長鏈非編碼RNA異常表達對急性髓系白血病預后影響的meta分析

林紅麗 盧曉慶 李有杰 孫允霄

1濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院兒科，煙臺 264100；2濱州醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，煙臺 264003

急性髓系白血病（AML）是成人中最常見的白血病，約占80%，兒童AML約占20%［1-2］。其特征是骨髓中未分化和無功能造血細胞（白血病母細胞）異常增殖［3］。幾十年來，AML標準強化治療一直是“7+3”方案，但由于診斷年齡中位數(shù)在60～70歲之間，許多AML患者沒有資格接受強化治療。另外，25%～55% AML患者會出現(xiàn)造血干細胞移植（HSCT）后復發(fā)。AML患者5年生存率令人沮喪，只有28.3%，2019年約有10 920人死于AML。AML預后通常被描述為“可怕”或“差”。作為一種異質性疾病，AML具有廣泛細胞遺傳學和分子異常［4-6］。因此，迫切需要尋找準確、安全、可靠的生物標志物或治療靶點協(xié)助AML早期診斷、治療以及預后監(jiān)測。

人類基因組最終序列于2003年公布，科學界感到驚訝的是，只有一小部分（1.2%）人類遺傳物質信使RNA（mRNA）被發(fā)現(xiàn)編碼蛋白質，其余的RNA都屬于非編碼RNA（ncRNA）［7-8］。ncRNA參與了細胞內(nèi)無數(shù)調(diào)節(jié)過程，例如調(diào)節(jié)基因表達、保護基因組免受外源DNA影響、控制DNA合 成 等［9-10］。ncRNA根 據(jù) 長 度 分 為 小 非 編 碼RNA（sncRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）［11］。lncRNAs是指長度超過200個核苷酸非蛋白質編碼RNA轉錄本［12］。它們可以在表觀遺傳學（如DNA甲基化、組蛋白修飾）、轉錄（如轉錄因子的募集）、轉錄后［如微小RNA（miRNA）和mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)］水平上調(diào)節(jié)基因表達［13］。lncRNAs在各種類型的人類疾病中表達失調(diào)或異常，尤其與各種腫瘤發(fā)生密切相關，血液系統(tǒng)惡性腫瘤也不例外［14-15］。研究表明，lncRNAs如HOX轉錄反義基因間RNA（HOTAIR）、小核仁RNA宿主基因5（SNHG5）、小核仁RNA宿主基因12（SNHG12）、?；撬嵘险{(diào)基因1（TUG1）、HOXA簇反義RNA 2（HOXA-AS2）、鋅指同源框2反義RNA 1（ZEB2-AS1）、CDKN1A反義DNA損傷激活RNA啟動子（PANDAR）、母系表達基因3（MEG3）、轉移相關肺腺癌轉錄物1（MALAT-1）、生長停滯特異性轉錄本5（GAS5）、IGF1R反義基因內(nèi)非編碼RNA（IRAIN）都參與了AML發(fā)生和發(fā)展，并影響其預后。但lncRNAs異常表達與AML患者預后關系仍存在爭議，并缺乏詢證學證據(jù)支持。因此，本研究采用meta分析方式評估異常表達lncRNAs在AML中預后價值。

資料與方法

1、檢索策略

檢索美國國立醫(yī)學圖書館（PubMed）、荷蘭醫(yī)學文摘數(shù)據(jù)庫（Embase）、循證醫(yī)學數(shù)據(jù)庫（Cochrane）中與lncRNAs表達與AML預后相關的公開發(fā)表所有文獻，時間截至2021年10月6日。采取主題詞與自由詞相結合的方式，檢索的關鍵詞包括“l(fā)eukemia，myeloid，acute”“RNA，long noncoding”“prognosis”等，具體檢索策略：（leukemia，myeloid，acute或acute myeloid leukemia或acute myeloid leukemias或leukemias，acute myeloid或myeloid leukemias，acute等）和（RNA，long noncoding或long untranslated RNA或noncoding RNA，long或lncRNA或long ncRNA或ncRNA，long或RNA，long non-translated等）和（prognosis或predictor或death或diagnosed等）。為避免相關文獻的遺漏，同時對所獲取文獻的參考文獻做進一步檢索。搜索僅限于以英文發(fā)表的人類研究。

2、納入和排除標準

（1）文獻納入標準：①納入研究人員確診為AML。②分析了lncRNA的表達與AML預后之間的關系，包括總體生存率（OS）、無白血病生存率（LFS）、無事件生存率（EFS）、無復發(fā)生存率（RFS）、無病生存率（DFS）。③實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（RT-qPCR）等方法測定lncRNAs表達。④文獻清楚列出lncRNAs具體類型。⑤文獻中l(wèi)ncRNAs由高表達和低表達組成，且有具體截點值。⑥統(tǒng)計分析中納入了根據(jù)主要臨床因素調(diào)整的多變量比例風險模型。⑦提供了足夠的數(shù)據(jù)來提取或計算危險比（HRs）和95%置信區(qū)間（CIs）。⑧提供具體的隨訪時間。⑼無國籍、種族、性別、年齡等限制。（2）排除標準：①重復發(fā)表文獻（數(shù)據(jù)重復文獻選擇最新報道）。②系統(tǒng)評價、會議記錄、報告、meta分析。③細胞和動物實驗。④數(shù)據(jù)不足以提取或計算HRs和95%CIs。⑤未報告AML結局，或不能從文獻中提取結局數(shù)據(jù)。⑥不能獲取全文或全文信息不足的文獻。⑦無原始數(shù)據(jù)文獻。⑧文獻語種非英文。

3、納入文獻特點

在數(shù)據(jù)庫中共檢索到268篇文獻，經(jīng)過納入和排除標準篩選后，最終納入13篇文獻，篩選流程圖見圖1。共1 591例，其中1 354例來自中國，64例來自伊朗，173例來自癌癥基因組譜圖（TCGA），涵蓋了白種人、黃種人、黑種人等，包含13種lncRNA，涵蓋3種亞型。其中1項研究納入的為急性白血?。ˋL）患者，包含73例AML和23例急性淋巴細胞白血?。ˋLL），考慮到本文獻中的大多數(shù)患者是AML患者，在衡量后將此文獻納入本研究。12項研究納入的為新診斷患者，1項研究則為難治/復發(fā)患者。13項研究都報道了lncRNA和OS之間的關系，其中2項研究報道了lncRNA和EFS之間關系，3項研究報道了lncRNA和RFS之 間 關 系，1項研究報道了lncRNA和DFS之間關系，1項研究報道了lncRNA和LFS之間關系。12項研究以中值作為截點值，僅1項研究將HOTAIR/GAPDH作為截點值。用于檢測lncRNA的樣本來源于外周血（PB）和/或骨髓（BM）。評估研究質量的紐卡斯爾-渥太華質量評估量表（NOS）評分在7～8分之間，均大于6分。

圖1 文獻篩選流程圖

4、數(shù)據(jù)提取和質量評價

數(shù)據(jù)提取由2名研究者按照數(shù)據(jù)提取表獨立進行，如遇分歧，由第3名研究者最終決定。數(shù)據(jù)提取內(nèi)容包括：第一作者、年份、研究區(qū)域、研究人數(shù)、年齡、lncRNA種類、lncRNA測定方法、表達截點值、隨訪時間、結局指標、階段、疾病類型、標本來源，OS、EFS、RFS、DFS、LFS的HR及其95%CI，其中OS為主要結局指標，具體見表1。以OS、EFS、RFS、DFS、LFS 作為 meta 分析的終點指標。HR及 95%CI從文獻中直接提取，若未直接提供，則運用Engauge Digitizer4.1 提取所需數(shù)據(jù)再通過計算間接獲得OS、EFS、RFS、DFS、LFS 的HR及其 95%CI［29］。使用紐卡斯爾-渥太華量表（NOS）對所納入研究進行文獻質量評價［30］。NOS 量表評分≥6分的文獻被認為是高質量研究（表2）。

表1 納入文獻基本信息

表2 納入文獻的紐卡斯爾-渥太華質量評估

5、統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件Review Manager 5.3 合并效應量，繪制森林圖進行meta分析，對納入13項研究的HRs及其95%CIs統(tǒng)計分析，評估lncRNAs 異常表達水平與AML 預后之間的關系。LogHR和標準誤（SE）用于生存結果匯總。Q 檢驗和I2用來對各項研究進行異質性檢驗，若Q 檢驗P＞0.1 且I2＜50%，證明各項研究之間無顯著異質性，可使用固定效應模型合并效應量；若Q 檢驗P≤0.1 且I2≥50%，研究之間具有顯著異質性，需用隨機效應模型合并效應量，進行亞組分析或敏感性分析對異質性原因進行查找，包括納入研究人員種族、年齡、樣本量、樣本來源、lncRNA 類型、結局指標、疾病類型等。根據(jù)I2值行異質性分度，I2超過25%、50%、75%時，提示分別有低度、中度、高度異質性，一般認為I2＞50%存在實質性異質性。敏感性分析判定合并結果是否穩(wěn)定。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。繪制漏斗圖考察本次研究是否存在發(fā)表偏倚，漏斗圖對稱意味著不存在發(fā)表偏倚。

結 果

1、lncRNAs異常表達與OS之間關系

納入 13 項研究［16-28］都對 lncRNAs 異常表達水平下的OS 進行了報道，作了多變量分析評估，經(jīng)異質性檢驗，I2=36%，且Q 檢驗的P=0.1，無顯著異質性，結果可信度高，選擇固定效應模型合并效應量，進行meta 分析（圖2），結果顯示，lncRNAs 異常表達與更差的 OS 相關（HR=1.81，95%CI1.55～2.12），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 01）。合并HR＞1 表明lncRNAs 異常表達與AML 的預后差相關。高表達SNHG5、SNHG12、HOTAIR、TUG1、HOXA-AS2、ZEB2-AS1、PANDAR、MALAT-1、GAS5 和低表達 MEG3、IRAIN 與 AML預后不良相關。由此可推斷，lncRNA 可作為判斷AML預后差的生物學標志物。

圖2 lncRNAs表達水平和AML患者OS關系的森林圖

納入研究中多篇文獻對HOTAIR 和TUG1進行了報道、以EFS 和RFS 為結局指標對AML 進行了預后分析，有多篇文獻所研究疾病類型均為非-急性早幼粒細胞白血?。跘ML（non-M3）］，針對以上情況，我們分別進行了相關亞組分析，以便更好地了解lncRNA 對AML 預后的影響和作為生物學標志物的提示意義。

2、lncRNAs異常表達與EFS、RFS之間關系

2 篇文獻以EFS 為結局指標報道了lncRNAs 表達與AML 預后關系，共 218 例，存在統(tǒng)計學異質性（P=0.07，I2=69%），采用隨機效應模型進行meta 分析（HR=1.62，95%CI0.90～2.91）（圖 3），MEG3 低表達和 HOTAIR 高表達之間EFS 差異無統(tǒng)計學意義（P=0.11）。因文獻數(shù)量較少，無法利用meta回歸、亞組分析和敏感性分析尋找異質性來源，根據(jù)本次分析結果，認為MEG3 低表達和HOTAIR 高表達與EFS不相關。

圖3 lncRNAs表達水平和AML患者EFS關系的森林圖

3 篇文獻以RFS 為結局指標分析了lncRNAs 表達與AML 預后關系，共302 例，研究間無統(tǒng)計學異質性（P=0.60，I2=0%），采用固定效應模型進行meta 分析（圖4），結果顯示IRAIN、HOXA-AS2、TUG1的異常表達間RFS差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 01），故IRAIN上調(diào)和HOXA-AS2、TUG1下調(diào)可致AML的RFS降低（HR=2.03，95%CI1.48～2.77）。

圖4 lncRNAs表達水平和AML患者RFS關系的森林圖

3、HOTAIR、TUG1高表達與OS之間關系

2 篇文獻針對HOTAIR 高表達與AML 預后作了相關分析，共181例，研究間無統(tǒng)計學異質性（P=0.60，I2=0%），采用固定效應模型進行meta分析（圖5），結果示HOTAIR高表達的OS 低，預后較差（HR=2.64，95%CI1.51～4.60），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 6）。2篇文獻報道TUG1高表達與AML預后關系，共259 例，研究間無統(tǒng)計學異質性（P=0.59，I2=0%），采用固定效應模型進行meta 分析（圖6），結果示TUG1 高表達的患者 OS 低，預后較差（HR=2.49，95%CI1.64～3.78），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。

圖5 lncRNA HOTAIR 表達水平和AML患者OS關系的森林圖

圖6 lncRNA TUG1表達水平和AML患者OS關系的森林圖

4、lncRNAs異常表達與non-M3 OS之間關系

5篇文獻探討了lncRNAs 異常表達與non-M3患者預后間關系，共770 例，研究間無統(tǒng)計學異質性（P=0.12，I2=45%），采用固定效應模型進行meta 分析（圖7），結果示lncRNAs 異常表達與non-M3 患者不良預后相關（HR=1.69，95%CI1.34～2.12），lncRNAs 的上調(diào)或下調(diào)都可致 AML（non-M3）的OS降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 01）。

圖7 lncRNAs表達水平和AML（non-M3）患者OS關系的森林圖

5、敏感性分析和發(fā)表偏倚

通過任意剔除納入本次研究文獻進行敏感性分析評價統(tǒng)計結果的穩(wěn)定性。結果顯示合并HR結果穩(wěn)定性好，任意刪除某篇文獻后不會影響本次研究結果，以上隨機效應運算結果是穩(wěn)定可靠的。漏斗圖可以比較直觀地目測納入文獻是否存在發(fā)表偏倚，利用統(tǒng)計軟件Review Manager 5.3 對OS 繪制漏斗圖評價納入文獻的發(fā)表偏倚情況，漏斗圖（圖8）上的點基本對稱地散開分布，表明納入本次研究的文獻不存在發(fā)表偏倚情況。

圖8 lncRNAs表達水平和AML患者OS相關性的漏斗圖

討 論

AML 是一種復雜血液系統(tǒng)惡性腫瘤，有遺傳和臨床異質性，由于聯(lián)合化療、HSCT、靶向藥物應用，AML 治療已經(jīng)取得很大進展，仍有相當數(shù)量AML 患者死于復發(fā)或對一線治療不耐受［31-32］。隨著診斷年齡增加，5 年生存率迅速下降［33］。AML 治療仍具挑戰(zhàn)性；迫切需要研究 AML 發(fā)生發(fā)展分子機制，探索AML預后、治療新靶點。

lncRNAs 在哺乳動物細胞中大量存在，主要由RNA 聚合酶Ⅱ轉錄，長期存在于許多組織和液體中，如在血液和尿液等人體體液中可找到lncRNAs，因此lncRNAs可以用作廣泛篩查疾病生物標志物［34-37］。lncRNAs 在過去幾十年中被認為僅僅是轉錄“噪音”，最近研究表明，lncRNAs 是基因關鍵調(diào)節(jié)因子，參與包括AML 在內(nèi)多種癌癥發(fā)生和發(fā)展［28，34，38-40］。lncRNAs影響分裂、生長和細胞分化途徑，參與細胞死亡過程，這些過程的修改可能會導致癌變。此外，一些lncRNAs 受癌基因產(chǎn)物或癌癥轉化抑制物調(diào)節(jié)，意味著它們有間接執(zhí)行致瘤功能［41］。我們的meta 分析研究了13 項隊列中1 591 人相關表達結果，與lncRNA 表達結果相關的 OS、RFS 和 EFS 合并HR值分別為 1.81（95%CI1.55～2.12）（I2=36%，P=0.1）、2.03（95%CI1.48～2.77）（I2=0%，P=0.60）、1.62（95%CI0.90～2.91）（I2=69%，P=0.07），OS 和RFS的異質性低，表明lncRNA 的異常表達可能是AML 預后生物標志物。lncRNA 異常表達提示AML（non-M3）不良預后，HR=1.69（95%CI1.34～2.12），異質性較低（I2=45%，P=0.12）。

HOTAIR 是發(fā)現(xiàn)最早、研究最徹底的lncRNA，長度 2 158 kb，位于HOXC 基因座反義鏈上［42］。它將多梳抑制復合物2（PRC2）招募到HOX 基因位點，通過染色質修飾來調(diào)節(jié) HOX 基因表達［43］。越來越多證據(jù)表明，HOTAIR 與不同類型癌癥密切相關，如胃癌、肝癌、乳腺癌等［44］；與完全緩解AML 和正常對照組相比，新發(fā)AML 患者HOTAIR 顯著上調(diào)；小干擾 RNA（siRNA）介導對 HL-60 和 K562 細胞中HOTAIR 的抑制導致細胞增殖顯著抑制，HOTAIR 基因敲除可以在體外抑制白血病細胞增殖；此外，在美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（NCCN）高危人群中，HOTAIR 表達明顯更高；高表達HOTAIR 與不良臨床病理預后分層有關［45］。我們亞組分析顯示，HOTAIR 過度表達與AML 較差預后相關，HR值為2.64（95%CI1.51～4.60），異質性很低（I2=0%，P=0.60）。這些發(fā)現(xiàn)表明，HOTAIR 可能在AML 進展調(diào)節(jié)中發(fā)揮直接作用，并可能作為AML 一種新的預后標志物，有希望成為AML治療新靶點［45］。

TUG1 被認為是一種新的癌基因，位于染色體22q12 上，在各種癌癥中高度表達，與癌癥患者晚期疾病狀態(tài)相關［46-47］。Wang 等［21］最近發(fā)表一項研究表明 lncRNA TUG1表達水平與AML患者EFS和OS呈負相關關系。AML患者中miR-193a-5p 表達明顯降低，且miR-193a-5p 具有抗白血病活性［48］。上調(diào)miR-193a-5p通過使PI3K/Akt通路失活而靶向Tspan3，從而抑制細胞增殖、侵襲和遷移能力，并導致 AML 細胞周期阻滯［49］。修復實驗證明，TUG1 通過調(diào)節(jié)miR-193a-5p/Rab10 軸調(diào)節(jié)AML 細胞存活和死亡。lncRNA TUG1 在AML 骨髓和細胞中上調(diào)，負向調(diào)控miR-193a-5p 表達，miR-193a-5p 過度表達致 AML 細胞的細胞活力降低和細胞死亡增加。Rab10 是miR-193a-5p 直接靶標，受到miR-193a-5p 反向調(diào)節(jié)，TUG1 通過上調(diào)Rab10 調(diào)節(jié)AML 細胞存活和死亡。lncRNA TUG1 沉默通過分泌miR-193a-5p和抑制Rab10對AML細胞系產(chǎn)生細胞毒性作用［50］。將TUG1 抑制劑模擬物和空白模擬物轉染到KG-1 細胞，評估細胞增殖和細胞凋亡率，結果顯示，lncRNA TUG1 敲除抑制了KG-1 細胞增殖，加速了KG-1 細胞凋亡，表明lncRNA TUG1 通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡參與AML 發(fā)病機制［46］。值得注意是，越來越多證據(jù)表明TUG1參與了癌癥化療耐藥性［51-52］。TUG1在包括AML在內(nèi)癌癥化療抵抗中作用已被證實。在阿霉素（ADR）耐藥AML組織和細胞中，TUG1 表達升高，通過表觀遺傳學調(diào)節(jié)miR-34a表達；TUG1基因敲除使AML細胞在體外和體內(nèi)對ADR 敏感［53］。本研究亞組分析顯示，TUG1 過度表達與AML 較差預后相關，HR值為2.49（95%CI1.64～3.78），異質性較低（I2=0%，P=0.59）。總之，TUG1在AML中起著關鍵作用，可能成為AML 發(fā)展、治療、和預后新生物標志物及治療靶點［53］。

SNHG5 位于染色體易斷點［54］。SNHG5 異常表達已在許多人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)，并作為致癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。例如，SNHG5 促進膠質瘤進展，但抑制胃癌進展［55］。最近一項研究報道稱，與健康對照組相比，AML患者骨髓和血漿中SNHG5表達水平始終較高，可作為AML潛在預后生物標志物［16］。全基因組lncRNA 表達研究也顯示，SNHG5 在AML 中異常過度表達。SNHG5 基因敲除可提高AML細胞對化療敏感性。SNHG5通過靶向AML中miR-32/DNAJB9 軸來調(diào)節(jié)化療耐藥，為AML 提供了一個新潛在靶點，揭示了化療耐藥重要機制［56］。

雖然制定了嚴格納入及排除標準，以下局限性不容忽視：（1）大多數(shù)AML 為中國人，研究結果不能代表所有人群；（2）不同lncRNAs 隨訪時間、疾病類型等不一致，這些因素可能會導致偏倚；（3）絕大多數(shù)研究偏向報道陽性結果，本研究在一定程度上可能高估了lncRNAs對于AML預后的意義；（4）納入研究均為回顧性隊列研究，缺乏前瞻性、多中心詢證醫(yī)學證據(jù)；（5）納入文獻均為以英文發(fā)表研究，發(fā)表偏倚無法消除。

本研究meta分析顯示，lncRNAs異常表達，如HOTAIR、TUG1、SNHG（SNHG5 和 SNHG12）高表達，提示 AML 患者OS降低，預后不良，尤其對于AML（non-M3）患者而言，結果明顯。lncRNAs 有望成為潛在預測AML 預后生物標志物，為AML 早期診斷、準確風險分層、闡明AML 發(fā)病機制和分子靶向治療提供理論依據(jù)。