張 靜 孫升云 葛茂功 朱詩平 馮偉峰
腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis,RIF)指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物等的作用下,細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)大量堆積,RIF是導(dǎo)致腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵因素[1],它是各種原因?qū)е履I臟疾病進(jìn)展到慢性腎臟病的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是致纖維化的關(guān)鍵路徑[2]。慢腎康寧是在臨床上用來治療慢性腎衰的經(jīng)驗(yàn)方,取得了較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺嘌呤誘導(dǎo)的以腎間質(zhì)纖維化為主要病理表現(xiàn)的慢性腎臟病大鼠模型觀察慢腎康寧對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟病理形態(tài)學(xué)、Smad2、P-smad2及SARA蛋白表達(dá)的影響,探討慢腎康寧保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。
1.1 一般材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康、雄性Wistar大鼠60只(體質(zhì)量160~200 g,清潔級,由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號scxk粵2006-004)。
1.1.2 主要試劑Smad2、P-smad2抗體由Cell Signaling Technology公司提供,SARA抗體由Epitomic公司提供。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥慢腎康寧使用顆粒劑由黃芪30 g,黨參15 g,麥冬12 g,淫羊藿20 g,生地黃12 g,丹參10 g,大黃9 g,山萸肉 9 g,茯苓15 g,海螵蛸15 g組成。該藥由三九醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),購于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。上藥按比例稱取后,每日沖服。氯沙坦鉀片(科素亞,100 mg /片)由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號:H20000371)。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物模型和分組動(dòng)物隨機(jī)分為正常組,模型組(給予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服),氯沙坦組,慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組,每組10只。根據(jù)大鼠的用藥量(mg/kg)= 臨床常用量(mg/kg)×老鼠等效面積系數(shù)(6.25)。以此公式結(jié)果為中劑量,按15 g/(kg·d)給藥。低劑量為中劑量的一半[7.5 g/(kg·d)],高劑量為中劑量的2倍[30 g/(kg·d)]。氯沙坦給予10 mg/(kg·d)經(jīng)口灌服。共給藥21 d。
1.2.2 標(biāo)本收集治療21 d結(jié)束后稱量各組大鼠體質(zhì)量,當(dāng)天用代謝籠收集大鼠24 h尿液,記錄24 h尿量。第22天于采用戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采集血液,同時(shí)迅速取雙側(cè)腎臟組織,取左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定進(jìn)行病理學(xué)觀察;另留取部分置于-80 ℃冰箱保存,進(jìn)行蛋白的提取、測定。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 生化指標(biāo)的測定檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN), 24 h尿微量蛋白(24 h MTP)取樣送暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科測定。
1.3.2 病理學(xué)染色腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水,石蠟包埋制成切片,進(jìn)行HE染色及Masson染色。
1.3.3 Smad2 P-smad2及SARA蛋白分析取-80 ℃保存的腎組織100~150 mg,經(jīng)RIPA蛋白裂解液成勻漿,4 ℃,12 000 g離心2 min,取上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度,每泳道上取變性的蛋白各10 μl/孔,蛋白質(zhì)經(jīng)10%或8%SDS-PAGE垂直凝膠進(jìn)行電泳。恒壓下將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h或4 ℃過夜,一抗4 ℃過夜,二抗37 ℃ 孵育2 h。每步驟后均經(jīng)TBST漂洗,10 min×3次。最后加ECL發(fā)光試劑,雜交信號在Imagetool圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行吸光度分析。
2.1 腎臟組織HE染色情況HE染色在正常組大鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)皆正常,組織結(jié)構(gòu)無明顯病理變化。模型組大鼠腎臟組織內(nèi)見大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死,部分腎小管擴(kuò)張;腎間質(zhì)與腎小管界限不清,腎間質(zhì)內(nèi)有大量纖維組織增生、肉芽形成,并有大量炎癥細(xì)胞浸潤;腎間質(zhì)、腎小管內(nèi)有大量褐色結(jié)晶物沉積;病變腎小球有不同程度的硬化、萎縮,甚至壞死,部分腎小球呈代償性擴(kuò)張。慢腎康寧各劑量組腎組織內(nèi)也可見炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化,腎小管萎縮、壞死、擴(kuò)張,腎小管及間質(zhì)內(nèi)有褐色結(jié)晶物沉積等改變,但程度輕于模型組。見圖1。
圖1 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響 (HE染色,×200)
2.2 腎臟組織Masson染色情況正常組腎組織皮質(zhì)、髓質(zhì)皆正常,腎小球、腎小管無結(jié)構(gòu)改變,腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)無異常改變,個(gè)別間質(zhì)含有少量的膠原纖維。模型組:腎間質(zhì)面積明顯增大,小管萎縮或擴(kuò)張情況明顯,腎小球及腎間質(zhì)有明顯的膠原纖維聚集,棕黃色結(jié)晶顆粒占據(jù)整個(gè)腎小管,腎小球中亦有較多沉積。與模型組相比,慢腎康寧各劑量組間質(zhì)纖維化均有不同程度的減輕,腎小管萎縮或擴(kuò)張情況不同程度好轉(zhuǎn),腎間質(zhì)的面積明顯縮小,棕黃色顆粒在腎小球、腎小管沉積明顯減少;慢腎康寧高劑量組間質(zhì)纖維化改變與氯沙坦組接近。見圖2。
圖2 慢腎康寧對RIF大鼠腎組織病理學(xué)變化的影響 (Masson染色,×200)
2.3 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP及eGFR影響模型組Scr、BUN和24 h MTP都明顯高于正常組(P<0.05);慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組及氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP都明顯低于模型組(P<0.05);其中,慢腎康寧高劑量組與氯沙坦組Scr、BUN和24 h MTP差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明慢腎康寧和氯沙坦在降低Scr、BUN和24 h MTP的療效相當(dāng)。 見表1。
表1 慢腎康寧對RIF大鼠血Scr BUN 24 h MTP eGFR的影響 (只,
2.4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白相對表達(dá)量影響模型組大鼠腎臟Smad2、P-smad2蛋白表達(dá)水平均升高,與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組Smad2蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.01);低劑量組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢腎康寧高劑量組、中劑量組、低劑量組和氯沙坦組P-smad2蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)。模型組SARA蛋白表達(dá)較正常腎組織顯著升高(P<0.01);慢腎康寧高劑量組、中劑量組和氯沙坦組SARA蛋白表達(dá)較模型組增加(P<0.01);低劑量組與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2,圖3~圖5。
表2 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2 P-smad2及SARA蛋白表達(dá)影響
圖3 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織Smad2蛋白表達(dá)的影響
圖4 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織P-smad2蛋白表達(dá)的影響
圖5 慢腎康寧對RIF大鼠腎臟組織SARA蛋白表達(dá)的影響
研究證實(shí),慢性腎病患者人數(shù)在世界范圍內(nèi)已達(dá) 6.975 億,中國患病人數(shù)占18.97%,達(dá)到了1.323 億人[3],但是對于大多數(shù)已經(jīng)進(jìn)入終末期腎病的慢性腎病患者,透析和腎移植是惟一選擇,據(jù)統(tǒng)計(jì),6%的患者在等待移植中即已死亡,能接受腎移植的患者只有25%[4]。腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)進(jìn)展到終末期腎臟病(End Stage Renal Disease,ESRD)的共同表現(xiàn)和病理基礎(chǔ),這一觀點(diǎn)已得到專家一致認(rèn)可[5]。阻斷腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Tubular Epithelial To Mesenchymal Transition,TEMT) 可以有效延緩慢性腎臟病的腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程[6],下調(diào)TGF-β1/ Smad信號傳導(dǎo)通路,可以有效減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚[7-9]。
根據(jù)慢性腎臟病的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn),可歸屬于中醫(yī)水腫、癃閉、關(guān)格等范疇。病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí),正不勝邪,本虛以脾腎兩虛為主,標(biāo)實(shí)以濕濁、痰濁、水毒為主。慢腎康寧中以黃芪、淫羊藿、山萸肉益氣補(bǔ)腎,腎氣、腎陽充盛則氣化固攝功能可復(fù),津液代謝正常;丹參、生地黃益腎、活血涼血祛瘀,改善血液循環(huán);麥冬歸肺經(jīng),助黃芪以益肺祛痰濕以益元陽;山藥益氣養(yǎng)陰,平補(bǔ)三焦,大黃通腑降濁,既防黨參、黃芪、淫羊藿等補(bǔ)藥壅滯,又佐眾滋補(bǔ)藥之溫。全方攻補(bǔ)兼施,標(biāo)本同治,共奏益氣補(bǔ)腎,活血養(yǎng)血,通腑瀉濁之功效[10]。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明慢腎康寧可以改善CKD大鼠的一般形態(tài),降低尿蛋白,減少Scr、BUN、24 h MTP,減輕大鼠腎臟組織病理損傷,保護(hù)腎功能,延緩腎損害進(jìn)程,其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[11]。
Smad2作為TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)特有的作用底物介導(dǎo)了信號由細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核,Smad2/3蛋白的磷酸化代表了TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路的激活[12],抑制P-Smad2/3的表達(dá)可減緩RIF進(jìn)程[13]。SARA與Smad2和Smad3的磷酸化有關(guān)[14],在Smad2/Smad3和TGF-β受體之間起到橋梁作用,靶向SARA可以調(diào)控TGF-β的靶效應(yīng),從而具有潛在的治療價(jià)值[15]。已有研究證實(shí)[16],SARA通過調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞Smad2和Smad3的激活來調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的EMT和ECM排泄,以此推論SARA可能在EMT前狀態(tài)下成為潛在的新型靶標(biāo),以改善在慢性腎臟疾病中發(fā)現(xiàn)的腎纖維化。
本實(shí)驗(yàn)選用陽性對照藥物氯沙坦,能減少蛋白尿,阻斷腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展,改善慢性腎臟病的預(yù)后,是目前臨床上運(yùn)用明確有效的降壓保腎藥物[17,18]。前期的研究顯示[19]:氯沙坦具有使Smad7 mRNA的表達(dá)增加,干預(yù)了TGF-β1/Smads信號通路的傳遞,延緩了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。
本實(shí)驗(yàn)觀察到,在正常腎組織,Smad2和P-smad2蛋白呈低水平表達(dá),在模型組中的表達(dá)均增加,提示Smad2蛋白參與了腎臟纖維化的過程;各治療組的Smad2和P-smad2蛋白的表達(dá)低于模型組,提示藥物治療能降低Smad2和P-smad2蛋白的表達(dá)。SARA蛋白在正常腎組織高水平表達(dá),在腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織中的表達(dá)均減少,各治療組的SARA蛋白的表達(dá)高于模型組。由此可以推測,慢腎康寧可能是通過降低Smad2和P-smad2蛋白及升高SARA蛋白的表達(dá),抑制TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路,減少ECM的進(jìn)行性積聚,從而延緩腎纖維化進(jìn)程。