2020—2021年河北省部分地區(qū)副豬嗜血桿菌流行情況調(diào)查及耐藥性分析

王福厚，黃冬青，葛生虎

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學院，甘肅 武威 733006；2.臨西縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺 054900；3.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺 054000）

副豬嗜血桿菌病又名多發(fā)性纖維素性漿膜炎，是由副豬嗜血桿菌（Hps）感染引起的一種常見細菌性疾病。Hps廣泛存在于豬場，該菌一般定殖于豬上呼吸道，健康豬群感染該菌不會表現(xiàn)嚴重的臨床癥狀。若豬群免疫能力下降，Hps感染則會導致病豬出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、支氣管肺炎和腦膜炎等，繼而給豬場造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。

Hps可感染不同發(fā)育階段豬群，但2周至4月齡豬群對該病原更易感，且發(fā)病率和死亡率較高。截至目前，全世界流行的Hps菌株可分為21個血清型，不同血清型之間免疫力較差，且毒力也存在很大的差別[2]。此外，目前對于副豬嗜血桿菌病的防治主要依賴于抗生素的使用，而抗生素的濫用或不合理使用導致豬場Hps耐藥株頻繁出現(xiàn)，這給該病的防治造成了巨大的困難。譚美芳等[3]發(fā)現(xiàn)大部分Hps江西分離株對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氨芐西林等抗生素耐藥性較高，甚至部分菌株出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象；王慶云[4]調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分Hps安陽分離株對青霉素、阿莫西林、紅霉素和多黏菌素等抗生素耐藥，對環(huán)丙沙星、頭孢噻肟和頭孢噻呋等抗生素較敏感。由此可見，有效防治副豬嗜血桿菌病的前提是篩選對菌株敏感的抗生素，以免造成抗生素濫用。

為初步了解近年來河北省部分地區(qū)豬場Hps流行情況，本研究于2020—2021年從河北邢臺及周邊地區(qū)豬場采集組織病料共2 844份，通過熒光定量PCR法確定檢測樣品Hps陽性率；分離獲得部分菌株進行藥敏試驗，旨在為該病的臨床用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

于2020年1月至2021年12月從河北邢臺、保定、邯鄲、秦皇島、張家口和石家莊等地區(qū)的664個豬場采集疑似感染副豬嗜血桿菌組織樣品2 844份。由豬場獸醫(yī)或其他工作人員剖檢病豬后，取少量組織樣品（肺臟）裝入潔凈封口袋內(nèi)，低溫送至河北銘諸生物科技有限公司，待檢。

1.2 樣品處理及病原檢測

在無菌條件下，切取少量組織樣品剪碎后置于2 mL離心管內(nèi)，加入少量無菌PBS和鋼珠，置于勻漿機內(nèi)高速勻漿。將混合物以13 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液用于DNA基因組提?。ㄔ噭┖袨槲錆h科前生物股份有限公司產(chǎn)品），最后獲得的核酸保存于-20 ℃或立即用于熒光定量PCR檢測。

采用Hps特異性引物，利用商業(yè)化熒光定量PCR試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司產(chǎn)品）檢測待檢組織樣品中是否存在Hps核酸，每次檢測均設(shè)置陽性對照和陰性對照。反應結(jié)束后，根據(jù)樣品對應CT值判定其是否為陽性，若樣品CT值低于35則判定為陽性，若CT值大于35則判定為陰性。

1.3 細菌分離及革蘭氏染色鑒定

取少量Hps核酸陽性樣品對應組織上清液，用滅菌接種環(huán)蘸取上清液后在含10%乳牛血清的TSA固體培養(yǎng)基平板表面劃線，其后將平板放置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～36 h。挑取單一菌落進行革蘭氏染色鑒定，參考相關(guān)文獻[5]判定分離菌株是否為Hps。

1.4 藥敏試驗

將革蘭氏染色鑒定為Hps陽性的菌株進行擴增，其后將菌液梯度稀釋至106cfu/mL，每個平板均勻涂布100 μL稀釋液。將平板于37 ℃恒溫箱內(nèi)放置10 min使其表面稍干，向平板貼上含有不同抗生素的藥敏紙片（共12種），每個平板貼4種紙片。將貼加藥敏紙片的平板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，然后使用游標卡尺計算各藥敏紙片的抑菌圈大小，依據(jù)抑菌圈直徑來初步判斷該菌株對紙片對應抗生素是否具有耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 河北省不同地區(qū)臨床樣品Hps檢測結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共371個豬場的887份樣品檢測為Hps陽性，場陽性率和樣品陽性率分別為55.87%和31.19%；其中2020年和2021年送檢樣品豬場場陽性率分別為60.20%和49.03%，樣品陽性率分別為37.97%和21.69%。進一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)場陽性率為49.48%～62.50%，樣品陽性率為19.94%～56.58%。詳見表1。

表1 河北省不同年份和地區(qū)臨床樣品Hps檢測結(jié)果

2.2 河北省不同季節(jié)及發(fā)育階段豬群Hps檢測情況

為進一步分析不同季節(jié)來源組織樣品Hps檢測情況，本研究于春季、夏季、秋季和冬季采集樣品數(shù)量分別為650份、906份、841份和447份，其中陽性樣品數(shù)量分別為146份、348份、271份和122份，陽性率分別為22.46%、38.41%、32.22%和27.29%；對于不同發(fā)育階段豬群而言，仔豬群Hps陽性率最低，為16.43%（34/207），而后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬群Hps陽性率相對較高，分別為50.62%（244/482）和57.24%（257/449）。詳見表2。

表2 河北省不同季節(jié)及發(fā)育階段豬群Hps檢測情況

2.3 細菌分離及藥敏試驗

隨機從不同地區(qū)選擇34份Hps陽性樣品用于細菌分離鑒定，將組織樣品處理后取上清液于TSA平板上進行劃線。培養(yǎng)24 h后可見平板劃線出現(xiàn)針尖狀透明菌落，為露珠狀；取單一菌落進行革蘭氏染色，可見陰性、有莢膜的桿菌，可鑒定為Hps。

對分離獲得的34株Hps分離株進行藥敏試驗，結(jié)果如表3所示：大部分Hps分離株對青霉素、卡那霉素和復方新諾明耐藥，其耐藥率分別為79.41%、61.76%和79.41%；所有分離株對頭孢噻肟敏感，大部分菌株對頭孢曲松、氟苯尼考、米諾沙星和阿米卡星敏感，比例分別為91.18%、88.24%、85.29%和55.88%。

表3 Hps分離菌株藥敏試驗統(tǒng)計結(jié)果 株

3 討論

近年來，國內(nèi)生豬養(yǎng)殖逐漸由散養(yǎng)、小規(guī)模養(yǎng)殖向集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖轉(zhuǎn)變；生豬養(yǎng)殖模式的改變導致多種疾病頻發(fā)，其中包括副豬嗜血桿菌病。Hps是豬呼吸道的常見菌，一般情況下感染Hps的豬群不會出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，這也在一定程度上導致Hps在豬場廣泛流行。若豬群免疫力下降，Hps感染則可導致病豬出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，如關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等，因此Hps的流行嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。此外，對于副豬嗜血桿菌病的防治主要依賴于抗菌藥的使用，但抗菌藥的不合理使用會導致多重耐藥Hps菌株出現(xiàn)，這不利于豬場副豬嗜血桿菌病的防控。因此，了解豬場副豬嗜血桿菌的流行及耐藥情況對該病的綜合防制意義重大。

本研究于2020—2021年調(diào)查了河北省部分地區(qū)豬場副豬嗜血桿菌流行情況和分離株耐藥情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)664個豬場共2 844份組織樣品中有371個豬場的877份樣品為Hps陽性，其場陽性率和樣品陽性率分別為55.87%和31.19%，其中不同地區(qū)樣品陽性率19.94%～56.58%。趙美雪等于2017—2018年調(diào)查了河南省不同地區(qū)1 060份無害化場病料Hps陽性率，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)病料群體陽性率和樣品陽性率分別為69.78%和35.94%[6]；周政等調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)湖南省湘潭縣健康豬群Hps隱性感染率為22.5%（27/120）[2]。以上結(jié)果表明，Hps在我國豬群流行情況十分嚴重，需要引起養(yǎng)豬企業(yè)（戶）的重視。進一步分析發(fā)現(xiàn)2020年和2021年河北省部分地區(qū)Hps檢出率分別為37.97%和21.69%，養(yǎng)殖場為防控非洲豬瘟而提高了豬場生物安全水平，這在一定程度上也抑制了Hps的流行。此外，對于不同發(fā)育階段豬群而言，我們發(fā)現(xiàn)Hps檢出率與豬群年齡呈一定的正相關(guān)性，這與李天艷等調(diào)查結(jié)果一致[7]?？赡苁怯捎贖ps一般為隱性感染，且該病原廣泛分布于豬場，故高齡豬群接觸并感染Hps幾率較低齡豬群更高。對于不同季節(jié)而言，我們發(fā)現(xiàn)春季、冬季較夏季、秋季來源樣品Hps檢出率低，這可能是夏季和秋季氣溫較高，更加有利于Hps在外界傳播和感染生豬等。但總體而言，四季Hps檢出率均較高，提示豬場應該重視該病的防控工作。

進一步細菌藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，Hps分離株對不同抗生素耐藥性存在差異，但大部分菌株對青霉素、卡那霉素和復方新諾明等抗生素存在耐藥性，這可能與此類抗生素經(jīng)常用于豬場防控細菌疾病等有關(guān)；大部分或所有菌株對頭孢曲松、氟苯尼考、米諾沙星和頭孢噻肟敏感，提示此類抗菌藥物是防控副豬嗜血桿菌病的首選藥物。值得注意的是，本研究僅選擇了12種常見抗菌藥進行藥敏試驗，Hps分離株對其他抗菌藥的耐藥性還需要進一步研究。此外，Hps存在多種血清型，不同血清型Hps菌株對生豬的毒力和致病力等也存在差異，因此后續(xù)研究中還應該檢測Hps分離株的血清型等。