左金丸組分中藥配伍組分制備工藝研究

劉斯琪，王如峰

左金丸組分中藥配伍組分制備工藝研究

劉斯琪，王如峰*

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

建立左金丸組分中藥配伍組分制備工藝并對所得組分的主要成分進(jìn)行定性和定量表征。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察最佳提取溶劑、提取時(shí)間和提取次數(shù)；以總生物堿含量為指標(biāo)考察吸附樹脂類型、最佳上樣質(zhì)量濃度、上樣量、徑高比和吸附時(shí)間；采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）和UPLC法對組分中的主要成分進(jìn)行定性和定量分析。所選工藝流程為10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h；提取物用AB-8大孔樹脂柱純化，最佳上樣質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，上樣量為0.12個(gè)柱體積（BV），徑高比為1∶12，吸附時(shí)間為1 h；洗脫溶劑依次為28 BV 40%乙醇，16 BV 60%乙醇，13 BV 95%乙醇。上述工藝流程得到3個(gè)組分，即C40、C60和C95組分。從C40組分中指認(rèn)了31個(gè)成分，主要為黃連生物堿類，其中鹽酸小檗堿含量最高（20.15%）；從C60組分中指認(rèn)了32個(gè)成分，主要為吳茱萸檸檬苦素類，其中檸檬苦素含量最高（15.40%）；從C95組分指認(rèn)了36個(gè)成分，主要為吳茱萸生物堿類，其中吳茱萸次堿含量最高（4.14%）。建立的左金丸組分中藥配伍組分制備工藝重復(fù)性好，所得組分活性成分含量高，質(zhì)量穩(wěn)定，為進(jìn)一步成藥性研究和組分中藥研制奠定基礎(chǔ)。

左金丸；黃連；吳茱萸；組分中藥；UPLC-MS/MS；生物堿；鹽酸小檗堿；檸檬苦素；吳茱萸次堿

左金丸為中醫(yī)經(jīng)典名方，記載于《丹溪心法·火六》卷一，由黃連和吳茱萸以6∶1比例配伍而成。方中黃連解除肝火旺盛，配以吳茱萸調(diào)和藥性，兩者合降胃氣，對胃炎、胃潰瘍療效顯著。左金丸的主要活性成分為生物堿類成分[1]，左金丸總生物堿有治療胃潰瘍的作用[2]。其中，來自黃連的生物堿為異喹啉類，包括小檗堿、表小檗堿、黃連堿、藥根堿等，有消炎、抗菌、抗病毒、抗癌等多種生物活性[3]；來自吳茱萸的生物堿包括吲哚類和喹諾酮類成分，有抗菌[4]、抗炎、保護(hù)心血管等作用[5-6]。除此之外，左金丸還含有來自吳茱萸的檸檬苦素類成分[7]。

左金丸化學(xué)成分相對明確，通過對主成分生物堿類進(jìn)行富集除雜有望開發(fā)成組分中藥。組分中藥是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，遵循方劑配伍原則，采用現(xiàn)代藥物開發(fā)方法和技術(shù)研制而成的現(xiàn)代中藥[8]。組分中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制相對清楚，不僅保留了中藥方劑的優(yōu)勢，而且便于制劑，能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模重復(fù)制備并易于質(zhì)量控制，是中藥現(xiàn)代化的重要體現(xiàn)形式[9]。為了給后續(xù)左金丸主要組分的成藥性研究提供參考，本研究建立了左金丸總生物堿組分的高效制備工藝，并對獲得的配伍組分主要成分進(jìn)行了定性定量表征，為左金丸的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-30AD型超高效液相色譜儀，日本Shimadzhu公司；UPLC-QExactive-MS型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Thermo公司；Shim-pack GIST C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），日本Shimadzhu公司。

1.2 材料

黃連飲片（產(chǎn)地重慶石柱，批號Ⅲ-20190513- YSZ-YC01）、吳茱萸飲片（產(chǎn)地江西九江，批號WZY-20190513-CJJ-YC01）由北京盈科瑞創(chuàng)新醫(yī)藥股份有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖和蕓香科吳茱萸屬植物疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果實(shí)；AB-8型大孔樹脂購自高華偉業(yè)食品添加劑有限公司；D151型弱酸性陽離子交換樹脂購自鄭州和成新材料科技有限公司；95%乙醇購自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；分析純甲酸和色譜純乙腈、甲醇為Thermo Fisher Scientific公司。對照品格蘭地新（批號M08D8S50327）、黃連堿（批號P05M9F55053）、藥根堿（批號Z11M8S35794）、掌葉防己堿（批號W15J9Z52995）、鹽酸小檗堿（批號Y18N8S48598）由上海源葉生物科技有限公司提供；對照品去氫吳茱萸堿（批號PRF9121743）、吳茱萸堿（批號PRF9121741）、吳茱萸次堿（批號PRF9121742）、吳茱萸苦素（批號PRF8082221）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；對照品非洲防己堿（批號RFS- F02902003011）、氧化小檗堿（批號RFS-Y16702008 021）、四氫小檗堿（批號RFS-S08901905023）、檸檬苦素（批號RFS-N00611812016）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；對照品7β-羥基吳茱萸次堿（批號ML-01047）購自無錫鳴鷺醫(yī)藥科技有限公司；對照品表小檗堿（批號180309）購自北京四面體生物科技有限公司；對照品二氫吳茱萸新堿（批號181209）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；所有對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備工藝研究

2.1.1 提取工藝考察 稱取黃連18.0 g和吳茱萸粉末3.0 g（過50目篩），混合后分別加入10倍量純水及30%、50%、70%、80%、95%乙醇回流提取2次，每次1 h，每種溶劑重復(fù)3次。提取液合并后減壓濃縮，冷凍干燥。取冷凍干燥的提取物，通過酸性染料比色法[10]測定總生物堿含量，選擇最優(yōu)提取溶劑。由表1中總生物堿含量可知，最優(yōu)提取溶劑為70%乙醇。

表1 不同溶劑總生物堿提取結(jié)果(, n = 3)

Table 1 Extraction of total alkaloids with different solvents (, n = 3)

提取溶劑提取物量/g生物堿量/g質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%提取率/% 水5.936±0.0821.568±0.09126.417.47 30%乙醇6.190±0.1631.847±0.07829.848.79 50%乙醇6.458±0.2162.183±0.13033.8110.40 70%乙醇5.982±0.0782.274±0.00638.0210.83 80%乙醇5.547±0.0272.201±0.08339.6710.48 95%乙醇4.225±0.0191.703±0.01940.308.11

本研究具有3個(gè)主要考察因素，參考已有文獻(xiàn)報(bào)道[10]分別選擇合適的水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表2），采用70%乙醇，以不同提取時(shí)間、提取次數(shù)和溶劑用量回流提取。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 L(3)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 Designandresults of L(3) orthogonal experiment

試驗(yàn)號A/hB/次C/倍D (誤差)總生物堿提取率/% 11.0 (1)1 (1)8 (1)(1)7.66 21.0 (1)2 (2)10 (2)(2)10.12 31.0 (1)3 (3)12 (3)(3)11.79 41.5 (2)1 (1)10 (2)(3)8.26 51.5 (2)2 (2)12 (3)(1)10.23 61.5 (2)3 (3)8 (1)(2)11.29 72.0 (3)1 (1)12 (3)(2)9.40 82.0 (3)2 (2)8 (1)(3)9.85 92.0 (3)3 (3)10 (2)(1)11.44 K129.5725.3228.8029.33 K229.7830.2029.8230.81 K330.6934.5231.4229.90 R1.129.202.621.48

表3 方差分析結(jié)果

Table 3 Results of variance analysis

誤差來源離差平方和自由度均方F值顯著性 A0.236 320.118 10.636 1 B14.124 127.062 038.020 2P＜0.05 C1.162 820.581 43.130 0 D (誤差)0.371 520.185 7

0.05(2, 2)＝19.000.01(2, 2)＝99.00

從上述結(jié)果可以看出，A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1，最優(yōu)工藝為A3B3C3，即12倍量70%乙醇回流提取3次，每次2.0 h。其中因素B為顯著性影響因素，其極差和值都明顯高于其他2個(gè)因素，而A和C為不顯著性因素，對總生物堿提取效率影響較小。對最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)A3B3C3的總生物堿提取率為11.67%（＝3）。

2.1.2 色譜填料考察 取最優(yōu)提取溶劑提取液，減壓濃縮后冷凍干燥，測定總生物堿含量。根據(jù)已有關(guān)于左金丸及組方藥化學(xué)成分制備的文獻(xiàn)報(bào)道，選擇AB-8型大孔樹脂[10]和D151型弱酸性陽離子交換樹脂[11-13]作為考察對象。精密稱取0.70、0.80、0.70 g AB-8型大孔吸附樹脂和3份1.0 g D151型離子交換樹脂，分別加入80 mL藥液（總生物堿量0.56 mg/mL），25 ℃、150 r/min振搖吸附12 h，檢測上清液總生物堿含量。棄去全部上清后用純水洗滌樹脂2次，AB-8大孔樹脂中加入70%乙醇，D151離子交換樹脂中加入等量含10%冰醋酸的70%乙醇溶液，25 ℃、150 r/min振搖解吸附12 h，取上清液測定總生物堿含量。根據(jù)公式確定2種樹脂的吸附能力。

吸附量＝(0－1)/

吸附率＝(0－1)/0

解吸量＝2/

解吸率＝2/(0－1)

轉(zhuǎn)移率＝吸附率×洗脫率

為樹脂質(zhì)量，0為吸附開始時(shí)上清中生物堿含量，1為吸附完成后上清液中生物堿含量，0為吸附開始時(shí)上清液中生物堿含量，1為吸附完成后上清液中生物堿含量，2為洗脫完成后上清液中生物堿含量

2種樹脂的吸附量、吸附率、解吸量、解吸率結(jié)果如表4所示。從單位質(zhì)量吸附能力看，AB-8型大孔樹脂遠(yuǎn)高于D151型離子交換樹脂，前者的解吸附能力也明顯強(qiáng)于后者，因此，選擇AB-8型大孔樹脂。

表4 AB-8及D151樹脂吸附-解吸情況(, n = 3)

Table 4 Adsorption-desorption of AB-8 and D151 resins (, n = 3)

樹脂類型吸附量/(mg?g?1)吸附率/%解吸量/(mg?g?1)解吸率/% AB-858.19±4.0595.26±0.7453.74±4.1092.32±0.66 D15143.69±0.1497.89±0.3039.81±0.9090.98±2.18

2.1.3 色譜參數(shù)考察 取AB-8型大孔樹脂進(jìn)行單因素考察：考察上樣質(zhì)量濃度時(shí)設(shè)定大孔樹脂徑高比為1∶10，設(shè)置參數(shù)為生藥0.3、0.5、0.7 g/mL；考察徑高比時(shí)設(shè)定上樣質(zhì)量濃度為生藥0.5 g/mL，設(shè)置參數(shù)為1∶10、1∶12、1∶14；考察上樣體積時(shí)設(shè)定上樣質(zhì)量濃度為生藥0.5 g/mL，徑高比1∶12，設(shè)置參數(shù)為0.04、0.08、0.12、0.16個(gè)柱體積（BV）；考察吸附時(shí)間時(shí)設(shè)定上樣質(zhì)量濃度為生藥0.5 g/mL，徑高比1∶12，上樣體積0.12 BV，設(shè)置參數(shù)為5、15、30 min及1、3、12 h。藥液均按照相同體積流量上樣，出現(xiàn)碘化鉍鉀陽性反應(yīng)時(shí)停止，計(jì)算上樣生物堿總量（1）。用水以相同體積流量洗脫至Molish反應(yīng)陰性，計(jì)算水洗脫生物堿量（2）。最后用70%乙醇洗脫至碘化鉍鉀反應(yīng)陰性，計(jì)算洗脫下的生物堿含量（3）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)公式計(jì)算吸附-洗脫率，確定最優(yōu)上樣方法。結(jié)果見表5～8。

吸附-洗脫率＝3/(1－2)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表5～8），上樣質(zhì)量濃度與徑高比均選擇吸附-洗脫率較高的生藥0.5 g/mL和1∶12?？紤]到按照0.16 BV上樣會(huì)導(dǎo)致泄露，因此，上樣體積選擇吸附-洗脫率相對較高的0.12 BV。吸附時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)1 h后總生物堿的吸附基本飽和，因此選擇1 h作為吸附時(shí)間。工藝考察結(jié)果確定工藝流程為AB-8型大孔樹脂徑高比1∶12，左金丸提取液生藥0.5 g/mL上樣0.12 BV，吸附1 h后分別采用28 BV 40%乙醇、16 BV 60%乙醇、13 BV 95%乙醇洗脫。采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行分段洗脫，HPLC動(dòng)態(tài)檢測生物堿含量變化，確定梯度洗脫溶劑為40%、60%、95%乙醇。按照所得最優(yōu)工藝流程進(jìn)行組分制備，將各組分收集后減壓濃縮，冷凍干燥后測定總生物堿含量，分別得到C40（40%乙醇洗脫）、C60（60%乙醇洗脫）、C95（95%乙醇洗脫）組分。工藝重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表9所示。由表9可知，C40組分的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.13%，轉(zhuǎn)移率高達(dá)70%以上；C60組分和C95組分的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.90%、11.19%。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行性良好。

表5 上樣質(zhì)量濃度考察結(jié)果(, n = 3)

Table 5 Results of loading concentrationinvestigation (, n = 3)

上樣質(zhì)量濃度/(g?mL?1)吸附-洗脫率/% 0.362.35±0.69 0.583.73±3.73 0.772.53±1.07

表6 徑高比考察結(jié)果(, n = 3)

Table 6 Results of diameter-height ratioinvestigation (, n = 3)

徑高比吸附-洗脫率/% 1∶1074.41±6.34 1∶1279.40±1.97 1∶1477.78±3.89

表7 上樣體積考察結(jié)果(, n = 3)

Table 7 Results of loading quantityinvestigation (, n = 3)

上樣體積/BV吸附-洗脫率/%上樣體積/BV吸附-洗脫率/% 0.0457.02±2.230.1264.34±0.94 0.0865.18±4.530.1673.69±8.07

表8 吸附時(shí)間考察結(jié)果(, n = 3)

Table 8 Results of adsorption timeinvestigation (, n = 3)

吸附時(shí)間/min總生物堿/μg吸附時(shí)間/h總生物堿/μg 5437.12±50.77194.53±4.70 15158.00±22.01389.84±5.87 30120.23±22.871287.45±17.70

表9 工藝驗(yàn)證結(jié)果

Table 9 Results of process validation

組分生物堿質(zhì)量/mg (質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%)轉(zhuǎn)移率/% 123平均值 C401 461.30 (59.80)1 476.80 (65.46)1 531.10 (58.23)1 489.73 (61.13)70.05 C6041.80 (9.58)32.90 (10.21)43.70 (4.55)39.47 (7.90)0.24 C9515.10 (10.26)16.10 (11.04)16.70 (12.19)15.97 (11.19)0.14

2.2 工藝組分主要成分分析

2.2.1 定性分析 將C40、C60、C95組分分別定容至50、10、10 mL，甲醇稀釋后0.22 μm濾膜濾過，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。流動(dòng)相為0.05%甲酸水溶液和乙腈，體積流量為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL，柱溫35 ℃。C40組分洗脫梯度為0～57 min，5%～9.7%乙腈；57～100 min，9.7%～17%乙腈；100～110 min，17%乙腈；110～140 min，17%～100%乙腈；140～141 min，100%乙腈；141～145 min，100%～5%乙腈；145～150 min，5%乙腈。C60組分洗脫梯度為0～19.5 min，5%～23%乙腈；19.5～40 min，23%～40%乙腈；40～50 min，40%～100%乙腈；50～51 min，100%乙腈；51～55 min，100%～5%乙腈；55～60 min，5%乙腈。C95組分洗脫梯度為0～24 min，5%～22.6%乙腈；24～27 min，22.6%～23.6%乙腈；27～30 min，23.6%～24%乙腈；30～31 min，24%～29%乙腈；31～67 min，29%乙腈；67～74 min，29%～40%乙腈；74～100 min，40%～100%乙腈；100～101 min，100%乙腈；101～105 min，100%～5%乙腈；105～110 min，5%乙腈。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，分別進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式掃描，掃描碎片質(zhì)量范圍為100～1000，分辨率為70 000。碎裂電壓為3500 V，鞘氣流量為17 L/min，輔助氣流量為5.7 L/min，毛細(xì)管溫度為320 ℃。根據(jù)總離子流圖和二級離子流圖，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，采用Xcalibur軟件（誤差≤5×10?6）分析碎片信息，推測化學(xué)成分。

從3個(gè)組分中共指認(rèn)了80個(gè)化合物。從C40組分指認(rèn)了31個(gè)成分，主要為黃連的生物堿成分；從C60組分指認(rèn)了32個(gè)成分，主要為檸檬苦素類成分和部分生物堿成分；從C95組分指認(rèn)了36個(gè)成分，主要為吳茱萸的吲哚類和喹諾酮類生物堿?？傠x子流圖如圖1所示，具體結(jié)果如表10所示。

2.2.2 定量分析 將C40、C60、C95組分分別定容至50、10、10 mL，甲醇稀釋后0.22 μm濾膜濾過，進(jìn)行UPLC分析（圖2）。C40和C95組分流動(dòng)相由0.05%甲酸水溶液和乙腈組成，C60組分流動(dòng)相由0.05%磷酸水溶液和乙腈組成。體積流量為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為3 μL，柱溫35 ℃。C40組分洗脫梯度為0～57 min，5%～9.7%乙腈；57～92 min，9.7%～14%乙腈；92～100 min，14%～17%乙腈；100～140 min，17%乙腈；140～150 min，17%～100%乙腈；150～151 min，100%乙腈；151～160 min，100%～5%乙腈；160～165 min，5%乙腈；檢測波長為327 nm；C60組分洗脫梯度為0～19.5 min，5%～23%乙腈；19.5～37.6 min，23%～28.6%乙腈；37.6～43.5 min，28.6%乙腈；43.5～54.5 min，28.6～33%乙腈；54.5～74.5 min，33%～43%乙腈；74.5～90 min，43%～100%乙腈；90～91 min，100%乙腈；91～95 min，100%～5%乙腈；95～100 min，5%乙腈；檢測波長為210 nm；C95組分洗脫梯度為0～24 min，5%～22.6%乙腈；24～27 min，22.6%～23.6%乙腈；27～30 min，23.6%～24%乙腈；30～31 min，24%～29%乙腈；31～67 min，29%乙腈；67～74 min，29%～40%乙腈；74～100 min，40%～100%乙腈；100～101 min，100%乙腈；101～105 min，100%～5%乙腈；105～110 min，5%乙腈；檢測波長為327 nm和240 nm[22-23]。參照《中國藥典》2020年版[24]規(guī)定進(jìn)行方法學(xué)考察試驗(yàn)。精密稱取格蘭地新、去氫吳茱萸堿、黃連堿、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿、鹽酸小檗堿、掌葉防己堿、四氫小檗堿、吳茱萸苦素、檸檬苦素、吳茱萸堿、7β-羥基吳茱萸次堿、氧化小檗堿、吳茱萸次堿、二氫吳茱萸新堿對照品適量，用甲醇定容至1.0 mg/mL，取適量對照品溶液進(jìn)行梯度稀釋，得混合對照品溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測下限為信噪比（/）＝3，定量下限為/＝10。在檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所有化合物的線性關(guān)系均良好（≥0.999 3）。回歸方程、值、線性范圍、檢測下限和定量下限如表11所示。

A-C40組分正離子模式 B-C40組分負(fù)離子模式 C-C60組分正離子模式 D-C60組分負(fù)離子模式 E-C95組分正離子模式 F-C95組分負(fù)離子模式

表10 工藝組分主要成分定性分析結(jié)果

Table 10 Results of qualitative analysis of main compounds in each component

組分化合物分子式tR/minm/z模式二級離子碎片 (m/z) C40鹽酸小檗堿[14]C20H18NO4+100.14336.121 8正320.090 91, 306.075 32, 292.096 04, 278.080 81 C40格蘭地新[14]C19H16NO4+70.72322.106 3正307.083 07, 279.088 32 C40去氫吳茱萸堿[14]C19H16N3O+74.62302.127 7正286.096 50, 258.130 75 C40黃連堿[14]C19H14NO4+80.56320.090 5正292.095 95, 277.072 66, 262.085 27 C40表小檗堿[14]C20H18NO4+85.84336.121 9正320.091 00, 292.096 25 C40非洲防己堿[14]C20H20NO4+87.90338.141 6正323.118 01, 308.094 36, 293.070 89, 280.464 94 C40藥根堿[14]C20H20NO4+90.07338.137 5正323.114 26, 322.106 45, 308.090 67, 294.111 63 C40掌葉防己堿[14]C21H22NO4+104.53352.153 3正336.122 10, 322.106 57, 308.127 32, 294.111 63 C40甲基黃連堿[15]C20H15NO495.16334.106 2正304.096 19 C402-羥基藥根堿[14]C19H18NO4+69.34324.121 7正308.090 91, 294.075 23, 280.096 10 C4013-甲基小檗堿[14]C21H20NO4+97.51350.137 6正320.091 03, 306.111 60 C40蘋果酸[16]C4H6O50.86133.014 8負(fù)115.004 13, 71.013 73 C40檸檬酸[17]C6H8O70.94190.929 2負(fù)154.999 42, 111.009 18, 85.029 55 C40咖啡酰葡萄糖酸[17]C15H18O101.11357.063 5負(fù)195.052 02, 179.036 01, 135.045 82 C40異檸檬酸[17]C6H8O71.35190.929 2負(fù)154.999 37, 111.009 14, 85.029 51 C40腺苷[18]C10H13N5O41.61268.103 2正136.061 49 C40苯丙氨酸[18]C9H11NO22.63166.085 8正120.080 67, 102.970 41 C40迷迭香酸[18]C18H16O83.04359.100 2負(fù)197.046 46, 179.035 81, 135.045 76, 123.045 68 C40丹參素[19]C9H10O53.06197.046 5負(fù)179.035 81, 135.045 72, 123.045 62 C40香樹素-7-O-β-D-葡萄糖苷[17]C21H22O113.06449.095 8負(fù)286.942 87, 268.977 08 C404-O-β-D-葡萄糖基香草醇[17]C14H20O84.28315.110 0負(fù)153.056 44 C40原兒茶酸[18,20]C7H6O44.48153.020 0負(fù)109.029 85, 91.019 14, 81.034 55 C40L-色氨酸[19]C11H12N2O25.34203.083 6負(fù)159.093 48, 142.066 80, 116.050 98 C40原兒茶醛[18,20]C7H6O36.44137.025 0負(fù)119.014 11, 108.021 99, 81.034 52 C40阿魏?？鼘幩醄17]C17H20O911.56367.105 3負(fù)193.051 44, 191.056 96 C40綠原酸[17]C16H18O912.79353.089 5負(fù)191.056 96, 179.035 80, 161.025 18 C40姜黃素[18]C21H20O613.66369.116 6正177.054 15, 145.028 06, 117.033 45, 89.038 86 C40阿魏酰葡萄糖酸[17]C16H20O1026.57371.100 3負(fù)195.052 05, 193.051 62, 134.037 92 C40二氫吳茱萸定[14]C18H22NO5+89.55332.138 3正317.115 05, 302.091 58 C40wuchuyuamide Ⅱ[17]C19H17N3O3106.16336.121 8正318.075 62, 304.096 50, 161.141 33 C40吳茱萸苦素[17]C26H30O9118.93485.184 1負(fù)423.183 65, 397.167 79, 383.152 50 C60檸檬苦素[17]C26H30O834.21471.199 9正427.210 30, 425.194 52, 161.059 25 C60吳茱萸苦素[17]C26H30O931.51485.183 2負(fù)423.182 80, 397.166 96, 383.151 31 C606β-乙酰氧基-5-表檸檬苦素[17]C28H32O1037.52527.194 0負(fù)485.183 41, 467.172 49, 383.151 15 C60吳茱萸內(nèi)酯醇[17]C26H28O935.94483.167 6負(fù)421.167 18, 395.151 49, 161.061 29 C60石虎檸檬素A[17]C26H30O1031.11501.178 4負(fù)471.167 48, 411.146 24, 235.876 02 C60吳茱萸苦素乙酸酯[17]C28H32O1023.86529.205 1正485.215 39, 469.184 48, 451.173 77, 425.194 49, 393.131 99, 367.152 92 C602-羥基藥根堿[14]C19H18NO4+15.95324.121 8正308.090 70, 294.075 13, 280.096 01, 266.081 21 C60甲基黃連堿[15]C20H15NO421.14334.106 0正304.096 01 C60γ-氨基丁酸[18]C4H9NO20.76104.107 1正87.044 33, 69.034 00

續(xù)表10

續(xù)表10

組分化合物分子式tR/minm/z模式二級離子碎片 (m/z) C951-甲基-2-[(4Z,7Z)-十三碳-4,7-二烯基]-4(1H)-喹諾酮[17]C23H31NO85.43338.246 6正186.090 94, 173.083 15 C951-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹諾酮[17]C21H31NO86.20314.246 8正186.091 02, 173.083 39 C951-甲基-2-[(6Z,9Z,12E)-十五碳-6,9,12-三烯基]-4(1H)-喹諾酮[17]C25H33NO86.52364.262 5正186.090 96, 173.083 21 C95吳茱萸卡品堿[17]C23H33NO87.29340.262 5正256.169 07, 242.153 27, 228.137 60, 200.106 40, 186.090 90, 173.083 15 C952-十三烷基-4(1H)-喹諾酮[17]C22H33NO88.11328.262 4正186.091 09, 173.083 15 C951-甲基-2-[(6Z,9Z)-十五碳-6,9-二烯基]-4(1H)-喹諾酮[17]C25H35NO88.63366.278 2正228.137 85, 186.090 91, 173.083 16 C95二氫吳茱萸卡品堿[17]C23H35NO90.13342.278 2正186.091 03, 173.083 25 C951-甲基-2-[(Z)-十五碳-10-烯基]-4(1H)-喹諾酮[17]C25H37NO90.98368.293 9正173.083 28, 186.090 82 C95格羅苦素甲或異構(gòu)體[18]C26H30O1026.80501.179 0負(fù)457.189 30, 413.199 13 C95格羅苦素甲或異構(gòu)體[18]C26H30O1027.98501.178 9負(fù)457.189 30, 413.199 28 C95wuchuyuamide Ⅱ[17]C19H17N3O329.63336.133 1正318.122 89, 161.070 60, 134.059 78 C95euodirutaecin A[17]C26H28O1129.85515.158 3負(fù)471.168 40, 383.152 40, 146.918 72 C95euodirutaecin B[17]C26H28O1130.83515.158 3負(fù)471.168 30, 383.153 99 C95吳茱萸苦素[17]C26H30O938.71485.184 0負(fù)423.183 62, 397.168 03, 383.152 22 C95吳茱萸內(nèi)酯醇[17]C26H28O950.96483.168 3負(fù)421.167 97, 395.152 44, 161.061 65 C95吳茱萸酰胺[17]C19H21N3O53.22308.174 7正134.059 81 C95吳茱萸苦素乙酸酯[17]C28H32O1060.98527.194 6負(fù)485.183 87, 467.173 25, 383.152 01 C956-β-乙酰氧基-5-表檸檬苦素[17]C28H32O1064.78527.194 8負(fù)485.184 20, 467.173 95, 383.151 89

A-C40組分 B-C40對照品 C-C60組分 D-C60對照品 E-C95組分 F-C95對照品 1-格蘭地新 2-去氫吳茱萸堿 3-黃連堿 4-表小檗堿 5-非洲防己堿 6-藥根堿 7-鹽酸小檗堿 8-掌葉防己堿 9-去氫吳茱萸堿 10-四氫小檗堿 11-吳茱萸苦素 12-檸檬苦素 13-吳茱萸堿 14-去氫吳茱萸堿 15-7β-羥基吳茱萸次堿 16-氧化小檗堿 17-吳茱萸堿 18-吳茱萸次堿 19-二氫吳茱萸新堿

表11 化合物回歸方程、檢測下限及定量下限

Table 11 Regression equation, lower limit of detection and quantification of compounds

組分化合物回歸方程r線性范圍/(μg?mL?1)檢測下限/(μg?mL?1)定量下限/(μg?mL?1) C40格蘭地新Y＝10 117 X－1 521.80.999 82～500.180.58 去氫吳茱萸堿Y＝9 775 X－5 061.80.999 51～200.200.66 黃連堿Y＝10 228 X－3 765.80.999 31～200.180.60 表小檗堿Y＝19 014 X－1 109.90.999 71～200.070.24 非洲防己堿Y＝21 611 X－4 192.50.999 61～200.060.21 藥根堿Y＝20 815 X－5 620.30.999 71～200.070.24 鹽酸小檗堿Y＝22 361 X＋2 254.50.999 41～200.120.40 掌葉防己堿Y＝21 499 X－46480.999 31～200.130.42 C60去氫吳茱萸堿Y＝29 850 X＋2 890.10.999 90.5～500.020.06 四氫小檗堿Y＝55 653 X＋1 618.20.999 90.2～200.010.03 吳茱萸苦素Y＝3 442.4 X－351.020.999 91～500.220.74 檸檬苦素Y＝3 849.4 X－2 366.60.999 72～1000.160.53 吳茱萸堿Y＝41 303 X－1 249.30.999 90.1～500.0040.014 C95去氫吳茱萸堿Y＝12 111 X＋82.4930.999 91～200.050.17 7β-羥基吳茱萸次堿Y＝17 162 X－2 116.90.999 91～200.120.40 氧化小檗堿Y＝19 842 X－23140.999 91～200.100.32 吳茱萸堿Y＝20 749 X－2 555.50.999 91～200.080.27 吳茱萸次堿Y＝31 707 X－1 453.20.999 92～500.040.12 二氫吳茱萸新堿Y＝9 219.5 X－54.690.999 91～200.060.21

2.2.3 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得質(zhì)量濃度，計(jì)算其RSD值，得日內(nèi)精密度結(jié)果。連續(xù)6 d分析同一混合對照品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得質(zhì)量濃度，計(jì)算其RSD值，得日間精密度。結(jié)果日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為0.410 4%～1.777 5%和0.194 4%～ 1.881 4%，說明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行UPLC檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積求得濃度，計(jì)算RSD值。RSD為0.313 0%～1.854 0%，說明方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12、24 h檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得質(zhì)量濃度，計(jì)算RSD值。24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為0.407 3%～1.899 9%，說明樣品穩(wěn)定。

（4）加樣回收率試驗(yàn)：取各成分質(zhì)量濃度已知的供試品溶液6份，按照供試品中各成分含量的50%～150%向其中精密加入已知質(zhì)量濃度的對照品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得質(zhì)量濃度，得總檢測量。按照公式加樣回收率＝(檢測量－初始量)/加入量計(jì)算各成分回收百分比和RSD值。結(jié)果得加樣回收率為98.37%～101.57%，RSD為0.515 9%～1.937 0%（表12），符合檢測要求。

2.2.4 樣品測定 3個(gè)工藝組分中主要生物堿成分的含量測定結(jié)果見表13。從表13中可知，C40組分中含量最高的成分為鹽酸小檗堿，其次為黃連堿、掌葉防己堿和表小檗堿；C60組分中檸檬苦素含量最高，與吳茱萸苦素同為三萜苦素類成分，二者相加含量遠(yuǎn)高于其他成分；C95組分中吳茱萸堿和吳茱萸次堿是主要成分，二者相加占該組分生物堿總量的55%以上。

表12 加樣回收率結(jié)果

Table 12 Results of recovery test

組分化合物初始量/μg加入量/μg檢測量/μg回收率/%RSD/%組分化合物初始量/μg加入量/μg檢測量/μg回收率/%RSD/% C40格蘭地新2.382.204.58±0.0399.891.230 9C60吳茱萸苦素6.909.5016.44±0.12100.431.248 0 去氫吳茱萸堿0.870.841.71±0.01100.541.482 9 檸檬苦素21.7129.2950.55±0.6898.781.905 3 黃連堿2.522.314.86±0.03101.211.343 5 吳茱萸堿0.310.390.71±0.01101.531.937 0 表小檗堿1.040.951.99±0.0199.711.557 4C95去氫吳茱萸堿3.351.955.28±0.0499.911.241 2 非洲防己堿0.730.651.39±0.01100.901.675 9 7β-羥基吳茱萸次堿1.971.803.76±0.0299.661.257 2 藥根堿0.540.420.96±0.00100.960.738 3 氧化小檗堿2.372.635.01±0.03100.351.137 2 鹽酸小檗堿9.7711.3821.26±0.15100.971.264 5 吳茱萸堿4.473.728.19±0.02100.090.515 9 掌葉防己堿1.671.613.28±0.02100.031.544 9 吳茱萸次堿11.1312.1023.32±0.08100.760.686 2 C60去氫吳茱萸堿2.363.345.67±0.0898.371.673 5 二氫吳茱萸新堿1.110.952.05±0.0199.021.173 6 四氫小檗堿0.130.190.32±0.00101.571.446 5

表13 樣品中主要成分含量

Table 13 Contents of main compounds in samples

組分化合物測得量/mg占該組分生物堿比/%占該組分洗脫總量比/%組分化合物測得量/mg占該組分生物堿比/%占該組分洗脫總量比/% C40鹽酸小檗堿300.17±16.4332.9620.15C60去氫吳茱萸堿2.71±0.7786.866.87 黃連堿77.91±4.898.565.23 吳茱萸堿0.10±0.023.210.25 掌葉防己堿51.80±3.275.693.48 四氫小檗堿0.04±0.011.280.10 表小檗堿32.01±1.963.512.15C95吳茱萸次堿0.66±0.0236.934.14 非洲防己堿21.96±0.942.411.47 吳茱萸堿0.33±0.0118.442.07 格蘭地新17.69±0.301.941.19 7β-羥基吳茱萸次堿0.15±0.018.320.93 藥根堿16.61±0.861.821.11 二氫吳茱萸新堿0.10±0.015.750.64 去氫吳茱萸堿8.66±0.390.950.58 去氫吳茱萸堿0.10±0.015.470.61 C60檸檬苦素6.08±0.20?15.40 氧化小檗堿0.41±0.0522.682.54 吳茱萸苦素2.07±0.31?5.24

3 討論

3.1 制備工藝建立

左金丸以生物堿類為主要活性成分，但是還含有一定數(shù)量的檸檬苦素類成分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，檸檬苦素類成分雖然具有多種藥理活性，但同時(shí)還存在基因毒性，可致肝損傷[7]、細(xì)胞突變和染色體畸變[25-26]，而且與左金丸主要功效的相關(guān)性不大。在組分中藥理論指導(dǎo)下，將檸檬苦素類與生物堿類分別富集，進(jìn)行藥效學(xué)和藥理學(xué)研究，有助于高效低毒的現(xiàn)代中藥研制。黃連中的生物堿多為異喹啉類生物堿，極性較大，而吳茱萸中的生物堿為吲哚類和喹諾酮類生物堿，極性較小。二者在色譜行為方面存在差異，在色譜洗脫過程中很難采用一種溶劑或一個(gè)梯度進(jìn)行高效洗脫。已有研究報(bào)道，采用大孔樹脂柱和單一洗脫梯度純化，所得左金丸總生物堿的含量較低（38.47%）[10]。而且，這種洗脫方式也不能將吳茱萸中的檸檬苦素類分離出來。為此，本研究采用組分中藥研究中的色譜極性分段篩選方法，通過調(diào)整溶劑極性并分段洗脫的方式達(dá)到分離的目的。

3.2 定性定量研究

工藝所得C40組分主要含有31種化合物，其中含量最高的成分為鹽酸小檗堿。該組分總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)61.13%，絕大部分為黃連生物堿，是最主要的生物堿組分。C95組分主要含有36種化合物，其中含量最高的為吳茱萸次堿，大部分為吳茱萸中極性較小的生物堿，包括吲哚和喹諾酮生物堿2個(gè)類別。該組分總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.19%，與C40組分相加超過60%。C60組分主要含有32種化合物，其中含量最高的為檸檬苦素，并且檸檬苦素和吳茱萸苦素二者相加占該組分的20.65%，為優(yōu)勢成分。因此C40和C95是具有潛在生物活性的生物堿類組分，C60組分則為檸檬苦素類組分。定性定量分析進(jìn)一步證實(shí)了采用這種分離工藝可實(shí)現(xiàn)總生物堿和檸檬苦素類的高效分離，在明確各組分的藥理活性和毒性的基礎(chǔ)上，3個(gè)組分按照不同比例進(jìn)行組分配伍研究，可以獲得新型的組分中藥新處方。

本研究建立了重現(xiàn)性好的左金丸配伍組分制備工藝，所得組分活性成分含量高，質(zhì)量穩(wěn)定，為進(jìn)一步的成藥性研究和組分中藥研制奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation process of components for component-based Chinese medicine of Zuojin Pills

LIU Si-qi, WANG Ru-feng

School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To establish the preparation process of components for component-based Chinese medicine of Zuojin Pills (左金丸) and analyze the main compounds of components qualitatively and quantitatively.Orthogonal experimental design was employed to determine the optimal extracting solvent, extracting time and extracting times. The resin type, optimum loading concentration, loading quantity, diameter-height ratio and adsorption time were investigated using total alkaloid content as index. The qualitative and quantitative analysis of main compounds were conducted by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and UPLC, respectively.The selected process was that the powders were extracted with 10 folds of 70% ethanol under reflux two times for 1 h each. AB-8 macroporous resin was selected to purify the extracts. The optimum loading concentration was 0.5 g/mL, loading volume was 0.12 BV, diameter-height ratio was 1:12 and adsorption time was 1 h. The elution was carried out with 28 BV 40% ethanol, 16 BV 60% ethanol and 13 BV 95% ethanol successively to obtain three components, C40, C60 and C95 components. Thirty-one compounds, which were mainly alkaloids from(Huanglian), were identified from C40 component. Among them, the content of berberine was the highest (20.15%). Thirty-two compounds, which were mainly limonoids from(Wuzhuyu), were identified from C60 component. Among them, the content of limonin was the highest (15.40%). Thirty-six compounds, which were mainly alkaloids from, were identified from C95 component. Among them, the content of rutaecarpine was the highest (4.14%).The preparation process established herein is repeatable and the resultant components with high content of active compounds are qualitive stable. This study lays a foundation for further research and development of druggability and component-based Chinese medicine of Zuojin Pills.

Zuojin Pills;;; component-based Chinese medicine; UPLC-MS/MS; alkaloids; berberine hydrochloride; limonin; rutaecarpin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 6001 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.007

2022-04-12

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1704506）

劉斯琪，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)。E-mail: liusiqi_wxjs@163.com

王如峰，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)成分研究工作。Tel: (010)53912163 E-mail: wrf@bucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]