三種不同土壤微生物初步分析

林 容，陳敘靜，趙麗娟，羅麗芬，曾興蓮

（昭通衛(wèi)生職業(yè)學院，云南 昭通 657000）

微生物是一群體型微小、結構簡單的微小生物的總稱，主要包括在自然界中真核細胞型微生物、原核細胞型微生物和非細胞型微生物。自然界中微生物的分布非常廣泛，如在空氣、水和土壤中都存在。由于土壤中營養(yǎng)物質豐富，是微生物生長和繁殖的天然培養(yǎng)基，所以土壤中所含的微生物種類繁多。土壤微生物泛指土壤中一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱，通常意義上包括古菌、細菌、放線菌、真菌、病毒、原生動物和顯微藻類等[1]。土壤微生物參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)過程并在其中發(fā)揮著關鍵作用，如養(yǎng)分吸收、碳氮循環(huán)、生物防治和生物修復等，同時土壤微生物還影響著植物的生長和群落組成。從整個生物地球化學過程來說，通過研究微生物的結構和功能多樣性，可以建立微生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能之間的聯(lián)系。

近年來，隨著生物學等技術的不斷發(fā)展和交叉，如活體熒光技術、PCR、生物標記物（FAME）及分子生物學技術、信息技術等新興技術和方法在土壤微生物研究中的應用，土壤微生物區(qū)系的相關研究應對全球氣候變化、治理各類環(huán)境污染、維持生態(tài)服務功能及促進土壤持續(xù)利用等方面具有重要意義。保持土壤微生物的多樣性對于人類農業(yè)生產(chǎn)亦具有極其重要意義[2]。

土壤微生物的研究在現(xiàn)在得到迅速發(fā)展，正成為一個新興的研究熱點。土壤微生物的研究對于探索自然生命機制、應對全球氣候變化、治理各類環(huán)境污染、維持生態(tài)服務功能及促進土壤持續(xù)利用等方面具有重要意義[1，3]。首先，土壤微生物影響土壤中的氣體成分，比如微生物通過呼吸作用，導致土壤中產(chǎn)生大量的CO2、CH4等氣體，這些氣體會對土壤的理化性質產(chǎn)生影響；其次，土壤微生物是改良土壤質量的關鍵因素。土壤微生物在土壤的養(yǎng)分和物質循環(huán)、形成和發(fā)育、肥力維持與提高的過程中起著重要的作用[4]，且土壤微生物種類和數(shù)量及群落結構等不僅能較早地預測土壤質量的變化，還是土壤健康的決定性因素，利用微生物指標指示土壤質量也已成為近年來國內外的研究熱點之一[4]。最后，對于環(huán)境保護、耕地改良和荒草地的開發(fā)利用都依賴于土壤及其微生物的研究，維護土壤微生物的種類和穩(wěn)定性已成為實現(xiàn)農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提之一[4]。對于各種極端環(huán)境，如各種濕地、鹽堿地和板結地的土壤微生物的研究也受到廣大學者的重視。另外，研究土壤微生物種類和數(shù)量還為有益菌的開發(fā)、利用提供了基礎。

前人的研究進展，土壤微生物研究已成為土壤研究中的一個熱點。丁俊男等[5]在《玉米-大豆輪作對土壤酶和根系微生物群落多樣性的影響》一文中指出輪作種植體系改善了根系土壤微生物群落結構組成，以及改變了根際土壤微生物群落功能利用能力。吳海燕等[6]保護性耕作條件下玉米田土壤微生物區(qū)系變化與影響因素分析中提到土壤微生物數(shù)量與土壤有機質、土壤全氮和全磷有關。馮健[7]在對巨桉人工林地下土壤微生物進行分析，發(fā)現(xiàn)細菌為其中的優(yōu)勢種群。孫樹晴等[8]研究表明土壤微生物區(qū)系組成及生物量影響土壤的肥力及土壤理化性質和植被影響土壤中微生物的生長。來航線等[9]在幾種微生物對土壤腐殖質形成的作用中證明各種類微生物在土壤腐殖質總量的形成中均起到積極作用。很多學者對于土壤微生物的研究都比較成熟，并且從多方面進行研究，雖然不同地方的土壤受當?shù)刈匀画h(huán)境，如溫度、濕度、降雨及受土壤本身因素的影響，但是筆者在盡量減少這些因素干擾所造成的影響，從土壤微生物差異去分析本地區(qū)的天然腐殖土和其他土壤的差異，這對于本地區(qū)土壤微生物的研究是十分必要的。

另外，腐殖土是森林中表土層樹木的枯枝殘葉經(jīng)過長時期腐爛發(fā)酵后而形成，腐殖土壤顆粒結構，透氣性能好，適合根系生長需要，并且具有較好的保水保肥能力，我國的土地很多出現(xiàn)了板結營養(yǎng)流失，通過對天然腐殖土微生物區(qū)系分析可以很好地了解腐殖土中微生物的種類，以便很好地對土地加以保護和利用，同時提供給培養(yǎng)植物、莊家等更好的營養(yǎng)物質。

從未來發(fā)展戰(zhàn)略看，我國土地資源豐富，土壤類型較多，但是有著許多在工業(yè)化進程中污染的土地、板結地及荒草地等有待開發(fā)利用。通過研究不同類型土壤中微生物的種類和數(shù)量的差異，在各種技術措施的作用下改善土壤微環(huán)境，以期改變土壤的肥力和質量，以更好地適應農業(yè)生產(chǎn)等的需要。因此，對土壤微生物的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

昭陽區(qū)是昭通市轄區(qū)，位于云南省東北部，在云南、四川、貴州三省交界處，東經(jīng)102.52°～105.18°，北緯26.18°～28.10°。海拔267～4 040 m，地處暖帶。氣候屬于北緯高原大陸季風氣候，溫暖濕潤。昭陽區(qū)全年平均氣溫在11.6 ℃，最冷氣溫出現(xiàn)在1 月，月平均氣溫在1～12 ℃之間；最熱溫度出現(xiàn)在7 月，月平均氣溫在20～27 ℃之間；年降水量735 mm。

1.2 樣地選擇

于2022 年3 月，分別采集昭陽區(qū)鳳凰山、昭陽區(qū)太平街道玉米地和昭通衛(wèi)生職業(yè)學院校園3 個地方的土壤進行微生物的分離和培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集

各樣點采樣方法參考丁俊男[5]的方法。

1.3.2 培養(yǎng)基的配置及滅菌

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基參照第三版周德慶主編的《微生物學實驗教程》配置、馬丁培養(yǎng)基購買成品。實驗過程中的培養(yǎng)基和實驗所需材料均采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。

1.3.3 土壤含水量測定

采用烘干法測定土壤含水量，3 種土壤樣品各稱取10 g，在干燥箱中經(jīng)過105 ℃，12 h，冷卻后稱量并計算含水量。土壤含水量計算方法：α=（m1-m2）/m2，其中m1為濕土質量；m2干土質量；α 為含水量。

1.3.4 土壤中微生物的分離

每種土壤樣品混勻后各稱取10 g，依據(jù)孫樹晴等人方法進行分離級逐級稀釋，得到1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6稀釋懸浮液，并從1×10-1至1×10-6每個稀釋懸浮液各取200 ul 懸浮液涂布于平板上。待平板干燥后倒置放于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每個稀釋懸浮液均設置3 個平行組。其中真菌置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)（真菌培養(yǎng)5～7 d），細菌和放線菌置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)（細菌培養(yǎng)3～5 d，放線菌培養(yǎng)10～14 d），按稀釋平板菌落計數(shù)法分別統(tǒng)計細菌、放線菌和真菌的數(shù)量。根據(jù)微生物形成的菌落形態(tài)，包括大小、形狀、顏色、氣味、透明度、表面光滑或粗糙、濕潤或干燥及邊緣整齊與否等發(fā)面，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行土壤微生物的分類。并按下列公式計算出每克土壤含菌數(shù)。

每克干土含菌數(shù)=同一稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種量毫升數(shù)×（1-土壤含水量）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用graghpad 進行處理。

2 結果與分析

2.1 土壤含水量

對昭陽區(qū)鳳凰山天然腐殖土、昭陽區(qū)太平街道玉米地農耕土及昭通衛(wèi)生職業(yè)學院校園非農耕土3 個地方土壤進行土壤含水量測定，詳見表1。鳳凰山天然腐殖土中土壤的含水量較多，昭陽區(qū)太平街道玉米地農耕土和昭通衛(wèi)生職業(yè)學院校園非農耕土含水量相對較少。

表1 土壤含水量

2.2 各種稀釋度菌懸液涂布于平板后，通過觀察均取10-3 該梯度進行記數(shù)并進行統(tǒng)計

統(tǒng)計結果顯示，昭陽區(qū)鳳凰山天然腐殖土、昭陽區(qū)太平街道玉米地農耕土、昭通衛(wèi)生職業(yè)學院校園非農耕土3 個地方土壤中的真菌、細菌與放線菌的數(shù)量和種類是有差異的，詳見表2。

表2 不同土壤微生物區(qū)系

首先從種類上來說，昭陽區(qū)鳳凰山天然腐殖土中細菌、真菌和放線菌的種類比其他2 種土壤的種類顯著增多，其次是太平街道玉米地取的農耕土中微生物的種類，而學校里的非農耕土中微生物的種類最少，如圖1 所示。

圖1 天然腐殖土、農耕土、非農耕土微生物種類

從數(shù)量上來說，鳳凰山天然腐殖土中的細菌數(shù)量比其他2 種土壤中的細菌數(shù)量顯著增多，3 種土壤中的放線菌和真菌無明顯差異，如圖2 所示。另外，對于同一種土壤來說，其中的細菌的數(shù)量也是高于真菌和放線菌的數(shù)量的。

圖2 天然腐殖土、農耕土、非農耕土微生物數(shù)量

3 討論與結論

昭陽區(qū)不同土壤微生物種類和數(shù)量是有差異的，在所研究的3 種不同的土壤中，細菌的數(shù)量均比放線菌和真菌的數(shù)量多，這個結果與其他學者（謝偉等）的研究結果一致，并且昭陽區(qū)天然腐殖土中的細菌數(shù)量也比其他2 種土壤多，但是其他2 種土壤在真菌和放線菌在數(shù)量上沒有明顯差異。從種類上來說，昭陽區(qū)的天然腐殖土中微生物的種類要比其他2 種土壤中也要多。

通過對于昭陽區(qū)天然腐殖土、農耕土和非農耕土在微生物種類和數(shù)量的比較表明，天然腐殖土中的微生物種類和數(shù)量相對于其他土壤來說都是比較多的，可能由于所采土的地方森林覆蓋率高，樹葉的枯枝爛葉在腐爛過程中提供了細菌所需的微環(huán)境。另外，天然腐殖土中細菌數(shù)量多，在土壤中占優(yōu)勢，真菌和放線菌相對來說種類和數(shù)量較少，土壤中的有機物質、酸堿度和水分等都更有利于細菌生長，而對于真菌和放線菌有限制作用。另外在研究過程中發(fā)現(xiàn)農耕土和非農耕土在微生物種類和數(shù)量上沒有差異，通過分析可能由于學校土壤在校園綠化的過程中受到樹木和小草的影響，對于原來的土壤微生物微環(huán)境有所改善。同時也說明，植物對于土壤的微環(huán)境，比如有機物質、微生物種類、肥力和酸堿度等方面的改善有作用。通過種植植物，可以有效地改善土壤微環(huán)境。所以，通過本研究發(fā)現(xiàn)，天然腐殖土微生物確實和其他土壤有差異，但是本研究僅對于昭陽區(qū)3 種土壤微生物進行了初步的分析，各類微生物具體的差異還需進一步研究。