基于NF-κB/STAT信號通路探究朱砂根治療大鼠急性咽炎的作用機制

權 偉，劉 暢，周 英，何倩倩，石 洋，黨兆巖，劉雄利, 2*

基于NF-κB/STAT信號通路探究朱砂根治療大鼠急性咽炎的作用機制

權 偉1，劉 暢1，周 英1，何倩倩1，石 洋1，黨兆巖1，劉雄利1, 2*

1. 貴州中醫(yī)藥大學藥學院 藥食兩用資源應用與開發(fā)研究中心，貴州 貴陽 550025 2. 貴州大學 西南藥食兩用資源開發(fā)利用技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州 貴陽 550025

建立大鼠急性咽炎模型并結合網絡藥理學，基于核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/信號傳導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路探討朱砂根干預大鼠急性咽炎的作用機制。通過網絡藥理學方法預測朱砂根干預急性咽炎的靶點，構建活性成分-靶點、靶點-通路網絡。構建急性咽炎大鼠模型，檢測大鼠血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PEG2）和IL-10水平；采用qRT-PCR檢測大鼠咽部組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，）、、、蛋白酪氨酸性磷酸非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor 11，）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，）和Janus激酶2（Janus kinase 2，）mRNA表達；采用Western blotting檢測大鼠咽部組織中AKT1、JAK2和Caspase-8蛋白表達。網絡藥理學研究顯示，朱砂根主要活性成分與急性咽炎有168個交集靶點，主要作用于NF-κB/STAT信號通路。與模型組比較，朱砂根組大鼠血清中IL-6和PEG2水平明顯降低（＜0.01），IL-10水平顯著升高（＜0.05、0.01）；咽部組織、、、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。朱砂根中的活性成分可能通過調控NF-κB/STAT信號通路，干預炎癥反應并加速巨噬細胞分化、凋亡，從而治療急性咽炎。

朱砂根；網絡藥理學；核因子-κB/信號傳導及轉錄激活因子信號通路；急性咽炎；巨噬細胞

急性咽炎在中醫(yī)中常稱作“急喉痹”，表現(xiàn)為咽黏膜及黏膜下組織的突發(fā)性炎癥，常累及咽部淋巴組織。根據(jù)炎癥的情況，急性咽炎可分為急性單純性咽炎、急性壞死性咽炎以及急性水腫性咽炎3類[1-4]。清熱解毒類藥物是治療急性咽炎的首選藥物[5-6]。中醫(yī)自古就有“咽喉口腔諸病皆屬于火”之說，風寒外襲說是對急性咽炎病因病機的經典認識，以疏風解表、清熱解毒為最佳治療方式，金銀花、朱砂根等清熱解毒類中藥或其有效成分對咽炎具有抑制作用[7]。朱砂根為紫金?？浦参镏焐案鵖ims的干燥根，《貴州草藥》有記載，稱其辛微苦澀、平，能清熱、利咽化瘀，對咽炎有良好的治療作用，有喉科良藥的美譽[8-10]。朱砂根的化學成分主要為朱砂根皂苷、巖白菜素等，研究發(fā)現(xiàn)朱砂根中巖白菜素具有明顯的消炎作用[11]；朱思[12]通過二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸扭體藥理模型發(fā)現(xiàn)朱砂根具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛活性；現(xiàn)代藥理學研究表明朱砂根具有抗菌、抗炎、抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等作用[13-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，朱砂根中黃酮類、香豆素類成分為其主要活性成分，且含量較為豐富[16]。但目前對朱砂根含有的主要藥效成分和其對急性咽炎的作用機制尚不清楚。

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/信號傳導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路是調控炎癥因子、刺激巨噬細胞活化的主要通路[17-18]。在炎癥反應過程中，STAT和NF-κB通路間存在一定的交互作用，炎性細胞因子產生可能與NF-κB通路激活相關，并減少STAT磷酸化[19]。巨噬細胞是機體內最主要的炎癥效應細胞。推測朱砂根可能通過調節(jié)通路中某些基因的表達從而調控炎癥因子影響巨噬細胞的抗炎能力。因此，本研究基于網絡藥理學方法[20]預測朱砂根活性成分與急性咽炎之間的關鍵靶點，篩選得到相關炎癥信號通路；建立大鼠急性咽炎模型，檢測大鼠血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PEG2）和IL-10水平，利用qRT-PCR檢測大鼠咽部組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，）、、、蛋白酪氨酸性磷酸非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor 11，）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，）、Janus激酶2（Janus kinase 2，）mRNA表達，并通過Western blotting檢測大鼠咽部組織中Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達，通過mRNA與蛋白表達水平的變化，探索調控炎癥因子關鍵靶點，討論朱砂根治療急性咽炎的藥效物質基礎，闡明朱砂根干預炎癥分子、治療急性咽炎的作用機制，為其在急性咽炎的臨床治療提供實驗依據(jù)，為紫金牛屬植物的研究提供思路。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠98只，體質量（200±10）g，雌雄各半，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（川）2018-17。動物于西南醫(yī)科大學實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)3 d。動物實驗符合貴州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準要求（批準號20210047）。

1.2 藥材

實驗所用朱砂根選自貴州情人谷，經貴州中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為紫金牛屬植物朱砂根Sims的干燥根。

1.3 藥品與試劑

阿莫西林膠囊（批號18112101）購自北京新領先醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；IL-6檢測試劑盒（批號E02I0006）、PEG2檢測試劑盒（批號EK-R38790）、IL-10檢測試劑盒（批號1529285272）購自上海茁彩生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（批號U9124）購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒（批號00780166）、熒光定量試劑盒（批號00850445）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；水合氯醛（批號Q/12HB4218-2017）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號SC-365062）、Caspase-8抗體（批號SC-81656）購自圣克魯斯生物技術公司；AKT1抗體（批號BS2987）、JAK2抗體（批號BS5769）購自南京巴傲得生物科技有限公司；m-IG Fc BP-HRP二抗購自圣克魯斯生物技術公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體購自南京巴傲得生物科技有限公司。

1.4 儀器

Multlskan Mk3型酶標儀、Sorvall Legend Micro 17R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團）；N60系列超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）；CFX96 Touch型qRT-PCR儀、ChemDoc型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 朱砂根干預大鼠急性咽炎的網絡藥理學研究

2.1.1 朱砂根活性成分的篩選 由于TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://www.tcmsp-e.com）中未收錄朱砂根，因此查找朱砂根相關文獻，搜集朱砂根化學成分。通過ChemDraw軟件畫出結構，保存為sdf格式，將文件導入SwissADME數(shù)據(jù)庫（http://www. swissadme.ch/）[21-23]，根據(jù)胃腸道吸收度作為條件篩選朱砂根的活性成分。

2.1.2 朱砂根活性成分作用靶點的預測和急性咽炎靶點的篩選 將篩選出的朱砂根活性成分Canonical SMILES格式文件導入Swiss Target Prediction平臺，將其屬性設置為“homo sapiens”，預測活性成分作用的潛在靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/），以“acute pharyngitis”等關鍵詞檢索與急性咽炎相關的基因，再與Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://beta.uniprot.org/）進行比對，得到格式完全一致的Gene symbol，刪除重復靶點基因，與化合物作用的靶點進行比對，得到二者的交集靶點，即為朱砂根作用于急性咽炎的靶點。

2.1.3 “活性成分-靶點”網絡的構建 利用Cytoscape 3.9.0軟件構建朱砂根“活性成分-靶點”網絡。成分對應靶點的個數(shù)用度值來表示，度值越大，成分與靶點直接連線越密集，說明該成分作用于靶點越多，通過大小、明暗、密集程度篩選朱砂根干預急性咽炎的關鍵成分。

2.1.4 核心靶點之間相互作用網絡的構建和通路富集分析 通過String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）輸入交集靶點信息，選擇綜合得分在0.9以上的靶點，利用Cytoscape 3.9.0軟件繪制朱砂根作用于急性咽炎的關鍵靶點互作網絡圖，并通過計算度值獲得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，利用Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/）對關鍵靶點進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，篩選得到有關炎癥的通路，通過Cytoscape 3.9.0軟件繪制“關鍵成分-靶點-通路”網絡圖。

2.2 朱砂根干預大鼠急性咽炎的作用機制

2.2.1 朱砂根水提液的制備 稱取200 g朱砂根，加入10倍量水，加熱回流提取2次，每次2 h，合并2次濾液，加熱濃縮至1 g/mL（以生藥量計），于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 朱砂根水提液的質量控制 參考《中國藥典》2020年版對朱砂根水提液進行定性定量檢測，色譜條件、對照品制備與藥典保持一致，供試品制備方法如下：取20 g朱砂根加10倍量水煎煮2 h，提取2次，合并煎煮液，轉移至500 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻、濾過，取1 mL濾液至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。記錄對照品與供試品的HPLC圖（圖1），二者均在波長275 nm檢測到巖白菜素，且保留時間基本完全對應，說明實驗所用藥材朱砂根為真品；且朱砂根水提液中巖白菜素的質量分數(shù)為1.19%，《中國藥典》2020年版規(guī)定朱砂根中巖白菜素的質量分數(shù)為1%，符合藥典標準。

圖1 對照品溶液 (A)與朱砂根水提液 (B) 的HPLC圖

2.2.3 造模依據(jù)與實驗劑量確定 根據(jù)《中藥藥效方法學》中氨水致急性咽炎模型方法摸索出合適氨水條件建立大鼠急性咽炎模型。依據(jù)《中國藥典》2020年版朱砂根的法定劑量上限6～9 g/(人·d)，根據(jù)人與大鼠的體表面積折算的等效劑量比值0.018，按成人6 g/(人·d)計算得到大鼠的給藥劑量為0.54 g/kg（以生藥量計）。50只SD大鼠隨機分成5組，每組10只，設置5個劑量梯度，分別為4、8、16、32、64倍劑量（2.16、4.32、8.64、17.28、34.65 g/kg），大鼠一次性ig藥物進行半數(shù)致死量實驗，發(fā)現(xiàn)64倍劑量組ig藥物24 h死亡5只大鼠，其余大鼠均出現(xiàn)抽搐、呆滯等表現(xiàn)；32倍劑量組大鼠狀態(tài)不佳，出現(xiàn)精神不振、食欲不佳等狀況。根據(jù)以上實驗結果，以4、8、16倍劑量（2.16、4.32、8.64 g/kg）作為給藥劑量。

2.2.4 建模與分組 選用48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為對照組、模型組、阿莫西林（0.36 g/kg）組和朱砂根低、中、高劑量（2.16、4.32、8.64 g/kg）組。除對照組外，各組大鼠用噴霧器噴一下10%氨水，2次/d，連續(xù)3 d，建立急性咽炎模型。造模成功后，各給藥組ig相應藥物，1次/d，連續(xù)7 d，對照組和模型組ig等體積的蒸餾水，記錄各組大鼠的體質量，每天根據(jù)大鼠的毛發(fā)發(fā)黃程度、脫毛嚴重程度、咽部紅腫程度觀察并記錄造模后各組大鼠的一般狀態(tài)。給藥結束后，大鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取大鼠血清和咽部組織，于低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 血清炎癥因子指標檢測 各組大鼠腹腔主動脈取血5 mL，4 ℃靜置1 h，4 ℃、3500 r/min離心15 min，吸取血清，按照試劑盒說明書檢測血清中IL-6、PEG2和IL-10水平。

2.2.6 咽部組織病理變化 取各組大鼠咽部組織，用10%多聚甲醛固定，包埋于石蠟中，切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.7 qRT-PCR檢測咽部組織NF-κB/STAT通路關鍵基因的表達 根據(jù)網絡藥理學結果選取NF-κB/STAT通路中關鍵基因，利用qRT-PCR檢測其mRNA表達。通過primer3在線軟件平臺（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設計、、、、、、引物（表1）；按照試劑盒說明書提取各組大鼠咽部組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) Caspase-3F: GCAAAAGGAGCAGTTTTGTGTGTG R: GGCAGGCCTGAATGATGAAGAG Caspase-7F: GCTGAGCCACGGAGAAGAGAAT R: TAGCAGGGTTTTGCATCGGTCT Caspase-8F: AACATGCGGGACAGAAAAGGAA R: TTGCTGTGCAATCACTGAAGGA PTPN11F: CGAGGAGTCGATGGCAGTTTCT R: TTTCCCCGCCATAGAGGTCATA AKT1F: GACCACCGCCATTCAGACTGT R: CACCTCCATCTCCTCAGCACCT JAK2F: TTTCTGATGTTCAGCTCTCACCAA R: CGTGCAGCTGACCATAATCTCC GAPDHF: GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT R: ACGGCCAAATCCGTTCACC

2.2.8 Western blotting檢測咽部組織NF-κB/STAT信號通路相關蛋白的表達 根據(jù)qRT-PCR結果檢測咽部組織Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達。取對照組、模型組和朱砂根高劑量組大鼠咽部組織，加入含PMSF、蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，加入蛋白緩沖液，于100 ℃恒溫水浴10 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h，分別加入AKT1、JAK2、Caspase-8、GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次后，加入二抗（1∶10 000），室溫避光孵育1 h；TBST洗滌3次后，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影，利用Image J軟件分析條帶灰度值。

3 結果

3.1 朱砂根主要活性成分的獲得

在相關文獻中搜尋“朱砂根”相關化學成分，得到朱砂根化學成分62種，根據(jù)胃腸道吸收度作為篩選條件，5項中有2項及以上為yes篩選條件，共篩選出朱砂根的主要活性成分18種。巖白菜素尚未達到篩選條件，胃腸道吸收度略低，但是在朱砂根的活性成分中起著關鍵作用，因此，將巖白菜素也列入分析對象中，共篩選得到19個朱砂根的活性成分（表2）。

表2 朱砂根的活性成分

Table 2 Active ingredients of A. crenata

編號化合物 ZSG1美替來托 ZSG2巖白菜素 ZSG3[(7-羥基-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-6-基)氧基]乙酸 ZSG4楊梅素 ZSG5墨沙酮 ZSG6七葉內酯 ZSG7槲皮素 ZSG8秦皮素 ZSG94-甲基傘形葡萄糖醛酸 ZSG10二十烷酮 ZSG11紫金牛醌 ZSG12無羈萜 ZSG13β-谷甾醇 ZSG143β,16α-二羥基-30-甲氧基-28,30環(huán)氧-齊墩果-12烯 ZSG152,4,6三羥基苯甲酸 ZSG16葛根皂醇 ZSG172α-羥基烏蘇酸 ZSG183-羥基-5-甲氧基-苯甲酸 ZSG19正壬酸

3.2 朱砂根活性成分作用靶點的預測及疾病靶點的獲得

在SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www. swisstargetprediction.ch/）中輸入19個朱砂根有效成分，共得到310個有效靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫平臺，輸入“acute pharyngitis”等關鍵詞，搜索與其相關的基因，下載文檔處理得到2029個靶基因。利用Venny 2.1.0在線平臺繪制疾病靶點與朱砂根活性成分靶點韋恩圖，篩選得到朱砂根作用于急性咽炎的靶點168個。

3.3 “活性成分-靶點”網絡的構建與分析

在Cytoscape 3.9.0軟件中將朱砂根19個活性成分和朱砂根作用于急性咽炎的168個靶點輸入，構建得到“活性成分-靶點”網絡（圖2）。圖中六邊形表示朱砂根19個活性成分，菱形表示168個靶點，六邊形與菱形大小與明暗程度表示了活性成分、靶點本身的重要程度以及活性成分與靶點間關系的密切程度，中藥多成分、多靶點間相互作用的特點在圖中得以體現(xiàn)。

3.4 PPI網絡的構建與分析

將朱砂根與急性咽炎相互作用的168個潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫中，得到各靶點間的關系信息，將最高置信度（0.900）以上的靶點導入到Cytoscape 3.9.0軟件，繪制PPI網絡（圖3）。進行拓撲分析可知，該網絡有169個節(jié)點，419條邊，平均節(jié)點度4.96，平均局部聚類系數(shù)0.438，依據(jù)連接度、介度、緊密度大小，從圖中可以得到表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、AKT1、v-erb-b2成紅細胞白血病病毒癌基因同源物2（v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2，ERBB2）、周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、E1A結合蛋白p300（E1A binding protein p300，EP300）、整聯(lián)蛋白β1（integrin beta 1，ITGB1）等核心靶點。上述靶點是重要節(jié)點，連接大量其他節(jié)點蛋白。節(jié)點分別代表潛在作用靶點，節(jié)點大小與明暗透明度代表靶點的度值，節(jié)點越大、顏色越深，表明靶點在網絡體系中的度值越大；節(jié)點間連線表示靶點間存在潛在的相互作用關系。

圓形節(jié)點為藥物，六邊形節(jié)點為活性成分，菱形節(jié)點為靶點

圖3 PPI網絡

3.5 KEGG通路富集與重要信號通路基因篩選

在Matescape數(shù)據(jù)庫中輸入168個潛在靶點，進行KEGG通路富集，結果表明168個靶點主要通過120條KEGG通路發(fā)揮作用（＜0.05），包括NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、FoxO信號通路、MAPK信號通路等。其中，ZSG3、ZSG4、ZSG5、ZSG6、ZSG7、ZSG8、ZSG9、ZSG10、ZSG12、ZSG14、ZSG15、ZSG16、ZSG17、ZSG18、ZSG19共15個朱砂根關鍵活性成分作用于JAK-STAT信號通路13個靶點，包括、、、等。進一步構建“關鍵成分-靶點-通路”網絡（圖4）。

3.6 朱砂根對急性咽炎大鼠血清中IL-6、PEG2和IL-10水平的影響

造模3 d后，大鼠體質量下降，食欲不振，毛發(fā)暗淡變黃，且咽部有紅腫出現(xiàn)，即造模成功；給予藥物干預7 d后，與模型組比較，各給藥組大鼠咽部紅腫程度好轉，說明朱砂根對急性咽炎有較好的治療效果。如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、PEG2水平顯著升高（＜0.01），IL-10水平明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中PEG2水平顯著降低（＜0.01），阿莫西林組和朱砂根高劑量組大鼠血清中IL-6水平顯著降低（＜0.01），阿莫西林組和朱砂根中、高劑量組大鼠血清中IL-10水平顯著升高（＜0.05、0.01）。

八邊形節(jié)點代表信號通路，菱形節(jié)點為靶點，圓形節(jié)點為活性成分

表3 朱砂根水提物對急性咽炎大鼠血清中IL-6、PEG2和IL-10水平的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of water extract of A. crenata on levels of IL-6, PEG2 and IL-10 in serum of rats with acute pharyngitis (, n = 8)

組別劑量/(g·kg?1)IL-6/(ng·L?1)PEG2/(ng·L?1)IL-10/(ng·L?1) 對照—76.90±15.94298.02±31.2342.55±5.35 模型—138.40±13.51**522.62±37.08**21.28±5.92** 阿莫西林0.3685.39±16.91##338.70±46.37##39.68±6.21## 朱砂根8.64101.28±16.52##373.19±47.50##35.23±8.57## 4.32116.66±14.14375.29±27.11##29.80±6.68# 2.16126.45±13.91421.37±48.40##26.02±5.19

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group

3.7 朱砂根對急性咽炎大鼠咽部組織病理變化的影響

如圖5所示，對照組大鼠咽部組織黏膜鱗狀上皮無增生，固有層小血管無充血，固有層與黏膜腺無炎性細胞浸潤；模型組大鼠咽部組織黏膜鱗狀上皮明顯增生，黏液腺肥大、損壞，固有層內小血管充血明顯，固有層與黏膜腺有大量炎性細胞浸潤；阿莫西林組咽部組織黏膜上皮偶見增生，固有層與黏膜腺偶見炎性細胞浸潤；朱砂根高劑量組咽部組織黏膜鱗狀上皮基本無增生，固有層內小血管無明顯充血，固有層與黏膜腺無炎性細胞浸潤；朱砂根中劑量組咽部組織黏膜鱗狀上皮部分增生，黏膜腺略有肥大，固有層及黏膜腺有少量炎性細胞浸潤；朱砂根低劑量組咽部組織黏膜鱗狀上皮明顯增生，固有層內小血管大量充血，但固有層炎性基本無細胞浸潤。

圖5 朱砂根對急性咽炎大鼠咽部組織病理變化的影響(HE, ×200)

3.8 朱砂根對急性咽炎大鼠咽部組織Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、PTPN11、AKT1和JAK2 mRNA表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組咽部組織中、、、和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，阿莫西林組咽部組織中、、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；朱砂根高劑量組、、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；朱砂根中劑量組和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；朱砂根低劑量組、、、和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.9 朱砂根對急性咽炎大鼠咽部組織Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠咽部組織中Caspase-8和JAK2蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，朱砂根高劑量組Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

4 討論

中醫(yī)認為，火熱為咽喉疾病的一個重要病因, 其表現(xiàn)多為火熱上炎癥狀，通常以疏風解表、清熱解毒的藥物治療為主[24]。西醫(yī)認為當咽部受到細菌、病毒等外來刺激時，炎癥細胞釋放出腫瘤壞死因子-α、IL-1β和IL-6等促炎因子，促炎因子的增加使吞噬細胞加速活化、聚集并釋放炎癥介質，引起咽部發(fā)熱、疼痛、紅腫，即造成急性咽炎[25]。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，圖7同

圖7 朱砂根對急性咽炎大鼠咽部組織Caspase-8、AKT1和JAK2蛋白表達的影響(, n = 3)

朱砂根具有解毒消腫、活血止痛、祛風除濕之功效，在治療急性咽炎方面有著獨特的優(yōu)勢。在臨床應用中，朱砂根是開喉劍噴霧劑的主要組成中藥之一。開喉劍噴霧劑是治療小兒咽炎、扁桃體炎的常用藥物，該藥為液體噴霧制劑，可直接作用于口腔黏膜，在病變局部形成藥液膜，具有直接吸收、起效快、療效高、療程短等特點，臨床應用廣泛[26-27]。另有研究表明[28-30]，開喉劍噴霧劑與更昔洛韋、頭孢曲松、蒲地藍消炎口服液等藥物聯(lián)用，在治療小兒皰疹性口腔炎、急性化膿性扁桃體炎、手足口病等疾病時臨床效果更好，可加快患者癥狀緩解速度，提升患者體液免疫功能，且安全性高。因此研究朱砂根治療急性咽炎的作用機制具有十分重要的意義。

為了探究朱砂根治療急性咽炎的作用機制，本研究建立大鼠急性咽炎模型，考察朱砂根對大鼠血清中IL-6、PEG2、IL-10水平的影響。IL-6是機體內最重要的促炎因子之一，在急性咽炎等疾病中扮演著十分重要的角色[31]。在形成急性咽炎的整體過程中，吞噬細胞等炎性細胞產生的炎癥因子可以間接促使PEG2的合成[32]。IL-10是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，能夠抑制巨噬細胞在受到促炎性刺激后誘導發(fā)生代謝程序的改變[33]。結果顯示，朱砂根可能通過降低IL-6等促炎因子水平，升高IL-10等抑炎因子水平，從而促進巨噬細胞等炎癥因子凋亡，達到對急性炎癥的治療作用。

網絡藥理學預測結果表明，巖白菜素、楊梅素、槲皮素等朱砂根中19種關鍵活性成分通過45個關鍵靶點作用于9個與炎癥、細胞調亡有關的信號通路上。研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素通過抑制NF-κB及MAPK信號通路從而減少促炎因子[34]；楊梅素能夠抑制NF-κB信號通路從而抑制炎癥反應，降低炎癥因子表達[35]。因此，朱砂根中關鍵活性成分在治療急性咽炎時起到重要作用。NF-κB、STAT信號通路是參與細胞因子信號調節(jié)、影響炎癥因子的主要通路。JAK/STAT信號通路一定程度上可以激活NF-κB信號通路，并存在一定交互作用，在JAK/STAT信號通路中，JAK可以響應細胞因子或生長因子的刺激使STAT3磷酸化，誘導促炎細胞因子的表達，同時促炎細胞因子可激活NF-κB信號通路并通過調控MCP-1和COX-2蛋白的表達募集趨化更多炎癥細胞，引發(fā)炎癥損傷[36-39]。另有研究表明[40]，吞噬細胞向M1極化的重要信號通路為NF-κB信號通路，下調炎癥因子的表達和抑制其向M1的極化，具有顯著的炎癥負向調控作用。

本研究結果表明，朱砂根水提液顯著抑制急性咽炎大鼠咽部組織、、、、、基因表達及Caspase-8、AKT1、JAK2蛋白表達。Caspases[41]是近年來發(fā)現(xiàn)的一組半胱氨酸蛋白酶，可導致DNA裂解促進細胞凋亡。Caspase-7作為細胞凋亡的執(zhí)行者之一，其表達量降低可以抑制NF-κB信號通路從而有效干預炎癥反應的發(fā)生。、、作為JAK/STAT信號通路的重要組成基因之一，在調節(jié)吞噬細胞生長、分化、凋亡方面起著至關重要的作用[42]。AKT1信號通路調控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程。JAK家族成員屬于非受體酪氨酸激酶，基因參與由多種細胞因子影響的信號通路[43]，編碼的蛋白質在大多數(shù)組織中廣泛表達，并在各種細胞信號事件中起調節(jié)作用。綜上，朱砂根通過作用于NF-κB/STAT通路，刺激巨噬細胞的凋亡并抑制炎癥反應的發(fā)生，對急性咽炎起到治療作用。

本研究以朱砂根作為研究對象，通過網絡藥理學方法尋找到朱砂根活性成分治療急性咽炎的關鍵通路上的關鍵靶點，并根據(jù)預測得到的關鍵靶點篩選到NF-κB/STAT信號通路，同時建立了急性咽炎大鼠模型，考察了朱砂根水提液治療急性咽炎的作用機制。結果顯示，給予朱砂根水提液后，模型大鼠血清中促炎因子IL-6、PEG2水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，說明朱砂根能夠有效治療急性咽炎。qRT-PCR與Western blotting結果佐證，朱砂根水提液能夠通過降低模型大鼠咽部組織、、、、、基因表達，進而降低Caspase-8、AKT1、JAK2蛋白表達，抑制NF-κB信號通路，干預炎癥反應的發(fā)生，同時刺激STAT信號通路從而促進吞噬細胞分化、凋亡，起到治療急性咽炎的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張霞, 謝雁鳴, 李光熙, 等. 中醫(yī)藥治療急性咽炎的優(yōu)勢與問題探討 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(19): 3819-3825.

[2] 王文萍, 趙克明, 高京京, 等. 急性咽炎的病因病機理論再探討 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2009, 36(7): 1086-1088.

[3] Shaikh N, Leonard E, Martin J M. Prevalence of streptococcal pharyngitis and streptococcal carriage in children: A meta-analysis [J]., 2010, 126(3): e557-e564.

[4] Cots J M, Alós J I, Bárcena M,. Recommendations for management of acute pharyngitis in adults [J]., 2016, 34(9): 585-594.

[5] Harris A M, Hicks L A, Qaseem A,. Appropriate antibiotic use for acute respiratory tract infection in adults: Advice for high-value care from the American college of physicians and the centers for disease control and prevention [J]., 2016, 164(6): 425-434.

[6] Hicks L A, Taylor T H Jr, Hunkler R J. U. S. outpatient antibiotic prescribing, 2010 [J]., 2013, 368(15): 1461-1462.

[7] 林慧, 梅全喜. 中藥制劑治療急性咽炎的研究進展 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(10): 2448-2450.

[8] 蔡佳仲. 朱砂根和樹豆葉的化學成分及抗腫瘤作用研究 [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學, 2012.

[9] 宋冬雪. 朱砂根藥理作用研究進展 [J]. 黑龍江醫(yī)藥, 2014, 27(4): 887-888.

[10] 葉晴, 陳金鵬, 凌悅, 等. 朱砂根化學成分和藥理作用的研究進展[J]. 中草藥, 2022, 53(9): 2851-2860.

[11] 余成龍, 宋良科, 吳蜀星, 等. 朱砂根藥用資源分布及研究進展 [J]. 安徽農業(yè)科學, 2012, 40(28): 13793-13794.

[12] 朱思. 朱砂根品質評價及其相關藥效學研究 [D]. 福州: 福建中醫(yī)藥大學, 2016.

[13] 王長彬, 周永強, 俸婷婷, 等. 基于HPLC圖譜探究苗藥八爪金龍3個基原不同藥用部位的差異 [J]. 化學工程師, 2020, 34(12): 23-27.

[14] 田振華, 何燕, 駱紅梅, 等. 朱砂根抗炎抗菌作用研究 [J]. 西北藥學雜志, 1998, 13(3): 109-110.

[15] 靳志娟. 紫金牛屬植物化學成分和藥理作用的研究進展 [J]. 實用醫(yī)技雜志, 2008, 15(25): 3432-3436.

[16] 李曉, 石慧, 丁晶鑫, 等. 不同基原八爪金龍藥材中黃酮、香豆素類化學成分分析 [J]. 中國藥房, 2021, 32(4): 443-452.

[17] 譚海鵬. 巨噬細胞對凋亡細胞的清除及炎癥調控作用 [J]. 復旦學報: 醫(yī)學版, 2020, 47(6): 911-916.

[18] 趙九洲, 姜曉旭, 李宏偉, 等. JAK-STAT信號通路與巨噬細胞炎癥調控的研究進展 [J]. 癌變·畸變·突變, 2020, 32(5): 402-404.

[19] Alawdi S H, El-Denshary E S, Safar M M,. Neuroprotective effect of nanodiamond in Alzheimer’s disease rat model: A pivotal role for modulating NF-κB and STAT3 signaling [J]., 2017, 54(3): 1906-1918.

[20] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網絡藥理學評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[21] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules [J]., 2017, 7: 42717.

[22] Daina A, Michielin O, Zoete V. iLOGP: A simple, robust, and efficient description of n-octanol/water partition coefficient for drug design using the GB/SA approach [J]., 2014, 54(12): 3284-3301.

[23] Daina A, Zoete V. A BOILED-egg to predict gastrointestinal absorption and brain penetration of small molecules [J]., 2016, 11(11): 1117-1121.

[24] 李巖, 陶荊華, 汪婧怡, 等. 中醫(yī)外治法治療急性咽炎的研究進展 [J]. 中國中醫(yī)急癥, 2021, 30(11): 2065-2068.

[25] 劉巖, 劉志洋. 羅漢果水提液對于急性咽炎模型大鼠的治療作用 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(19): 159-162.

[26] 謝莉. 開喉劍噴霧劑治療兒童急性咽喉炎的臨床研究 [J]. 臨床軍醫(yī)雜志, 2015, 43(6): 610-612.

[27] 關曉娟, 李劭鵬. 開喉劍噴霧劑聯(lián)合克感利咽口服液治療兒童急性扁桃體炎臨床分析 [J]. 新中醫(yī), 2016, 48(3): 158-160.

[28] 張琛瑋, 謝豪, 陳龍, 等. 開喉劍噴霧劑聯(lián)合更昔洛韋輔助治療小兒皰疹性口腔炎的臨床效果 [J]. 臨床合理用藥雜志, 2021, 14(28): 130-132.

[29] 李旦陽. 開喉劍噴霧劑聯(lián)合頭孢曲松治療急性化膿性扁桃體炎患兒臨床研究 [J]. 新中醫(yī), 2022, 54(8): 129-132.

[30] 武亮花, 任潔穎. 開喉劍噴霧劑聯(lián)合蒲地藍消炎口服液治療手足口病患兒臨床療效分析 [J]. 臨床醫(yī)藥實踐, 2021, 30(12): 910-911.

[31] Yao X, Huang J Q, Zhong H H,. Targeting interleukin-6 in inflammatory autoimmune diseases and cancers [J]., 2014, 141(2): 125-139.

[32] Yang D L, Xu J W, Zhu J G,. Role of GPR30 in estrogen-induced prostate epithelial apoptosis and benign prostatic hyperplasia [J]., 2017, 487(3): 517-524.

[33] Ip W K E, Hoshi N, Shouval D S,. Anti-inflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages [J]., 2017, 356(6337): 513-519.

[34] Gao X J, Guo M Y, Zhang Z C,. Bergenin plays an anti-inflammatory role via the modulation of MAPK and NF-κB signaling pathways in a mouse model of LPS-induced mastitis [J]., 2015, 38(3): 1142-1150.

[35] 張帆, 彭密軍, 鄧百川. 二氫楊梅素抗炎作用研究進展 [J]. 飼料研究, 2021, 44(18): 117-121.

[36] 廖靜秋. JAK-STAT/NF-κB通路介導高糖引起的人臍靜脈內皮細胞的損傷與炎癥反應 [D]. 廣州: 南方醫(yī)科大學, 2016.

[37] 徐敏. 咽喉清復方對急性咽炎p38/Erk/NF-κB/COX-2信號通路調控的影響 [D]. 貴州: 遵義醫(yī)科大學, 2020.

[38] 吳峰淼, 葉凱麗, 劉曦. 黃芩苷對大鼠膠原誘導性關節(jié)炎JAK/STAT3信號通路及Th17/Treg免疫平衡的影響 [J]. 中國藥師, 2020, 23(2): 246-251.

[39] 許話, 嚴紅梅, 陳斕. 仙茅苷對潰瘍性結腸炎大鼠JAK/STAT/NF-κB信號通路的影響 [J]. 中國藥師, 2022, 25(3): 406-413.

[40] 賈瑞, 惠毅, 閆曙光, 等. 巨噬細胞M1/M2型極化與免疫炎癥性疾病關系的研究進展 [J]. 中國免疫學雜志, 2021, 37(22): 2791-2797.

[41] Zhu M M, Wang L, Yang D,. Wedelolactone alleviates doxorubicin-induced inflammation and oxidative stress damage of podocytes by IκK/IκB/NF-κB pathway [J]., 2019, 117: 109088.

[42] 王學川, 李霄, 梁承遠. 基于JAK-STAT信號通路的藥物研究進展 [J]. 陜西科技大學學報, 2019, 37(6): 79-86.

[43] Casanova J L, Holland S M, Notarangelo L D. Inborn errors of human JAKs and STATs [J]., 2012, 36(4): 515-528.

Mechanism ofon rats with acute pharyngitis based on NF-κB/ STAT signaling pathway

QUAN Wei1, LIU Chang1, ZHOU Ying1, HE Qian-qian1, SHI Yang1, DANG Zhao-yan1, LIU Xiong-li1, 2

1. Research Center for Application and Development of Medicine and Food Dual-use Resources, School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. National and Local Joint Engineering Research Center of Southwest Medicinal and Edible Resources Development and Utilization Technology, Guizhou University, Guiyang 550025, China

To explore the mechanism ofon rats with acute pharyngitis based on nuclear factor kappa-B (NF-κB)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway by establishing acute pharyngitis rats model combined with network pharmacology,.The target ofintervention in acute pharyngitis was predicted by network pharmacology, and networks of active ingredient-target and target-pathway were constructed; Rat model of acute pharyngitis was constructed, levels of interleukin-6 (IL-6), prostaglandin E2(PEG2) and IL-10 in serum of rats were detected; qRT-PCR was used to detect cystein-asparate protease-3 (),,, protein tyrosine phosphatase nonreceptor 11 (),protein kinase B1) andJanus kinase 2 () mRNA expressions in pharyngeal tissue of rats; Western blotting was used to detect AKT1, JAK2 and Caspase-8 protein expression in pharyngeal tissue of rats.The network pharmacology showed that main active components ofhad 168 intersecting targets with acute pharyngitis, mainly acting on NF-κB/STAT signaling pathway. Compared with model group, levels of IL-6 and PEG2in serum of rats ingroup were significantly decreased (< 0.01), and IL-10 level was significantly increased (< 0.05, 0.01), mRNA expression levels of,,,,andwere significantly decreased (< 0.05, 0.01), protein expressions of Caspase-8, AKT1 and JAK2 were significantly decreased (< 0.05, 0.01).The active components inmay regulate NF-κB/STAT signaling pathway, intervene in inflammatory response and accelerate the differentiation and apoptosis of macrophages, thereby treating acute pharyngitis.

Sims; network pharmacology; nuclear factor-κB/signal transducer and activator of transcription signaling pathway; acute pharyngitis; macrophage

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6083 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.014

2022-04-20

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1708100）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術研究課題（QZYY-2021-098）；貴州中醫(yī)藥大學2021年度科研創(chuàng)新和探索專項（2018YFC170810201，2018YFC170810204）；貴州中醫(yī)藥大學本科教學工程建設項目（貴中醫(yī)教學工程合字[2021]12號）

權 偉（1998—），男，在讀碩士研究生，研究方向為中藥及民族藥化學及中藥新藥研究。E-mail: 529197111@qq.com

劉雄利（1983—），男，教授，從事基于藥物優(yōu)勢骨架的高效構建和藥食功能因子研究。E-mail: 15286024587@163.com

[責任編輯 李亞楠]