豬布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查及3種檢測(cè)方法比較

方來杉 李莎莎 黃文華 王寶珍 南平市延平區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 福建 南平 353000

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬的布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患傳染性疫病[1]。是OIE規(guī)定必須報(bào)告的B類動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。目前發(fā)現(xiàn)布魯氏菌易感動(dòng)物有60多種，包括禽類、哺乳類和人類。其中牛、豬、羊是畜間布魯氏菌的主要傳染源，嚙齒動(dòng)物如鼠、野兔和豚鼠也能攜帶布魯氏菌，是養(yǎng)殖場(chǎng)不可忽視的傳染源。目前發(fā)現(xiàn)的豬布魯氏菌（Brucella Suis）有5個(gè)生物型，其中1、2、3型可以引起豬發(fā)病，4、5生物型可引起其他動(dòng)物發(fā)病[2]。由于不同種的布魯氏菌具有宿主轉(zhuǎn)移特性，羊種、牛種布魯氏菌亦可引起公豬睪丸炎、附睪炎和關(guān)節(jié)炎，母豬流產(chǎn)、死胎和不孕等癥狀。豬群主要經(jīng)呼吸道、生殖道及破損皮膚、黏膜感染豬布魯氏菌病，20周齡以下豬只具有一定的抵抗能力，隨著日齡增大，感染該病的風(fēng)險(xiǎn)更大[3]。

常用的布魯氏菌病診斷方法有三種：血清學(xué)方法、細(xì)菌學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，血清學(xué)方法與后兩者相比，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、便于大批量臨床樣品監(jiān)測(cè)。血清學(xué)方法包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、熒光偏振試驗(yàn)（FPA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、試管凝集試驗(yàn) （SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）和膠體金等。2018年9月已實(shí)施的《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）將iELISA和cELISA納入了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，cELISA可以區(qū)分疫苗接種和野毒株感染。

本研究通過血清學(xué)診斷方法了解延平區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)豬布病抗體陽(yáng)性率情況，為了確保布病檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，減少漏診、誤診情況，同時(shí)對(duì)3種布病血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。本研究目的是通過準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果與分析，進(jìn)而掌握延平區(qū)豬布魯氏菌病的發(fā)病情況，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液來源2022年4～5月從延平區(qū)12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)各隨機(jī)選擇1個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，每個(gè)豬場(chǎng)各采集30份血清樣品，共采集360份樣本，12家豬場(chǎng)均未免疫豬布魯氏菌病疫苗。

1.1.2 試劑儀器 虎紅平板凝集試驗(yàn)：虎紅平板凝集抗原（哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2022001）、受檢陰性血清、布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、玻璃平板。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（浙江迪恩生物科技有限公司，批號(hào)82011）、布魯氏菌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒 （北京中海生物科技有限公司，批號(hào)20220401/1）、50 μL可調(diào)移液器、一次性移液器槍頭等。

1.2 方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn) 參考《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646-2018)的方法，具體如下：將被檢血清0.03 mL與抗原0.03 mL相混合，4 min內(nèi)觀察結(jié)果。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)iELISA和cELISA試驗(yàn)均按各自試劑盒的使用說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩結(jié)果 從圖1可知，虎紅平板凝集反應(yīng)中標(biāo)準(zhǔn)陰性血清樣本（B4）無凝集現(xiàn)象，液體均勻渾濁。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（C4）、A1、B1和B2樣品呈現(xiàn)有明顯的凝集顆粒，A3、A4、C1和C3樣品可見有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明。A2、B3和C2樣品液體均勻渾濁，無凝集現(xiàn)象。

圖1 部分虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的12家規(guī)模場(chǎng)的虎紅平板凝集試驗(yàn)共檢出陽(yáng)性血清樣本54份，抗體陽(yáng)性率為15%，其中C鄉(xiāng)鎮(zhèn)的豬布病抗體陽(yáng)性率為13.33%；D鄉(xiāng)鎮(zhèn)的豬布病抗體陽(yáng)性率高達(dá)100%；G鄉(xiāng)鎮(zhèn)的豬布病抗體陽(yáng)性率為66.67%。

表1 規(guī)模豬場(chǎng)布病虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.2 間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)結(jié)果 將虎紅平板凝集試驗(yàn)初篩出的54份抗體陽(yáng)性血清樣本，再次進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)，同時(shí)也將54份抗體陽(yáng)性血清樣本進(jìn)行間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA復(fù)核試驗(yàn)。由表2可知，初篩得到的54份抗體陽(yáng)性血清樣本的RBPT抗體陽(yáng)性率為100%，可排除因玻璃平板污染的因素。然而間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)均無抗體陽(yáng)性血清樣本檢出。RBPT容易受待檢血清質(zhì)量、反應(yīng)溫度、試驗(yàn)人員主觀因素等影響，而ELISA作為我國(guó)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)推薦方法，特異性強(qiáng)。在臨床監(jiān)測(cè)豬布魯氏菌病工作中，必須使用多種布病檢測(cè)方式方能確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

表2 三種血清學(xué)檢測(cè)方法的比較

3 分析與討論

本次試驗(yàn)結(jié)果顯示，南平市延平區(qū)12家規(guī)模豬場(chǎng)尚無豬布魯氏菌病。雖然本地區(qū)未發(fā)現(xiàn)有豬布魯氏菌病，但本地區(qū)為福建省畜牧養(yǎng)殖大縣（區(qū)），擁有95家左右大中小型養(yǎng)豬場(chǎng)、14家規(guī)?；榕?chǎng)、總存欄量約1萬多頭以及眾多零星散養(yǎng)的養(yǎng)羊戶，各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的豬場(chǎng)處于較為復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境，做好豬布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)調(diào)查工作不容松懈。布魯氏菌病影響人和家畜動(dòng)物的健康，進(jìn)而對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類公共衛(wèi)生造成巨大的安全隱患。

本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，RBPT法與iELISA、cELISA相比出現(xiàn)了較高的假陽(yáng)性，特異性較低。其中D、G兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)假陽(yáng)性率分別為100%、66.67%。RBPT法有較高的誤診率，主要原因如下：一是，抗凝劑對(duì)RBPT有顯著影響，在乳酸緩沖液下血漿中的纖維蛋白原會(huì)與虎紅試劑（四氯四碘熒光素）發(fā)生非特異性凝集反應(yīng)，造成極高的假陽(yáng)性率[4]，因此，不可用血漿進(jìn)行布魯桿菌病RBPT檢測(cè)；二是，反應(yīng)溫度對(duì)RBPT的影響，RBPT所用的抗原需要恢復(fù)至室溫，血清放置回溫時(shí)間越短、溫度越低，假陽(yáng)性率越高；三是，血清的藥物濃度、試驗(yàn)人員操作的規(guī)范性、嚴(yán)謹(jǐn)性等均在一定程度影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

在臨床監(jiān)測(cè)豬布魯氏菌病工作中，必須使用多種布病檢測(cè)方式，盡量減少漏診、誤診情況的出現(xiàn)。同時(shí)，加強(qiáng)基層獸醫(yī)人員的采血技術(shù)培訓(xùn)，按照要求采集血清樣本，不可用血漿代替血清。布病是人畜共患病，目前主要防治措施是采取檢疫凈化，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠對(duì)于防治該病具有至關(guān)重要的作用。