一例豬輪狀病毒感染引起仔豬腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷與防制

葛生虎，高明艷

（1.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺(tái) 054000；2.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，青海 西寧 812100）

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, PoRV）屬于呼腸病毒科、輪狀病毒屬重要成員，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要傳染性病原之一[1]。豬輪狀病毒在我國不同地區(qū)廣泛分布，但多以散發(fā)或局部暴發(fā)為特征，且主要發(fā)生于冬季和春季等寒冷季節(jié)[2]。不同發(fā)育階段豬群對(duì)PoRV均易感，但仔豬感染該病原后出現(xiàn)的臨床癥狀最明顯且嚴(yán)重，主要為水樣腹瀉、脫水和嘔吐等，且病死率較高；成年豬群（母豬、肥育豬等）感染該病不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但處于隱性感染階段，且可對(duì)外排毒，也會(huì)對(duì)其它健康豬群造成威脅[3]。

可導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原種類繁多，其中最常見的腸道腹瀉相關(guān)病毒包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）和豬德塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）等。自2010年以來，PEDV變異株廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且目前豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）仍然是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要腸道病毒性疾病[4]。這使得大部分養(yǎng)殖人員當(dāng)仔豬發(fā)生腹瀉時(shí)首先想到的便是PED，而忽略了PoRV、PDCoV感染等“少見”疾病的存在，繼而可能因誤診而延誤疾病最佳防控期。

2022年4月初，河北石家莊某養(yǎng)殖合作社豬場仔豬出現(xiàn)腹瀉疫情，為確診病因，該場迅速將腹瀉仔豬送至河北銘諸生物科技有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。在排除了該場仔豬發(fā)病不是PEDV、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）等感染引起的情況下，我們檢測了其它“少見”病原，最終確定為PoRV感染；進(jìn)一步擴(kuò)增與分析該毒株的VP7基因序列，確定該毒株為基因9型（G9）。確定病因后采取一系列防控措施，最終使疫情得到有效控制。

1 發(fā)病豬場

河北省石家莊平山縣某養(yǎng)殖專業(yè)合作社飼養(yǎng)能繁母豬300余頭，2022年4月初該豬場產(chǎn)房個(gè)別欄舍仔豬出現(xiàn)腹瀉。其主要臨床癥狀為：發(fā)病仔豬初期采食量下降、精神萎靡且輕微嘔吐等；后期嚴(yán)重腹瀉，且糞便為黃色或黑色帶血絲，嚴(yán)重脫水等。截至4月10日，該場有200余頭初生仔豬腹瀉，盡管采取了對(duì)癥治療，但病死率仍然近80%。

咨詢?cè)搱龅呢?fù)責(zé)人得知，該場之前發(fā)生過一次類似的腹瀉疫情，但對(duì)豬群免疫接種腹瀉三聯(lián)滅活疫苗（PEDV+TGEV+PoRV）后控制了疫情。當(dāng)前該場已對(duì)豬群免疫接種了常規(guī)疫苗，其中包括針對(duì)豬偽狂犬病、豬口蹄疫、豬瘟、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、細(xì)小病毒病和乙腦等多種疫苗，但卻忽視了接種針對(duì)腸道腹瀉病毒病的相關(guān)疫苗。

2 臨床癥狀及病理變化

觀察腹瀉仔豬整體狀況，發(fā)現(xiàn)仔豬極度消瘦（圖1A），且仔豬因持續(xù)腹瀉臀部肌肉松弛，粘滿黃色糞便（圖1B），地面多處可見黃白色糞污或嘔吐物（圖1C和圖1D）。剖檢發(fā)現(xiàn)病變主要出現(xiàn)于小腸，可見腸壁脹氣且薄，腸系膜淋巴結(jié)腫大充血等，胃內(nèi)有大量未消化的乳凝塊。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

為確定發(fā)病原因，采集4頭嚴(yán)重腹瀉仔豬小腸組織樣品送至河北銘諸生物科技有限公司，分別進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和常見病毒性病原診斷。

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

在超凈工作臺(tái)下，使用滅菌眼科剪剪開腸道深層組織，用火焰灼燒并冷卻的接種環(huán)蘸取少量組織液分別在鮮血固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面平板劃線。其后將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，觀察培養(yǎng)基表面是否出現(xiàn)疑似菌落。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4份樣品在2種培養(yǎng)基表面均未出現(xiàn)疑似菌落，提示該豬場發(fā)病并非細(xì)菌病感染引起。

3.2 病毒性病原診斷結(jié)果

用滅菌手術(shù)刀和手術(shù)剪切取少量腸組織放入2.0 mL離心管內(nèi)，加入少量生理鹽水和鋼珠，低溫高速勻漿并反復(fù)凍融3次，低溫離心后取上清液保存于-80 ℃，待檢。取200 μL上清液使用商業(yè)化DNA/RNA基因組提取試劑盒進(jìn)行核酸（DNA和RNA混合物）提取，并使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將核酸中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)病料送檢員要求，使用商業(yè)化試劑盒以real-time PCR法分別檢測4份樣品中是否存在PEDV、PRV、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PRRSV（藍(lán)耳病病毒）、CSFV和PDCoV核酸，結(jié)果以上病原均為陰性。隨后在筆者建議下，我們?cè)俅螜z測TGEV（傳染性胃腸炎病毒）和PoRV核酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4份樣品TGEV核酸均為陰性，但PoRV核酸均為陽性，且CT值為22～25。根據(jù)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，我們判定該場仔豬腹瀉是PoRV感染引起的。

3.3 PoRV毒株VP7基因序列RT-PCR擴(kuò)增、測序與分析

為確定該場流行PoRV毒株基因型及遺傳變異情況，根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]合成擴(kuò)增PoRV毒株VP7基因序列特異性引物，引物序列為：VP7-F：5'-GGCTTTAAATGAGAGAATTTCCGTCTGG-3'；VP7-R：5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAA G-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 062 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以RT-PCR法體外擴(kuò)增1份CT較低核酸樣品VP7基因序列，其擴(kuò)增體系（50 μL）包括2×PCR預(yù)混液25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL及雙蒸水18.0 μL；RT-PCR擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后以72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后取RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，其結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增得到的PoRV毒株VP7基因序列產(chǎn)物大小約1 000 bp，與已知陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，提示我們成功擴(kuò)增得到PoRV VP7基因序列。其后將該產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

測序結(jié)果拼接后去除前后不準(zhǔn)確序列，將最終序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該毒株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的PoRV G9型中國株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，為99.8%，與其它PoRV G9型毒株VP7基因序列同源性均高于95%；但與其它基因型PoRV毒株同源性較低，由此推測該豬場暴發(fā)的PoRV毒株屬于G9型。

4 防控措施制定與實(shí)施

確定該場仔豬發(fā)生腹瀉是由PoRV G9型感染引起后，我們采取系列措施用于防控該?。?）將發(fā)病仔豬與假定健康豬群隔離飼養(yǎng)，同時(shí)將無治療意義的腹瀉仔豬撲殺，并無害化處理；給予發(fā)病較輕仔豬進(jìn)行對(duì)癥治療，如提供富含電解質(zhì)飲水防止仔豬脫水；提高產(chǎn)房溫度減少仔豬體溫?fù)p失；給仔豬灌喂抗生素防止繼發(fā)細(xì)菌病感染等；2）對(duì)該場豬群緊急免疫接種腹瀉病毒三聯(lián)弱毒疫苗，仔豬出生后保證足量且優(yōu)質(zhì)的初乳，減少母豬應(yīng)激等；3）對(duì)豬舍內(nèi)外環(huán)境反復(fù)消毒；在豬舍過道鋪撒生石灰等保持豬舍干燥；實(shí)行“全進(jìn)全出”管理體制等。

實(shí)施以上防制措施后，當(dāng)時(shí)腹瀉仔豬死亡率仍然較高，但較未采取措施之前低；其后初生仔豬的死亡率極大降低，且豬場生產(chǎn)成績逐漸恢復(fù)正常。

5 討論

可導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原種類繁多，但大部分養(yǎng)殖戶認(rèn)為當(dāng)前引起仔豬腹瀉的腸道病毒主要是PEDV和PDCoV等[5]，而忽略了TGEV、PoRV等“不常見”病原。就目前而言，針對(duì)PED的弱毒或滅活疫苗已廣泛應(yīng)用于我國豬場，這使得PEDV在豬場流行情況有所緩解，也導(dǎo)致其它腸道病毒導(dǎo)致仔豬腹瀉比例逐漸提高。王成等調(diào)查結(jié)果表明，2021年春季湘西地區(qū)仔豬腹瀉樣品PoRV檢出率達(dá)25.08%（76/303），且未檢出PEDV、TGEV和PDCoV等常見腸道病毒，這說明PoRV是導(dǎo)致該地區(qū)仔豬腹瀉的主要腸道病毒[3]。若豬場發(fā)生仔豬腹瀉，養(yǎng)殖場應(yīng)盡可能檢測多種病原，防止漏檢、延誤疾病最佳治療期。

為進(jìn)一步確定該場PoRV流行株基因型特征，我們擴(kuò)增并分析該毒株的VP7基因序列特征，發(fā)現(xiàn)該毒株VP7基因序列與PoRV G9型中國株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，提示該毒株可能為G9型，以上試驗(yàn)結(jié)果為該病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

由于目前暫無針對(duì)豬輪狀病毒病的特效藥物，因此對(duì)該病的防治應(yīng)以對(duì)癥治療和疫苗接種為主。盡管我們采取了系列措施對(duì)腹瀉仔豬進(jìn)行治療，但仍然有部分腹瀉仔豬死亡，說明仔豬感染該病后一般治療效果較差。但對(duì)產(chǎn)前母豬免疫接種疫苗后，初生仔豬攝取足夠的母源抗體后對(duì)該病的防控效果較好。值得注意的是，成年豬群對(duì)PoRV也十分敏感，雖然感染該病后不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但仍然可對(duì)外排毒，繼而威脅其它健康豬群[3]。因此對(duì)于PoRV的防控應(yīng)盡量對(duì)所有豬群免疫接種疫苗，同時(shí)提高飼養(yǎng)管理水平等。