基于腸道菌群和系統(tǒng)藥理學(xué)探討藏藥十五味乳鵬丸抗高尿酸血癥腎病的作用機制

謝昊宸，張博恒，穆卡然·艾買江，李 娜，何彭可，嚴亨秀，邵曉妮*

基于腸道菌群和系統(tǒng)藥理學(xué)探討藏藥十五味乳鵬丸抗高尿酸血癥腎病的作用機制

謝昊宸1，張博恒2，穆卡然·艾買江2，李 娜2，何彭可2，嚴亨秀2，邵曉妮2*

1. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，四川 成都 610041 2. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

基于腸道菌群、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)多維度挖掘藏藥十五味乳鵬丸（Shiwuwei Rupeng Pills，SRP）抗高尿酸血癥腎?。╤yperuricemic nephropathy，HN）的作用機制。腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇構(gòu)建HN大鼠模型，設(shè)置對照組、模型組、別嘌醇（50 mg/kg）組和SRP高、低劑量（1.2、0.4 g/kg）組。連續(xù)給藥14 d后，檢測大鼠血清中尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，CREA）及尿素氮（urea nitrogen，BUN）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎組織病理變化。獲取SRP和HN核心靶點，構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點”和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對潛在靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；采用分子對接技術(shù)模擬關(guān)鍵成分與核心靶點的結(jié)合活性。采用qRT-PCR法驗證各組大鼠腎組織中關(guān)鍵靶點的mRNA表達；收集大鼠糞便，采用16S rDNA高通量測序法檢測腸道菌群變化。SRP顯著降低HN大鼠血清中UA、CREA及BUN水平（＜0.05），并改善腎組織病理損傷。SRP可能通過作用于晚期糖基化終末化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等信號通路發(fā)揮抗HN作用。白蛋白（albumin，ALB）、TNF、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）和骨髓細胞瘤病毒癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）與木犀草素、槲皮素、山柰酚、表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯和兒茶素有較好的對接活性。SRP顯著下調(diào)HN大鼠腎組織中、和mRNA表達水平（＜0.05），顯著上調(diào)mRNA表達水平（＜0.05）。與模型組比較，SRP組大鼠腸道菌群豐富度和多樣性顯著升高，且在門水平上降低擬桿菌門和厚壁菌門的比例；主要降低、、及菌屬，增加及的相對豐度。SRP可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)控AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路及相關(guān)靶點的表達發(fā)揮抗HN作用，具有多成分、多靶標及多通路的治療特點。

十五味乳鵬丸；高尿酸血癥腎?。荒c道菌群；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；腫瘤壞死因子；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；白蛋白；信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3

高尿酸血癥腎病（hyperuricemic nephropathy，HN）是由于體內(nèi)尿酸堆積過多導(dǎo)致的腎臟損傷，是高尿酸血癥的常見并發(fā)癥。目前臨床上的療法主要涉及尿酸的合成與排泄，但這些療法都有使用限制并會產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)[1]。且高尿酸血癥是涉及多個器官的復(fù)雜生物過程，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群紊亂與HN的發(fā)展有關(guān)，腸道微生物的代謝產(chǎn)物膽汁酸以及三甲胺等都會在腎臟發(fā)揮作用，驅(qū)動著腎臟的炎癥反應(yīng)[2]。因此尋找新的治療HN藥物是臨床亟待解決的問題。

藏藥治療高尿酸血癥歷史悠久，具有多靶點、不良反應(yīng)少的優(yōu)勢，因此臨床上運用藏藥治療HN獨具特色。藏族藥十五味乳鵬丸（Shiwuwei Rupeng Pills，SRP）由兒茶、毛訶子、余甘子等15味藏藥材組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，SRP中多種有效成分具有降尿酸、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等作用[3]，臨床上用于治療急慢性痛風(fēng)、高尿酸血癥等相關(guān)疾病[4]。SRP對高尿酸血癥相關(guān)腎功能損傷具有明顯的改善作用[5-7]，但目前SRP用于治療HN的具體作用機制尚未明確。本研究采用腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇誘導(dǎo)構(gòu)建HN大鼠模型，利用腸道菌群、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究SRP抗HN的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性Wistar大鼠30只，7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自成都達碩實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（川）2020-030。動物飼養(yǎng)于西南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF級動物實驗室，自由進食飲水，溫度（23±1）℃，相對濕度（55±5）%，每12小室晝夜間斷性照明，適應(yīng)性培養(yǎng)1周。動物實驗方案均經(jīng)過西南民族大學(xué)動物倫理委員會審核批準（批準號No.2021-16）。

1.2 藥品與試劑

十五味乳鵬丸（批號190808）購自甘南佛閣藏藥有限公司；別嘌醇片（批號20201004）購自合肥久聯(lián)制藥有限公司；腺嘌呤（批號A108804）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸乙胺丁醇片（批號201202）購自成都錦華藥業(yè)有限公司；血清尿酸（uric acid，UA）試劑盒（批號Cobas57121601）、血清肌酐（creatinine，CREA）試劑盒（批號Cobas58321702）和血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號Cobas58266201）購自德國Roche公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑（批號G1003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（批號AI21034A）購自日本Takara公司；iTaq? Universal SYBR Green Super mix（批號L001752A）購自美國Bio-Rad公司；糞便基因組DNA提取試劑盒（批號116560-200）購自MP Biomedical公司。

1.3 儀器

H1850R型高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；cobas c311型全自動血生化儀（德國Roche公司）；VeritiTM96孔梯度PCR儀、QuantStudioTM3型熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；Illumina Miseq高通量測序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 分組、造模和給藥 Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組、別嘌醇（50 mg/kg，相當于臨床等效劑量）組和SRP高、低劑量（1.2、0.4 g/kg，分別相當于臨床劑量的3、1倍）組，每組6只。腺嘌呤和鹽酸乙胺丁醇溶于生理鹽水配制成1%腺嘌呤和2.5%鹽酸乙胺丁醇混懸液，對照組ig等體積生理鹽水，其余各組ig混懸液，1次/d，連續(xù)21 d。SRP臨用前碾碎成粉末，用生理鹽水配制成0.24、0.08 g/mL的溶液。別嘌醇研磨成粉末，溶于生理鹽水配制成0.5%混懸液。在造模第8天時開始給藥，各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

2.1.2 血清中UA、CREA和BUN水平的測定 末次給藥后，大鼠禁食12 h，ip 0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心15 min，取血清，按照試劑盒說明書操作，使用全自動生化儀檢測各組大鼠血清中UA、CREA和BUN水平。

2.1.3 HE染色法檢測腎臟組織病理變化 取各組大鼠腎臟組織，于4%多聚甲醛中固定，包埋切片后，進行HE染色，于顯微鏡下觀察腎臟組織的病理變化。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接

2.2.1 SRP活性成分收集及靶點的獲取 從TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中獲得SRP中15種中藥的活性成分，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB≥30%）且藥物相似性（drug likeness，DL≥0.18）。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索不到的中藥，選擇搜索CNKI及PubMed數(shù)據(jù)庫其所含化學(xué)成分，最終確定SRP的活性成分集合。將得到的活性成分集合在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得其靶點名，再通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniPort（https://www.uniprot.org/）檢索各靶點的靶基因ID，物種選擇為homo sapiens。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索不到的化學(xué)成分，可以在PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得化學(xué)成分的SMILES，再利用SWISS數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測，最終獲得所有成分的預(yù)測靶點集合。

2.2.2 HN靶點的獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）獲取HN相關(guān)靶點，導(dǎo)出Excel的形式后標準化建立疾病靶點集合；然后利用微生信平臺將SRP的活性成分靶點與疾病靶點進行Venn圖的繪制，并得到潛在作用靶點。

2.2.3 SRP活性成分-HN疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)各中藥的活性成分與HN潛在作用靶點的相互作用關(guān)系構(gòu)建屬性文件和網(wǎng)絡(luò)文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建SRP活性成分-HN的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.2.4 關(guān)鍵靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將獲得的潛在作用靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn. string-db.org/）中，物種選擇為homo sapiens，獲得蛋白互作分析，最低互作閾值設(shè)置為高可信，導(dǎo)出TSV格式后再利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建SRP治療HN作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.2.5 關(guān)鍵靶點京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路和基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index. html#/main/step1）對潛在作用靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，以＜0.05為篩選標準，代表具有統(tǒng)計學(xué)意義。利用微生信平臺繪制氣泡圖和柱狀圖。

2.2.6 關(guān)鍵靶點分子對接驗證 根據(jù)篩選的活性成分和核心靶點，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)并保存為SDF格式，利用Open Babel軟件將SDF格式轉(zhuǎn)換為MOL2格式，作為小分子配體。利用PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）將核心靶點的3D結(jié)構(gòu)保存為PDB格式，再運用PyMol軟件對靶蛋白進行預(yù)處理，產(chǎn)生活性口袋，采用AutoDockTools 1.2.6將活性成分與靶蛋白的活性口袋進行對接，驗證其相互作用活性。

2.3 qRT-PCR法檢測關(guān)鍵靶點mRNA表達

取“2.1.1”項下各組大鼠腎臟組織至預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨成粉末，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。通過Primer Premier 5設(shè)計PCR擴增引物序列，白蛋白（albumin，）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物序列 (5’-3’) ALBF: CCAAGTGCTGTAGTGGGTCC R: GCCTTGGGCTTGTGTTTCAC TNF-αF: GGCGTGTTCATCCGTTCTCT R: CCCAGAGCCACAATTCCCTT PPARGF: GTGCCTTCGCTGATGCACT R: GCAGGCTCTACTTTGATCGC STAT3F: GACCGCGTCGGCTAGGA R: ATCCTGCCGCAATCAGGGG GAPDHF: GAAGGTCGGTGTGAACGGAT R: CCCATTTGATGTTAGCGGGAT

2.4 16S rDNA測序法檢測腸道菌群的變化

末次給藥后，收集“2.1.1”項下各組大鼠糞便，采用Zymo Research BIOMICS DNA微量制備試劑盒提取DNA，并使用0.8%瓊脂糖電泳檢測gDNA完整性，隨后測定DNA濃度。用515F（5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對樣本的16S rDNA V3～4區(qū)域進行擴增，采用Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒對PCR回收產(chǎn)物進行純化，并使用Qubit@2.0 Fluorometer定量，用NEBNext Ultra Ⅱ DNA文庫制備試劑盒構(gòu)建DNA文庫，最后采用Illumina HiSeq快速SBS試劑盒v2進行測序。下機后對數(shù)據(jù)進行處理，使用FLASH拼接雙端序列，基于Barcode從raw reads中拆分出各樣品序列，截去Barcode序列，并使用QIIME2進行質(zhì)控?；贒eblur算法對序列進行序列降噪和嵌合體去除，生成ASV特征表和特征序列。使用基于樸素貝葉斯算法的分類器對SILVA數(shù)據(jù)庫進行物種分類數(shù)據(jù)集的構(gòu)建，并使用該數(shù)據(jù)集對ASV特征序列進行物種注釋。使用QIIME2對特征序列進行多重比對，并使用其內(nèi)置的FastTree插件構(gòu)建進化樹。最后進行群落組成分析、α多樣性分析、β多樣性分析、差異物種分析以及群落功能預(yù)測分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8和SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用表示。組間差異采取單因素方差分析（One-way ANOVE）進行比較。腸道菌群測序數(shù)據(jù)的群落組成、α多樣性、β多樣性以及差異物種分析使用R語言4.0.5數(shù)據(jù)分析軟件進行分析；使用QIIME2 2020.2進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）聚類、物種注釋和進化樹構(gòu)建。

3 結(jié)果

3.1 SRP對HN大鼠腎組織病理變化以及血清中UA、CREA和BUN水平的影響

如圖1-A所示，與對照組比較，模型組大鼠腎小球細胞核數(shù)增多，腎小管間質(zhì)損傷，腎小管擴張以及腎小管上皮細胞變形壞死。與模型組比較，各給藥組均可改善腎間質(zhì)損傷、腎小管擴張以及減少腎小管上皮細胞變性壞死的情況。如圖1-B所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中UA、CREA和BUN水平均顯著升高（＜0.05），表明HN模型構(gòu)建成功；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中UA、CREA、BUN水平均顯著降低（＜0.05）；SRP對HN大鼠血清中CREA和BUN水平的下調(diào)作用優(yōu)于別嘌醇，表明SRP對由UA升高導(dǎo)致的腎功能損傷具有明顯的改善作用，且療效優(yōu)于單一靶點的別嘌醇。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.2.1 SRP活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以及文獻檢索，搜索SRP中各藥材成分，經(jīng)過篩選最終得到121個有效成分，其中余甘子12個、安息香3個、決明子11個、訶子7個、乳香2個、木香4個、兒茶11個、黃葵子3個、巴夏嘎8個、藏菖蒲7個、寬筋藤16個、毛訶子22個、麝香4個、鐵棒錘8個、渣馴膏3個。其中主要活性成分為山柰酚、兒茶素、槲皮素、木犀草素以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯。

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

3.2.2 HN及SRP活性成分對應(yīng)靶點收集 將得到的活性成分Canonical SMILES導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫以及PharmMapper數(shù)據(jù)庫，最終得到SRP的作用靶點780個，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到HN的626個靶點。將疾病靶點與藥物靶點取交集共得到147個交集靶點，見圖2。

3.2.3 潛在靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將SRP與HN的靶點交集后的文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，得到活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)（圖3），網(wǎng)絡(luò)共有279個節(jié)點；度值較高成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（MOL006821）、槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、兒茶素（MOL000492）、山柰酚（MOL000422），這些活性成分可能是治療HN的關(guān)鍵成分。

3.2.4 HN與SRP潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4-A）。其中節(jié)點表示靶點，節(jié)點間的連線表示靶點之間的關(guān)系。篩選度值靠前的靶點（圖4-B），網(wǎng)絡(luò)圖含有77個靶點以及1582條相互關(guān)系，節(jié)點顏色越深，節(jié)點越大，代表度值越大，表明在整個圖中生物學(xué)重要性越高；節(jié)點間連線的粗細代表節(jié)點間的聯(lián)系，連線越粗代表結(jié)合分數(shù)越高，聯(lián)系越密切。度值排名靠前的靶點分別為ALB、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，CASP3）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、血管內(nèi)表皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、STAT3、IL-1β、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）和PPARG，這10個節(jié)點均高于平均自由度且度值較高，表明靶點在SRP治療HN過程中起重要作用。

圖2 SRP活性成分與HN靶點交集的韋恩圖

3.2.5 SRP治療HN靶點的GO功能富集分析 將SRP治療HN的潛在靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析包括生物過程（biological processes，BP）、細胞成分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3個方面。如圖5所示，BP主要包括細胞對外來刺激的反應(yīng)及對細菌來源分子的反應(yīng)等；CC主要包括胞質(zhì)囊泡、膜筏及樹突等；MF主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合及細胞因子受體結(jié)合。KEGG通路富集選取程度最高的前20條信號通路，主要作用于晚期糖基化終末化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）信號通路、細胞凋亡及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等。

圖3 SRP活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

A-SRP治療HN靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) B-度值靠前的靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 GO功能及KEGG通路富集分析

3.3 分子對接研究

篩選網(wǎng)絡(luò)中度值較高的成分與靶點，導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6得到分子對接結(jié)果。其中成分選取度值較高的表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、兒茶素、山柰酚以及木犀草素，靶點選取PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10的靶點。其中ALB、TNF、PPARG、STAT3以及MYC與成分對接情況較好，對接結(jié)果以熱圖形式展示（圖6）。部分對接結(jié)果可視化模式見圖7。

3.4 SRP對HN大鼠腎組織中關(guān)鍵靶點mRNA表達的影響

HN常伴有炎癥發(fā)生，其中、、以及均與腎損傷密切相關(guān)。如圖8所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中、及mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中、及mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05），mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。表明SRP能夠通過抑制炎癥因子表達，從而改善HN大鼠的腎損傷。

圖6 分子對接聚類分析

圖7 SRP主要活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

3.5 SRP對HN大鼠腸道菌群的影響

3.5.1 SRP對腸道菌群多樣性的影響 采用α多樣性分析法對各組大鼠腸道菌群物種多樣性進行評價，其中包括Chao1、Shannon、PD和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)用于估算物種總數(shù)，Shannon和Simpson指數(shù)說明物種多樣性，PD指數(shù)是對進化樹所有枝長求和，說明物種有無，進化差異度與數(shù)值呈正相關(guān)，數(shù)值越大，多樣性越高。如圖9所示，與對照組比較，模型組Chao1、PD、Simpson及Shannon指數(shù)均下降，說明HN大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性都有所下降；與模型組比較，給藥組Chao1、PD、Shannon及Simpson指數(shù)總體上升，說明SRP可提高大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。

為了探索樣本物種豐富度隨著測序深度的變化趨勢，做稀釋曲線（圖10-A），當OTU數(shù)目＜1300時，各樣本稀釋曲線趨向平坦，表明測序數(shù)據(jù)足夠大，能夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物的多樣性信息。為了研究各樣本中物種個體豐度與物種個體類型的變化關(guān)系，進行Rank-Abundance曲線分析（圖10-B），Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的2個方面，即物種豐度和物種均勻度。

β多樣性分析是指對不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進行比較分析，本研究通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）來研究群落組成的相似性或差異性。如圖10-C、D所示，不同的顏色或點代表不同處理的樣本，兩樣本點相距越近代表兩樣本組成越相似。對照組和模型組的樣本明顯分離，說明建立的HN大鼠模型的腸道菌群有明顯的變化，且在SRP干預(yù)后，大鼠的腸道菌群分布情況有向?qū)φ战M遷移的趨勢，說明SRP對大鼠的腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)組成有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖9 各組大鼠腸道菌群α多樣性分析(, n = 6)

A-稀釋曲線 B-Rank-Abundance曲線 C-PCA分析 D-PCoA分析

3.5.2 SRP對HN大鼠腸道菌群門水平的影響 如圖11所示，大鼠腸道菌群門水平上主要以擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）為主，其中還有少量的變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）。與對照組比較，模型組大鼠腸道中擬桿菌門相對豐度顯著升高（＜0.05），厚壁菌門相對豐度顯著降低（＜0.05），擬桿菌門與厚壁菌門的比值顯著上升（＜0.05）；經(jīng)過SRP干預(yù)后，擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度均有不同程度的恢復(fù)（＜0.05）。表明SRP可以通過降低擬桿菌門的相對豐度、提高厚壁菌門的相對豐度以及降低擬桿菌門和厚壁菌門的比值來改善HN大鼠。

3.5.3 SRP對HN大鼠腸道菌群屬水平上的影響 在屬水平上，與HN相關(guān)的具有代表性的前6種腸道微生物分別為乳桿菌屬擬桿菌屬、阿克曼菌屬、勞爾氏菌屬、Prevotellaceae Ga6A1 group、Ruminococcaceae UCG-014。如圖12所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道中乳桿菌屬及Ruminococcaceae UCG-014的相對豐度降低（＜0.05），阿克曼菌屬、勞爾氏菌屬及Prevotellaceae Ga6A1 group的相對豐度升高（＜0.05）；經(jīng)過SRP治療后，乳桿菌屬及Ruminococcaceae UCG-014的相對豐度總體上調(diào)（＜0.05），阿克曼菌屬、勞爾氏菌屬及Prevotellaceae Ga6A1 group的相對豐度整體下降（＜0.05）。表明SRP能夠抑制阿克曼菌屬、勞爾氏菌屬及Prevotellaceae Ga6A1 group的生長，促進乳桿菌屬及Ruminococcaceae UCG-014的增殖來改善HN大鼠。

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，圖12同

圖12 SRP對HN大鼠腸道菌群屬水平的影響(, n = 6)

3.5.4 SRP對HN大鼠腸道差異菌群的分析 為確定SRP治療HN大鼠相關(guān)的腸道菌群，采用線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSs）比較5組間腸道菌群。如圖13所示，對照組顯著差異的菌種有12中，主要為疣微菌目、阿克曼菌科、阿克曼菌屬及疣微菌門等；模型組顯著差異的菌種有16種，主要為厚壁菌門、乳桿菌科、乳桿菌目及乳桿菌等；別嘌醇組顯著差異的菌種有3種，分別為布勞特氏菌屬、梭菌科及梭狀芽胞桿菌；SRP給藥組差異顯著的菌群有34種，主要為勞爾氏菌屬、擬普雷沃氏菌屬、鞘脂單胞菌科、擬桿菌屬、擬桿菌科等。在Cladogram分析結(jié)果中，對照組與模型組差異顯著，組間能明顯分開，SRP給藥組與對照組略有重疊。

A-LDA值分布柱狀圖 B-物種分支進化圖

4 討論

藏醫(yī)藥治療高尿酸血癥的歷史悠久、經(jīng)驗豐富。近年來，無數(shù)藏藥進入大眾的視野，大量國內(nèi)外研究者也展開了對藏藥的相關(guān)研究。已有多個藏藥經(jīng)典配方被證實有效，如二十五味兒茶丸、復(fù)方貓乳兒散以及七味羅堆多吉顆粒等。藏醫(yī)對于高尿酸血癥患者的治療，遵照多數(shù)共性和個體差異化的原則，采取單方治療、三果和三黃水藥為核心藥材的復(fù)方治療及藥浴聯(lián)合放血治療等，對于高尿酸血癥患者的各個臨床指標均有明顯改善。近期，也有研究針對于藏藥復(fù)方制劑抗高尿酸血癥的藥理作用機制，其主要涉及抑制UA合成、促進UA排泄和抑制炎癥反應(yīng)等。

SRP作為藏醫(yī)經(jīng)典名方，是藏醫(yī)數(shù)千年流傳下來的寶貴財富，其治療痛風(fēng)的作用已經(jīng)過多年的臨床驗證。其可通過降低UA水平以及炎癥指標，而改善患者痛風(fēng)癥狀，但其作用機制尚不明確。因此本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)及腸道菌群分析SRP治療HN的作用機制，再采用qRT-PCR驗證，以期為藏藥治療HN提供方向和參考。

動物實驗結(jié)果顯示，SRP能改善HN大鼠腎臟病理變化，降低大鼠血清中UA、CREA及BUN水平，且SRP療效優(yōu)于陽性對照組別嘌醇，證明SRP抗HN具有多靶點的高效治療作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩選出SRP中121個活性成分，疾病靶點與藥物靶點交集后得到147個共同靶點?；钚猿煞?靶點網(wǎng)絡(luò)顯示槲皮素、山柰酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、木犀草素、兒茶素能對接更多的靶點，是SRP主要的活性成分。研究表明，木犀草素[8-9]和槲皮素[10-11]能夠通過降低黃嘌呤氧化酶活性而減少UA合成，并能抑制炎性細胞因子而減輕炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。槲皮素能顯著改善胸腺和脾臟等免疫器官的功能[12]；通過提高Toll交互蛋白的表達從而抑制NF-κB的表達，而發(fā)揮保護腎臟功能[13-14]。木犀草素被認為在腎病治療中具有較大潛力的有效成分，有研究表明，木犀草素能夠通過上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2），減弱活性氧（reactive oxygen species，ROS），促進抗氧化蛋白及酶的釋放，下調(diào)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，Myd88）/NF-κB通路，并減緩氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗炎作用[15]。兒茶素是綠茶中的一組多酚，研究發(fā)現(xiàn)大鼠的腎臟切除5/6后使用兒茶素，使大鼠的腎臟微血管密度減小的程度得到抑制，且還可以延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進程，從而起到保護腎臟作用[16]。在腎病中，山柰酚在底物與黃嘌呤氧化酶結(jié)合之前，到達結(jié)合位點與黃嘌呤氧化酶結(jié)合，從而發(fā)揮抑制黃嘌呤氧化酶活性[17]；且山柰酚能有效抑制腎病大鼠細胞凋亡和腎組織炎癥反應(yīng)，改善腎功能[18]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯是茶葉中的主要活性成分之一，是一種強效的抗氧化劑和活性氧清除劑，具有強大的抗炎作用[19]。腎損傷大鼠給予表沒食子兒茶素沒食子酸酯干預(yù)后，血清中BUN、CREA和炎性因子水平均降低，說明表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠抑制炎性因子表達，從而保護腎臟[20]。以上研究表明，SRP的主要活性成分通過增強UA排泄、抑制UA合成和抵抗炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療HN的作用，且優(yōu)勢明顯。

本研究結(jié)果顯示，SRP治療HN的主要潛在靶點為TNF、ALB、MYC、PPARG及STAT3。這5個潛在靶點與主要活性成分的分子對接結(jié)果顯示出較高的結(jié)合能，從而進一步驗證了本研究預(yù)測結(jié)果的可靠性。ALB是一種非急性時相蛋白，在疾病急性期時會減少。有研究表明，痛風(fēng)患者血清中ALB水平顯著降低[21]。TNF-α可由巨噬細胞分泌，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)各個階段，有研究表明腎臟損傷程度與TNF-α水平呈正相關(guān)[22]。TNF-α作為前炎癥細胞因子，可加重中性粒細胞炎癥反應(yīng)，迅速放大炎癥反應(yīng)，是腎臟炎癥的產(chǎn)生和持續(xù)的關(guān)鍵因子[23-24]。TNF抑制劑不僅能改善炎癥反應(yīng)，還可以輔助降UA治療[25]。PPARG是一種過氧化物酶體增殖受體，具有調(diào)節(jié)炎癥的作用[26]。PPARG激動劑可通過增加腎病大鼠外周組織的血管生成素樣蛋白4的表達來減少蛋白尿的產(chǎn)生，從而保護腎臟[27]。MYC是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控細胞生長、增殖和凋亡等生物過程中的許多基因[28]。此外，MYC可參與分泌型糖蛋白/β-鏈蛋白（Wnt/β-catenin）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase/protein kinase B，PI3K/ Akt）通路，與腎病的發(fā)病有關(guān)[29]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，活化的STAT3在機體免疫反應(yīng)、修復(fù)損傷等多種生理病理過程中發(fā)揮著重要的作用[30]。IL-6可以活化STAT3，并誘導(dǎo)多種炎性因子表達，從而促進炎癥反應(yīng)[31-32]。

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，SRP可能通過作用于NK-κB信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路以及癌癥信號通路對氮化合物、外來刺激及細菌來源分子產(chǎn)生反應(yīng)，并且通過靶向轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合以及細胞因子受體結(jié)合對ALB、PPARG、MYC、STAT3及TNF等靶點進行調(diào)控，而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)UA合成代謝及改善腎臟損傷的作用。AGE-RAGE信號通路與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，可通過提高絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化水平，而促進TNF-α、IL-1及IL-6等炎性因子的表達[33]。腎臟對于缺氧環(huán)境非常敏感，而以小管間質(zhì)病變?yōu)橹鞯哪I臟疾病會由于水腫以及炎癥等反應(yīng)導(dǎo)致局部血和氧的運輸[34]。大多數(shù)慢性腎病都存在進行性纖維化以及腎臟微血管丟失導(dǎo)致的局部缺氧缺血，小鼠肝纖維化模型中檢測到缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達，且其表達量與腎間質(zhì)纖維化程度有關(guān)[35-36]。qRT-PCR結(jié)果顯示，SRP能夠顯著降低HN大鼠腎組織中α、、等炎癥因子表達，且優(yōu)于別嘌醇，說明SRP在治療高尿酸血癥大鼠中主要發(fā)揮抗炎、減少滲出等作用，且基本能恢復(fù)到正常水平，更進一步說明SRP治療高尿酸血癥腎病的多靶向高效性。

腸道菌群的紊亂通常表現(xiàn)在腸道微生物菌群多樣性的改變以及群落結(jié)構(gòu)組成的變化。在門水平上，SRP可以降低擬桿菌門的相對豐度、提高厚壁菌門的相對豐度以及降低擬桿菌門和厚壁菌門比值[37]。研究表明，擬桿菌等細菌與UA水平呈正相關(guān)，且擬桿菌能夠產(chǎn)生血清及盲腸內(nèi)毒素，進而引發(fā)全身慢性低度炎癥反應(yīng)[38]。厚壁菌門可以產(chǎn)生丁酸，且直腸給予丁酸可以有效改善體內(nèi)UA代謝[39-40]。乳桿菌是腸道中重要的有益菌，患有高尿酸血癥會導(dǎo)致乳桿菌等有益菌群數(shù)量減少，因此一些特征菌屬可作為高尿酸血癥的靶微生物[41]。本研究結(jié)果顯示，SRP能夠上調(diào)乳桿菌的相對豐度，因此乳桿菌可能是SRP的靶細菌之一。阿克曼菌與腸上皮細胞的黏蛋白以及倡導(dǎo)屏障有關(guān)，并且其代謝物能夠通過降低腸道通透性從而調(diào)節(jié)免疫[42]。由此可見，SRP能夠提高糞便中丁酸的含量，并富集產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益菌群。

高尿酸血癥引起腎臟損傷與腸道菌群的變化有關(guān)[43-44]。腸道菌群通過參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，能夠產(chǎn)生氧化三甲胺（trimethylamine-oxide，TMAO）等代謝物影響HN的發(fā)展。TMAO能通過上調(diào)巨噬細胞清道夫受體，促進血管斑塊的形成，釋放炎癥因子，導(dǎo)致血管炎癥反應(yīng)，而加重腎臟損傷[45-46]。巨噬細胞上的內(nèi)源性G蛋白偶聯(lián)受體5（G protein coupled receptor 5，TGR5）參與炎癥反應(yīng)中的許多重要過程，如NF-κB信號通路。膽汁酸（bile acids，BAs）是TGR5的配體且也是腸道菌群的主要產(chǎn)物。TGR5受體被激活后還會抑制NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）激酶的磷酸化，降低NF-κB的活性，從而影響巨噬細胞的炎癥反應(yīng)[47]。短鏈脂肪酸具有增強腸道屏障以及抑制腸道炎癥的功能，丁酸作為短鏈脂肪酸的一種，可以通過減少IL-1β的合成與釋放，有效減輕炎癥反應(yīng)[48]。另有研究表明，丁酸可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路、AGE-RAGE信號通路等炎癥通路的活性，抑制炎癥因子的釋放[49-50]。以上結(jié)果表明腸道菌群通過作用于NF-κB信號通路以及AGE-RAGE信號通路等產(chǎn)生炎性因子，從而影響HN的發(fā)生發(fā)展。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，SRP治療HN的靶點所富集的通路與腸道菌群影響腎病的通路NF-κB和AGE-RAGE一致，所涉及的靶點主要有炎性蛋白如ALB、TNF及PPARG等。表明SRP可能通過調(diào)節(jié)NF-κB通路以及AGE-RAGE通路來影響體內(nèi)炎性因子的合成與釋放，從而改善由腸道菌群失調(diào)所導(dǎo)致的HN。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)及腸道菌群，探討了SRP治療HN的作用機制，并找出其可能的潛在靶點，利用動物實驗驗證了該靶點，體現(xiàn)了SRP具有多組分、多靶點和多途徑的特點，為SRP治療HN提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Tibetan medicine Shiwuwei Rupeng Pills on hyperuricemia nephropathy based on intestinal flora and systematic pharmacology

XIE Hao-chen1, ZHANG Bo-heng2, Mukaram Amatjan2, LI Na2, HE Peng-ke2, YAN Heng-xiu2, SHAO Xiao-ni2

1. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To explore the mechanism of Tibetan medicine Shiwuwei Rupeng Pills (十五味乳鵬丸, SRP) on hyperuricemic nephropathy (HN) from multiple dimensions based on intestinal flora, network pharmacology and molecular docking technology.HN rats model was established by adenine combined with ethambutol, and rats were divided into control group, model group, allopurinol (50 mg/kg) group, SRP high-and low-dose (1.2, 0.4 g/kg) groups. After continuous administration for 14 d, levels of uric acid (UA), creatinine (CREA) and urea nitrogen (BUN) in serum of rats were detected; Pathological changes of kidney tissue was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. SRP and HN core targets were obtained, “drug-active ingredient-targets” and protein-protein interaction (PPI) networks were constructed, gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis on potential targets were performed; Molecular docking technology was used to simulate the binding activity of key components and core targets. qRT-PCR was used to verify the mRNA expression of key targets in kidney tissue of rats in each group; Rat feces were collected, and 16S rDNA high-throughput sequencing was used to detect changes in intestinal flora.SRP significantly decreased the levels of UA, CREA and BUN in serum of HN rats (< 0.05), ameliorated the pathological damage of renal tissue. SRP played an anti-HN role by acting on advanced glycation end products (AGE)-receptor for advanced glycation end products (RAGE), interleukin-17 (IL-17), tumor necrosis factor (TNF) and other signaling pathways. Albumin (ALB), TNF, peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and bone marrow Myelocytomatosis viral oncogene (MYC) had good docking activity with luteolin, quercetin, kaempferol, epigallocatechin gallate and catechin. SRP significantly down-regulated the mRNA expression levels of,andin kidney tissue of HN rats (< 0.05), and significantly up-regulated the expression level ofmRNA (< 0.05). Compared with model group, SRP significantly increased the richness and diversity of intestinal flora, and decreased the proportions of bacteroidetes and firmicutes at phylum level; mainly decreased,,andGa6A1 group, increased the relative abundance ofand Ruminococcaceae UCG-014.SRP can exert anti-HN effect by regulating the structure of intestinal flora, regulating expression of AGE-RAGE, IL-17, TNF and other signaling pathways related targets, and has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway treatment.

Shiwuwei Rupeng Pills; hyperuricemia nephropathy; intestinal flora; network pharmacology; molecular docking; tumor necrosis factor; peroxisome proliferator-activated receptor gamma; albumin; signal transducer and activator of transcription 3

R285.5

A

0253 - 2670(2022)19 - 6068 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.013

2022-06-15

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81801086）；四川省自然科學(xué)基金資助項目（2022NSFSC1574）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2021YJ0256）

謝昊宸，男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學(xué)。E-mail: 1024400780@qq.com

邵曉妮，女，博士，研究方向為中藥藥理學(xué)。E-mail: xnshao@swun.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]