN4的相似性最高，為93.4%～94.0%；與參考毒株VR2332、CH1-a的核苷酸同源性為89.8%～89.9%；與NADC30、NADC34和QYYZ分支的毒株相似性較低，為81.7%～85.8%。 與參考毒株的遺傳演化分析結(jié)果顯示（見圖2），ZGD-PRRSV毒株ORF5基因與HP-PRRSV代表毒株JXA1、HUN4、TJM-F92、CH-1R等處于同一分支，親緣關(guān)系較近，為高致病性毒株；與國內(nèi)目前主要流行的NADC30-like PRRSV代表毒株NADC30、CHsx1401、FJZ03具有一定的遺傳距離，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 PRRSV ORF5遺傳進(jìn)化分析

2.3.2 PCV2序列分析 應(yīng)用DNAStar對(duì)1～3號(hào)樣品PCV2測(cè)序結(jié)果進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，1～3號(hào)樣品PCV2核苷酸同源性為100%，均為同一毒株。將測(cè)序所得1～3號(hào)樣品毒株命名為ZGD-PCV2，并與GenBank中登錄的27株P(guān)CV2參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析，序列比對(duì)結(jié)果顯示，與法國及西班牙參考毒株AY322004、GU049340.1的同源性最高，為96.1%～98.4%；與天津、廣東、福建地區(qū)參考毒 株AY181946、AY682994.1、DQ180393的 同 源 性為92.7%～93.6%；與丹麥、江蘇參考毒株EU148505、MG732801.1的同源性較低，為91.0%～92.7%。 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示（見圖3），ZGD-PCV2與法國及西班牙參考毒株AY322004、GU049340.1親緣關(guān)系較近，同屬于PCV2a亞型；與福建本地毒株DQ180393有較遠(yuǎn)的遺傳距離，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 PCV2遺傳進(jìn)化分析

2.4 細(xì)菌16S rRNA的PCR鑒定與測(cè)序 分別對(duì)所分離3個(gè)菌株的16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，1～3號(hào)菌株均在1 484 bp左右出現(xiàn)特異性條帶（見圖4）。對(duì)所獲得3個(gè)菌株的16S rRNA進(jìn)行克隆測(cè)序，BLAST快速比對(duì)結(jié)果顯示，1號(hào)細(xì)菌與肺炎克雷伯菌16S rRNA的核苷酸同源性達(dá)99.9%以上；2號(hào)菌與豬鏈球菌16S rRNA的核苷酸同源性達(dá)99.9%以上；3號(hào)細(xì)菌與O157:H7血清型大腸桿菌（腸致病性）16S rRNA的核苷酸同源性達(dá)99.9%以上。

圖4 16S rRNA的PCR鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢、病原學(xué)檢測(cè)，判定該豬場發(fā)病豬PRRSV、PCV2共感染，并發(fā)感染豬鏈球菌、肺炎克雷伯菌等，表明藍(lán)耳病與圓環(huán)病毒病共感染且并發(fā)細(xì)菌病是該次疫情的主要原因；序列分析表明，感染的PRRSV為HP-PRRSV株，PCV2毒株為PCV2a亞型。

本試驗(yàn)檢測(cè)的3份樣品中，1份檢出PRRSV與PCV2共感染，2份只檢出PCV2感染，表明豬場圓環(huán)病毒感染比較嚴(yán)重。近年來，隨著豬場規(guī)模化和集約化程度不斷提高，豬場和豬群密度較大，病毒病或多種病毒共感染的發(fā)生率越來越大[8,11,13]。PRRSV與PCV2共感染在病毒性感染中危害最為嚴(yán)重，能夠造成豬群的雙重免疫抑制，抵抗力下降，從而易引起細(xì)菌繼發(fā)感染[14]。在臨床生產(chǎn)中，對(duì)豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病的有效防控尤為重要。但由于PRRSV毒株具有遺傳多樣特征，現(xiàn)有藍(lán)耳病弱毒疫苗免疫后不能提供有效的免疫保護(hù)，免疫后可抑制野毒復(fù)制，降低病毒血癥水平和排毒，但不能阻止野毒感染，只能減輕臨床癥狀。PRRS嵌合病毒活疫苗（PC株）和藍(lán)耳病滅活疫苗聯(lián)合免疫，雖然有報(bào)道在藍(lán)耳病防控方面有一定的效果，但還需要在臨床上持續(xù)跟蹤[15-16]。對(duì)于該豬場病例，核苷酸同源性與遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，該毒株與HP-PRRSV分支有較近的親緣關(guān)系，因此，免疫同源性較高的高致病性藍(lán)耳病疫苗株如JAX1-R株、HuN4-F112株等，可以提供更為有效的保護(hù)作用，減少經(jīng)濟(jì)損失。 豬圓環(huán)病毒病疫苗有全病毒滅活疫苗和亞單位基因工程疫苗，現(xiàn)有商品化疫苗主要以PCV2a毒株為基礎(chǔ)[17]，該豬場感染的PCV2毒株為PCV2a基因型，雖然毒株同源性高，但疫苗使用效果除受生產(chǎn)工藝、毒株、病毒含量、佐劑、滅活劑影響外，還受免疫頻次、機(jī)體健康等因素影響，有效的疫苗免疫才可以明顯降低病毒血癥，減輕臨床發(fā)病癥狀[18]。豬鏈球菌、肺炎克雷伯菌、腸致病性大腸桿菌等在豬場是一種條件致病菌，常在豬體抵抗力下降時(shí)才表現(xiàn)發(fā)病癥狀。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該豬場對(duì)母豬采取一年統(tǒng)一免疫三次藍(lán)耳病滅活疫苗、二次活疫苗（PC株），仔豬未免疫藍(lán)耳病疫苗；母豬未免疫豬圓環(huán)病毒病疫苗，仔豬14日齡免疫基因工程疫苗（原核表達(dá)）。雖然該豬場有接種疫苗，但缺乏后期相應(yīng)的免疫監(jiān)測(cè)，無法評(píng)估制定的免疫程序的合理性。此外，豬場受非洲豬瘟疫情影響，許多工作重心在生物安全措施管理方面，忽略了10月份是秋冬交替之際，南方山區(qū)晝夜溫差大，斷乳后保育豬的保溫管理沒有及時(shí)調(diào)整，導(dǎo)致保育豬在多重應(yīng)激下發(fā)病。

針對(duì)該次疫情，豬場及時(shí)隔離患豬，淘汰無治療價(jià)值患豬，對(duì)有治療價(jià)值的豬選擇肌注磺胺間甲氧嘧啶鈉和頭孢噻呋，群體添加抗生素如替米考星、阿莫西林和中藥制劑如玉屏風(fēng)顆粒和麻杏石甘顆粒，連用15 d（用量根據(jù)說明書）；同時(shí)加強(qiáng)生物安全防控和飼養(yǎng)管理，在保持欄舍通風(fēng)保溫前提下，減少晝夜溫差，執(zhí)行全進(jìn)全出，保育舍至少空欄2周。建議豬場仔豬出生后用鹽酸頭孢噻呋做保健，預(yù)防斷臍、剪牙、斷尾、斷乳過程中因傷口或應(yīng)激引起細(xì)菌感染；建議近期懷孕母豬產(chǎn)前免疫2次豬圓環(huán)病毒病疫苗，以后全場一年免疫3～4次。1個(gè)月后對(duì)豬場進(jìn)行回訪，該豬場疫情得到有效改善，保育豬死亡率明顯下降，說明該方案行之有效。