陽春砂與海南砂BPPS啟動子比較及GCN4-motif正調(diào)控作用的鑒定

林曉靜，梁慧琳，趙?，?，吳清文，黃琳璇，伍思容，楊錦芬

? 藥材與資源 ?

陽春砂與海南砂啟動子比較及GCN4-motif正調(diào)控作用的鑒定

林曉靜，梁慧琳，趙?，?，吳清文，黃琳璇，伍思容，楊錦芬*

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)），國家中成藥工程技術(shù)研究中心南藥研發(fā)實驗室，廣東 廣州 510006

龍腦基二磷酸合酶（bornyl diphosphate synthase，BPPS）是砂仁藥效萜類合成途徑中的關(guān)鍵酶，獲得海南砂的啟動子并與陽春砂啟動子進行調(diào)控元件和瞬時表達(dá)的比較，以期解析在種子中高表達(dá)的分子機制。通過FPNI-PCR的方法從海南砂gDNA中克隆的啟動子，并與陽春砂啟動子進行序列比較，對啟動子相似區(qū)域進行截短，獲得其相應(yīng)的截短片段；對啟動子截短片段中的GCN4-motif進行突變；構(gòu)建由上述啟動子驅(qū)動β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuro-nidase gene，）的重組表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射侵染本氏煙草葉片進行瞬時表達(dá)，驗證啟動子的活性和GCN4-motif的功能?？寺～@得365 bp的啟動子序列，3’端約300 bp的序列與啟動子的相應(yīng)序列相似度高達(dá)93%，但啟動子不含有啟動子的GCN4-motif。構(gòu)建成功與GUS報告基因融合的系列啟動子重組載體——（啟動子全長）、（啟動子截短至320 bp）、（截短啟動子且突變GCN4-motif）和（啟動子全長）、（啟動子截短至305 bp）。通過GUS染色發(fā)現(xiàn)雖然上述啟動子均具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的活性，然而，含有GCN4-motif的啟動子，包括全長或截短的啟動子（和）的活性均高于GCN4-motif突變（）或無GCN4-motif的啟動子（和）。GCN4-motif對基因轉(zhuǎn)錄具有正調(diào)控作用，為進一步探究啟動子的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

啟動子；龍腦基二磷酸合酶；陽春砂；海南砂；GCN4-motif；瞬時表達(dá)

砂仁是我國“四大南藥”之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉等功效，可用于濕濁中阻、脾胃虛寒等癥，《中國藥典》2020年版收錄砂仁來源于姜科豆蔻屬植物陽春砂Lour.、海南砂T. L. Wu或綠殼砂Lour. var.T. L. Wu et Senjen的干燥成熟果實，并規(guī)定揮發(fā)油和乙酸龍腦酯為其主要藥效成分[1]。陽春砂因高含量揮發(fā)油和乙酸龍腦酯，其品質(zhì)通常優(yōu)于海南砂和綠殼砂，國內(nèi)市場對陽春砂的需求遠(yuǎn)大于后兩者，使其長期處于供需緊張的狀況[2-4]。因此，分析陽春砂關(guān)鍵酶的分子調(diào)控機制，從分子角度解析陽春砂品質(zhì)優(yōu)良的原因，為優(yōu)化海南砂和綠殼砂品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，進而緩解品質(zhì)優(yōu)良砂仁的供需缺口。

龍腦基二磷酸合酶（bornyl diphosphate synthase，BPPS）是砂仁藥效萜類合成途徑的關(guān)鍵酶，催化-半乳糖-1-磷酸酯（geranyl diphosphate，GPP）生成龍腦基二磷酸合酶（bornyl diphosphate，BPP），而BPP則為砂仁藥效物質(zhì)龍腦的直接前體和乙酸龍腦酯的間接前體[5]。Wang等[6]、李萌[7]分別克隆并鑒定陽春砂和海南砂的和，除了自身基因功能差異，同時期種子團中表達(dá)量遠(yuǎn)高于[6-7]。啟動子在基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，推測和的啟動子所調(diào)控的轉(zhuǎn)錄差異是導(dǎo)致海南砂和陽春砂品質(zhì)差異較大的重要原因之一。因此，將比較分析海南砂和陽春砂BPPS啟動子序列，以期闡明不同來源BPPS轉(zhuǎn)錄差異的原因。

課題組前期已克隆獲得470 bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)啟動子序列中具有參與胚乳特異表達(dá)的GCN4-motif[TGA(G/C)TCA][8]。GCN4-motif是一種在谷作物種子貯藏蛋白啟動子中高度保守的順式元件，對控制醇溶蛋白和谷蛋白的胚乳特異性表達(dá)起著核心作用[9-11]。然而GCN4-motif在非貯藏蛋白種子特異性啟動子的研究較少，作為非貯藏蛋白，表現(xiàn)出在種子中高表達(dá)特點和其產(chǎn)物表現(xiàn)出種子富集的特性[6,12]，初步推斷單個GCN4-motif在非貯藏蛋白種子特異性啟動子中可以介導(dǎo)基因在種子中特異性表達(dá)且具有正調(diào)控的作用。因此，本研究重點關(guān)注啟動子中的GCN4-motif，鑒定GCN4-motif對非貯藏蛋白AvBPPS的正調(diào)控作用，為提高關(guān)鍵基因的表達(dá)提供分子調(diào)控元件，為砂仁品質(zhì)優(yōu)化及藥效成分的代謝工程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

海南砂種植于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)何國振教授鑒定為海南砂T. L. Wu，本研究取其嫩葉并保存至?80 ℃超低溫冰箱備用；野生型本氏煙草L.、pLB-p載體質(zhì)粒和pCAMBIA1301植物表達(dá)載體質(zhì)粒均為本實驗保存。

1.2 試劑

快速定點突變試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、pLB零背景快速克隆試劑盒和DNA切膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；根瘤農(nóng)桿菌EHA105、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；Infusion連接酶、限制性內(nèi)切酶、PCR酶PrimerSTAR、LA Taq和DL2000 Maker購于Takara公司；內(nèi)切酶I和I均購于New England Biolabs（NEB）公司；GUS染色試劑盒購于索萊寶生物科技有限公司；引物合成和基因測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 海南砂基因組DNA的提取

參照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明，提取海南砂葉片的基因組DNA（gDNA），用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計檢測DNA完整性及濃度。

2.2 AlBPPS啟動子序列的克隆

根據(jù)FPNI-PCR引物設(shè)計原則以及參考和gDNA序列[8]，在5’端參考使用3條方向一致的特異性引物（gene specific primers，GSP），即GSP TPS3-1、GSP TPS3-2和GSP TPS3-3，見表1。

FPNI-PCR分為3輪擴增，第1輪PCR取適量海南砂gDNA，用9條通用簡并引物FP1～9分別與特異引物GSP TPS3-1進行熱不對稱PCR；第2輪PCR取第1輪PCR產(chǎn)物為模板，巢式特異引物FSP1分別與3個基因的特異引物GSP TPS3-2進行普通PCR第3輪方法與第2輪類似，以逐步分離目的DNA片段。將3輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用第3輪PCR產(chǎn)物直接測序或連入pLB載體測序。利用Snapgene軟件對測序結(jié)果與已獲得的目的基因gDNA序列分別比對，確認(rèn)3’端與其gDNA序列的5’端部分序列是否重疊。

2.3 AlBPPS啟動子序列分析、比較

利用Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點，利用PlantCARE（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測啟動子潛在的順式元件。利用Jalview軟件將和啟動子序列進行比對，并使用TBtool軟件對該啟動子的順式元件位置分布進一步可視化。

2.4 AlBPPS和AvBPPS啟動子截短、AvBPPS啟動子GCM4-motif突變及其表達(dá)載體的構(gòu)建

通過對比海南砂和陽春砂BPPS啟動子的序列，其中高度相似區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄起始位點至起始密碼子之前約50 bp，利用In-fusion原理設(shè)計同源臂引物并擴增啟動子全長和相似區(qū)域序列。PCR擴增條件：98 ℃，預(yù)變性5 min；98 ℃，變性10 s，58 ℃，退火30 s，72 ℃，延伸2.5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。分別回收PCR產(chǎn)物，參照快速定點突變試劑盒的說明，設(shè)計引物并進行突變，將啟動子截短片段中的TGAGTCA突變?yōu)門GTCA，使用VBTp-F和Bp-R的引物擴增并回收該PCR產(chǎn)物（引物見表1）。

將獲得的目的片段，即和全長啟動子、各自截短至保守區(qū)域的啟動子，以及啟動子截短加GCN4-motif突變的啟動子，通過In-fusion酶連接上已經(jīng)過內(nèi)切酶I和I酶切的pCAMBIA1301線性化載體，構(gòu)建與基因融合的植物表達(dá)載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 中，利用菌液PCR和測序驗證含有目的片段的陽性重組密碼子，并將重組質(zhì)粒分別命名為和。

2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草驗證啟動子活性

將“2.4”項的重組質(zhì)粒用液氮速凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105菌株，選取陽性的單菌落在25 μg/mL利福平（Rif）和50 μg/mL 卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)36 h，按照1∶50的比例將菌液轉(zhuǎn)接到含有25 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan的100 mL液體LB培養(yǎng)基中，200 r/min，28 ℃培養(yǎng)至600值為0.6，4 000×g、28 ℃離心20 min棄上清收集菌體，用含有10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和100 μmol/L AS的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，振蕩至600為0.8～1.0，在室溫靜置3 h。最后用針頭在煙草葉子背面輕劃破小口子，將重懸液用1 mL注射器（去掉針頭），從煙草葉片背部緩慢注入，做好標(biāo)記，保濕培養(yǎng)2 d，用GUS組織化學(xué)染色法檢測GUS活性，GUS染色參照GUS 染色試劑盒說明書進行。

表1 引物序列

Table 1 Primers sequences

引物用途引物名稱引物序列 (5’→3’) 啟動子序列擴增GSP TPS1-1GAAGCCCTCTGATCTGGTCCTCACA GSP TPS1-2CAGCTGCGAGCTCACGCCGTCTAAA GSP TPS1-3CGACGACGACCACTACACTCGATCG GCN4-motif突變GM-FGGAAAAAAAAAATGATTGTCAAATTTTCTAGGGAAGG GM-RCCTTCCCTAGAAAATTTGACAATCATTTTTTTTTTCC pCAMBIA1301-BPPS啟動子表達(dá)載體構(gòu)建VBp-FGCAGGCATGCAAGCTTTGTGTAGTACCAAACATATTTTCTATTTTCTAAAAATATATTAGA L/VBPTp-F*GTACCCGGGGATCCGGTTTGATTAAAATATACTGCCCTATAATTATTATTAAATTTGTAAATAG LBp-FGCAGGCATGCAAGCTTAGACGACTGAAAAGAAGCGCTG Bp-R*CAGATCTACCATGGGTTTGCAATCAAAAAATCGTAAAATATATCTCAACTCCA

*VBPT和LBPT的5’端和3’端一致，使用同一對引物

The 5’end and 3’end of VBPT and LBPT are the same, and the same primers are used

3 結(jié)果與分析

3.1 AlBPPS啟動子序列的獲得

利用gDNA核心序列設(shè)計特異性引物，以海南砂葉片gDNA為模板，進行FPNIPCR，將反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。結(jié)果表明在第3輪PCR擴增中FP3和FP7獲得了符合長度的條帶，見圖1。以PCR產(chǎn)物測序，只有FP7的3’端有262 bp與gDNA序列的5’端重合，初步認(rèn)定為的5’端上游序列，截去轉(zhuǎn)錄起始位點3’端序列之后，獲得含有啟動子區(qū)域的片段365 bp，其AT含量為70%，為植物啟動子主要特征之一，見圖2。

FP1～FP9-第1輪PCR為9條不同的簡并引物的PCR產(chǎn)物 1、2、3分別代表第1、2、3輪PCR產(chǎn)物 M-Marker 橙框為啟動子

FP1～FP9-PCR products of first PCR amplified by nine different degenerate primers 1, 2, and 3-PCR products of first, second, and third round of PCR M-Marker The orange box is thepromoter

圖1啟動子序列FPNI-PCR擴增產(chǎn)物

Fig. 1 Amplification ofpromoter using FPNI-PCR

圖2 AlBPPS啟動子序列及其順式作用調(diào)控元件

3.2 AlBPPS啟動子序列的生物信息學(xué)分析

將克隆獲得的365 bp序列進行生物信息學(xué)分析。利用Neural Network Promoter Prediction進行轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測，以預(yù)測值0.9為cut-off值，確定起始轉(zhuǎn)錄位點位于起始密碼子ATG上游62 bp處。并利用PlantCARE對啟動子中可能存在的順式作用元件進行預(yù)測，分析啟動子元件的類型、數(shù)量及位置（圖2和表2）。其中“+”“?”區(qū)分堿基的位置和正負(fù)鏈，“366”為轉(zhuǎn)錄起始位點的位置。依此類推。啟動子包含激活蛋白的核心元件TATAbox和提高轉(zhuǎn)錄活性的增強元件CAATbox等多個真核生物啟動子保守元件。此外，該啟動子還有光響應(yīng)元件Box 4、G-box，涉及干旱誘導(dǎo)的結(jié)合位點MBS，涉及厭氧誘導(dǎo)順式作用的ARE元件，涉及低溫誘導(dǎo)順式作用的LTR元件，涉及脫落酸反應(yīng)的ABRE，以及參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的TGACG-motif和CGTCA-motif的元件。

表2 AlBPPS啟動子預(yù)測的順式作用調(diào)控元件

Table 2 Predicted cis-elements in AlBPPS promoter

元件序列功能位置 TATA-boxTATATA核心啟動子元件280? TATA-boxTATAAATA 334? TATA-boxTATAAAT 89? 335? TATA-boxTATAAA 90? 336? TATA-boxTATAA 91? 337? 92+ TATA-boxTATA 125+ 135+ 176+ 282? 338? TATA-boxATATAT 279? 281? CAAT-boxCAAAT啟動子和增強子區(qū)域常見的順式作元件39? 150? 163? 213+ CAAT-boxCAAT 37+ 58? 240? 323? CAAT-boxCCAAT 109? AT～TATA-boxTATATA 280? AREAAACCA參與厭氧誘導(dǎo)的順式作用調(diào)控元件111? MBSCAACTG參與干旱誘導(dǎo)的 MYB 結(jié)合位點45+ G-BoxCACGTT參與光響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件310? Box 4ATTAAT參與光響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件236? LTRCCGAAA參與低溫響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件53+ ABREACGTG涉及脫落酸反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件311+ TGACG-motifTGACG涉及茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件210? CGTCA-motifCGTCA涉及茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件210+

“＋”“?”表示正反鏈，轉(zhuǎn)錄起始位點的位置為366

“＋” and “?” indicate the positive and negative strands, and the position of the transcription start site is 366

3.3 AlBPPS與AvBPPS啟動子序列的比較與分析

將獲得的啟動子與啟動子進行序列對比，發(fā)現(xiàn)有一段相似度高達(dá)93%、長度約300 bp的區(qū)域（包含轉(zhuǎn)錄起始位點至起始密碼子之前50 bp）（圖3），推測該相似序列為砂仁啟動子的保守區(qū)域。在這段保守區(qū)域中，啟動子含有胚乳特異性元件GCN4-motif，而啟動子在對應(yīng)的位置則為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif（圖3、圖4）。鑒于和所表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄差異和GCN4-motif的功能報道，初步推測GCN4-motif在的表達(dá)中具有胚乳特異性表達(dá)以及正調(diào)控的作用。

綠色三角形代表轉(zhuǎn)錄起始位點，轉(zhuǎn)錄起始位點右邊為非編碼區(qū)，紅框為高度相似區(qū)域，黑色下劃線分別代表GCN4-motif和CGTCA-motif

藍(lán)色虛線右邊為相似區(qū)域，黑色箭頭表示GCN4-motif

3.4 BPPS啟動子驅(qū)動GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建了和表達(dá)載體（圖5），對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，PCR擴增啟動子片段與目標(biāo)片段大小一致（圖6），獲得陽性重組子，測序結(jié)果驗證了載體構(gòu)建成功；其中的GCN4-motif—— TGAGTCA突變成了TGTCA。

TB(R)、TB(L)是T-DNA的左右邊界HygR潮霉素抗性基因 GUS-β-葡糖苷酸酶

1～5-VBP∷GUS、VBPT∷GUS、VBPT-GM∷GUS、LBP∷GUS和LBPT∷GUS PCR檢測產(chǎn)物 M-Marker

3.5 啟動子活性比較分析

分別將重組質(zhì)粒和陽性對照pCAMBIA1301利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染本氏煙草葉片，保濕培養(yǎng)2 d，同時以未侵染的葉片作為陰性對照，進行GUS染色。結(jié)果如圖7所示，陰性對照（野生型）不能染成藍(lán)色，陽性對照葉片呈大面積較深藍(lán)色，和均能染上藍(lán)色，說明上述啟動子均能驅(qū)動基因的表達(dá)。然而，啟動子全長或截短的和均呈現(xiàn)較大面積且較深的顏色，而GCN4-motif突變的啟動子與其野生型對照相比，顏色明顯較淺；不含GCN4-motif的啟動子，包括全長和截短的，與其相應(yīng)的對照啟動子和相比，顏色也明顯較淺，僅表現(xiàn)出微弱的活性。結(jié)果顯示含有GCN4-motif的啟動子比GCN4-motif突變或缺失的啟動子顯示出更強的活性，證明GCN4-motif對啟動子活性起正調(diào)控作用。

圖7 BPPS啟動子瞬時表達(dá)的GUS染色

4 討論

陽春砂萜類物質(zhì)主要富集于種子團中，而BPPS作為砂仁藥效萜類合成途徑的關(guān)鍵酶，也相應(yīng)地表現(xiàn)出種子特異性表達(dá)[6,12]。另外，在陽春砂種子團的表達(dá)量不僅顯著高于其他的萜類合酶，例如芳樟醇合酶（linalool synthase，AvLIS）和葎草烯合酶（humulene synthase，AvHUS）等萜類合酶，并且在開花后45 d種子團中的表達(dá)量約為的200倍[7-8]?；虮磉_(dá)量的差異受上游啟動子的影響，因此，比較、和啟動子之間的序列和順式元件差異，有助于解析在種子團中高表達(dá)的原因。趙海瑩等[8]克隆了、和的啟動子，發(fā)現(xiàn)啟動子具有和啟動子不具備的GCN4-motif。本研究在此基礎(chǔ)上克隆了海南砂啟動子，該啟動子具有多個順式作用元件，包括參與光、低溫、干旱、茉莉酸甲酯等逆境響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件；啟動子與啟動子3’端序列高度相似，然而，啟動子卻不具有GCN4-motif，相應(yīng)位置的堿基序列變成了CGTCA-motif—一個參與茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）響應(yīng)的調(diào)控元件。通過進一步的瞬時表達(dá)實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)截短至相似區(qū)域與各自相應(yīng)全長的啟動子相比，其活性表現(xiàn)較為一致，說明這段截短至相似區(qū)域為砂仁BPPS啟動子序列中的關(guān)鍵保守區(qū)域。此外，在這段核心保守區(qū)域中，包含GCN4-motif的陽春砂啟動子活性明顯高于不具有GCN4-motif的海南砂啟動子。因此，推測GCN4-motif是調(diào)控在種子團高表達(dá)的重要因素之一。

據(jù)文獻(xiàn)報道，GCN4-motif通常以組合的模式在貯藏蛋白種子特異性啟動子進行調(diào)控。例如，在醇溶蛋白啟動子中，GCN4-motif與prolamin-box-motif構(gòu)成雙因子胚乳盒，又或者與bZIP類轉(zhuǎn)錄因子BLZ2結(jié)合進而調(diào)節(jié)醇溶蛋白的表達(dá)[11,13-14]；而GCN4-motif在谷蛋白啟動子中主要發(fā)揮著胚乳特異性表達(dá)的作用，通常與ACGT-motif和AACA-motif組成最小元件組合或者與bZIP類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控谷蛋白在胚乳中特異性表達(dá)，并起正調(diào)控作用。而根據(jù)海南砂和陽春砂轉(zhuǎn)錄模式和啟動子序列，推測單個GCN4-motif對非貯藏蛋白起著胚乳特異性作用以及正調(diào)控作用[9-10,15]。本研究對啟動子中的GCN4-motif進行突變，瞬時表達(dá)的結(jié)果顯示，突變體與野生型VBPT比較，活性明顯降低（圖7）。本研究驗證了GCN4-motif是非貯藏蛋白啟動子的正調(diào)控元件，對的表達(dá)起促進作用。

本研究首次克隆了海南砂啟動子，并將它與陽春砂啟動子進行比較，發(fā)現(xiàn)砂仁啟動子的關(guān)鍵保守序列并鑒定了啟動子的關(guān)鍵順式元件GCN4-motif的正調(diào)控作用。下一步將對啟動子缺失體和突變體構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因煙草，分析GCN4-motif與種子特異性表達(dá)的關(guān)系，加深認(rèn)識GCN4-motif在非貯藏蛋白啟動子中的調(diào)控機制，為進一步闡明陽春砂和海南砂中的BPPS轉(zhuǎn)錄差異模式奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparison ofpromoters betweenandand identification of GCN4 motif positive regulation

LIN Xiao-jing, LIANG Hui-ling, ZHAO Hai-ying, WU Qing-wen, HUANG Lin-xuan, WU Si-rong, YANG Jin-fen

Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering, Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan (Guangzhou University of Chinese Medicine), Ministry of Education Joint Laboratory of National Engineering Research Center for Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines, College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

Bornyl diphosphate synthase (BPPS) is an important enzyme in the synthetic pathway ofmedicinal terpenoids. To investigate the molecular mechanism ofhigh expression in seed, the promoter ofwas obtained fromand was compared with the promoter offrom.The promoter ofwas cloned fromgDNA by FPNI-PCR, and its sequence was compared with the promoter of; The similar regions of the promoter were truncated, and the corresponding truncated sequences were obtained. Meanwhile, the GCN4 motif was mutated from the truncated sequence ofpromoter. The recombinant expression vectors of β-glucuronidase gene (GUS) driven by the above-mentioned promoter were constructed, and the-mediated method was used to infect the leaves offor transient expression to verify the promoter activities and the functions of GCN4 motif.The 365bppromoter sequence was cloned. The 3'end of 300 bp sequences was 93% similarity to the corresponding sequence of thepromoter. In this sequence, only thepromoter contained GCN4 motif. We successfully constructed a series of vectors fused with the reporter gene of GUS:(promoter full length),(promoter truncated to 320bp),(the mutantpromoter on GCN4 motif),(promoter full length) and(promoter truncated to 305 bp). Through GUS staining, it was found that all of the above-mentioned promoters have the activity of driving the transcription of GUS. However, promoters containing GCN4 motif, including full-length or truncatedpromoters (and) are more active than GCN4 motif mutation () or the promoters lack of GCN4 motif (and).This study improves GCN4-motif has a positive regulatory effect onand provides a basis for further exploration of the regulation mechanisms ofpromoter.

promoter; BPPS;Lour.;T. L. Wu; GCN4-motif; transient expression

R286.12

A

0253 - 2670(2022)19 - 6159 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.021

2022-02-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（81872954）

林曉靜（1996—），女，碩士研究生，研究方向為藥用植物次生代謝。Tel: 13724047090 E-mail: 517507071@qq.com

楊錦芬（1978—），女，研究員，研究方向為藥用植物萜類化合物生物合成與調(diào)控。Tel: (020)39358331 E-mail: yangif@gzucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]