急支糖漿多糖的成分分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)

劉 峰，丁浩然，王夢(mèng)月，李曉波

急支糖漿多糖的成分分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)

劉 峰，丁浩然#，王夢(mèng)月，李曉波*

上海交通大學(xué)，上海 200240

研究急支糖漿多糖組分的化學(xué)成分組成、重均相對(duì)分子質(zhì)量以及單糖組成，并比較不同批次急支糖漿多糖組分，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。采用比色法、高效凝膠色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）和高效陰離子交換色譜法（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）測(cè)定急支糖漿多糖的基本化學(xué)組成、重均相對(duì)分子質(zhì)量及分散系數(shù)、單糖組成。15批急支糖漿多糖的中性多糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為47.60%、33.38%、9.30%；重均相對(duì)分子質(zhì)量及分散系數(shù)分別為11 757～26 367和1.89～2.65。15批急支糖漿多糖中均含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.94、20.13、115.54、99.25、117.45、13.62、6.03、215.23、9.61 μg/mg，物質(zhì)的量比結(jié)果為1.5∶14.4∶100.0∶71.6∶84.7∶9.8∶5.2∶144.1∶6.4。將急支糖漿與川貝枇杷糖漿、杏蘇止咳糖漿、小兒熱速清糖漿和小兒肺熱咳喘口服液進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單糖組成物質(zhì)的量比結(jié)合HPAEC指紋圖譜可用于急支糖漿多糖的質(zhì)量控制。15批急支糖漿多糖的化學(xué)組成、重均相對(duì)分子質(zhì)量及單糖組成具有較高的一致性，HPAEC指紋圖譜具有特異性，可用作急支糖漿多糖的質(zhì)控指標(biāo)。

急支糖漿多糖；化學(xué)成分組成；重均相對(duì)分子質(zhì)量；單糖組成；質(zhì)量控制；巖藻糖；鼠李糖；阿拉伯糖；半乳糖；葡萄糖；甘露糖；木糖；半乳糖醛酸；葡萄糖醛酸

急支糖漿為臨床常用中成藥，由四季青、魚(yú)腥草、金蕎麥、紫菀、前胡、麻黃、枳殼、甘草8味中藥制成，具清熱宣肺、理氣化痰的功效，用于外感風(fēng)熱所致的咳嗽以及急/慢性支氣管炎的急性發(fā)作[1]。目前，《中國(guó)藥典》2020年版急支糖漿項(xiàng)下僅以柚皮苷的含量為質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面地反映急支糖漿整體質(zhì)量[1]。為了提升急支糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥安全、有效，前期本課題組在全面分析急支糖漿小分子成分的基礎(chǔ)上，建立并完善了急支糖漿的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系[2]，建立了“一板多藥味”高效薄層色譜法[3]、“一測(cè)多評(píng)”含量測(cè)定法[4]等高效檢測(cè)方法。

除小分子成分外，多糖也是中藥中一類(lèi)具有重要生物活性的分子，包括抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[5-6]，也是中藥的重要功效成分之一，然而有關(guān)急支糖漿中大分子多糖成分的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)有對(duì)多糖的研究報(bào)道中，基于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對(duì)其質(zhì)量控制的研究相對(duì)較少。《中國(guó)藥典》2020年版主要是檢測(cè)多糖含糖量，有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法2種經(jīng)典定量方法[1]，其中苯 酚-硫酸法不受蛋白質(zhì)干擾，應(yīng)用更普遍。進(jìn)一步表征中藥中多糖成分，包括相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成，是對(duì)其進(jìn)行有效質(zhì)量控制的關(guān)鍵。高效凝膠色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）是檢測(cè)多糖相對(duì)分子質(zhì)量的常用方法[7]。多糖的單糖組成分析主要方法有GC法[8]、HPLC 法[9]、高效陰離子交換色譜法（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）[10]等，其中HPAEC可在堿性流動(dòng)相條件下用陰離子交換柱將糖分離，再用脈沖安培檢測(cè)器直接檢測(cè)，相比于HPLC和GC柱前衍生化方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低，且準(zhǔn)確度和精密度均較高。

為了分析急支糖漿的多糖組分并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究從15批急支糖漿中制備純化水溶性多糖，采用比色法分析基本化學(xué)組成，HPGPC法分析其重均相對(duì)分子質(zhì)量，HPAEC法分析單糖組成，并建立HPAEC指紋圖譜，進(jìn)一步與川貝枇杷糖漿、杏蘇止咳糖漿、小兒熱速清糖漿和小兒肺熱咳喘口服液進(jìn)行比較，對(duì)單糖組成和HPAEC指紋圖譜的特征性進(jìn)行驗(yàn)證，為急支糖漿多糖成分的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑的多糖類(lèi)成分的分析提供借鑒。

1 儀器與材料

Waters Acquity Arc型液相色譜系統(tǒng)，配W2414示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；ICS-5000＋型高效陰離子交換色譜儀，配脈沖安培檢測(cè)器，美國(guó)Thermo Fisher公司；Centrifuge 5417R型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；BS-124S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PWN85ZH型電子分析天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；SB-5200DTD型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技有限公司；UV1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。

對(duì)照品-鼠李糖（批號(hào)32800，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、-阿拉伯糖（批號(hào)L1409050，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、-半乳糖（批號(hào)C518024，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、-葡萄糖（批號(hào)H1631033，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、-甘露糖（批號(hào)A1523056，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）、α-乳糖（批號(hào)L102285，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、-果糖（批號(hào)F108332，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)照品-木糖（批號(hào)DHUNI-QQ，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購(gòu)自上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；對(duì)照品-半乳糖醛酸（批號(hào)P1201886，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）購(gòu)自阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；對(duì)照品-葡萄糖醛酸（批號(hào)10194134，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；對(duì)照品-巖藻糖（批號(hào)X16N8Y48166，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、鹽酸氨基葡萄糖（批號(hào)MFCD00135831，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%），SP132594-3500再生纖維素透析袋均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Waters葡聚糖系列對(duì)照品，相對(duì)分子質(zhì)量分別為1030（批號(hào)dxt010218wa）、4410（批號(hào)dxt020218wa）、8500（批號(hào)dxt030218wa）、15 400（批號(hào)dxt040218wa）、30 000（批號(hào)dxt050218wa）、50 400（批號(hào)dxt060218wa）、87 000（批號(hào)dxt070218wa）、225 000（批號(hào)dxt100218wa），由上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心提供；三氟乙酸、乙酸鈉、醋酸銨、甲酸、氫氧化鈉、硝酸鈉，HPLC級(jí)，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈（LC-MS級(jí)）德國(guó)Merck公司；Braford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超純水使用Millipore Milli-Q超濾系統(tǒng)制備；鹽酸、甲醇、三氯甲烷、氯化鈉、四硼酸鈉、硫酸、丙酮、乙醚、乙醇、正丁醇、間羥基聯(lián)苯、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）等試劑均為分析純，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

15批急支糖漿，批號(hào)分別為19040073、19040074、19040075、19040077、19040079、19040081、19040086、19040088、19040089、19040090、19040097、19040098、19040101、19040114、19040116，分別編號(hào)S1～S15，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司；川貝枇杷糖漿購(gòu)自昭通市驊成制藥有限公司，批號(hào)為201120，編號(hào)S16；小兒熱速清糖漿購(gòu)自河南金鴻堂制藥有限公司，批號(hào)為20201103，編號(hào)S17；杏蘇止咳糖漿購(gòu)自湖北諾得勝制藥有限公司，批號(hào)為210303，編號(hào)S18；小兒肺熱咳喘口服液購(gòu)自黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為202101104，編號(hào)S19。

2 方法與結(jié)果

2.1 急支糖漿多糖的制備

將100 mL裝急支糖漿振搖混勻，精密量取急支糖漿10 mL，緩慢加入5倍量無(wú)水乙醇，4 ℃靜置12 h，1500 r/min離心5 min，濾過(guò)得沉淀。將沉淀于60 ℃水浴蒸干，于20 mL水復(fù)溶，加入5 mL Sevage試劑［三氯甲烷-正丁醇（4∶1）］，劇烈震蕩混勻，3000 r/min離心10 min，濾過(guò)得上清液。將上清液于60 ℃水浴蒸干，減壓干燥后得粗多糖。將粗多糖復(fù)溶于20 mL超純水，加入0.232 g氯化鈉，震蕩混勻，再加入5 mL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的CTAB水溶液，4 ℃靜置12 h，3000 r/min離心10 min，濾過(guò)得上清液。向上清液緩慢加入5倍量無(wú)水乙醇，4 ℃靜置12 h，1500 r/min離心5 min，濾過(guò)得沉淀，加20 mL超純水復(fù)溶，置于相對(duì)分子質(zhì)量3500的再生纖維素膜中，流水透析48 h，凍干，即得急支糖漿多糖，計(jì)算其得率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 15批急支糖漿多糖的制備得率及中性多糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量

Table 1 Yield and proportion of neutral polysaccharide, uronic acid and protein of 15 batches Jizhi Syrup polysaccharides

編號(hào)批號(hào)制備得率/%中性多糖/%糖醛酸/%蛋白質(zhì)/%總和/%編號(hào)批號(hào)制備得率/%中性多糖/%糖醛酸/%蛋白質(zhì)/%總和/% S1190400730.7872.1120.565.7798.44S9190400890.8444.1037.5311.3592.98 S2190400740.7549.5833.608.6191.79S10190400900.6543.0836.7212.7092.50 S3190400750.5842.3229.9610.3482.62S11190400970.7547.3834.4111.5593.34 S4190400770.6741.2437.9513.6392.82S12190400980.8845.2337.857.5590.63 S5190400790.6238.1333.6111.1982.93S13190401010.6650.6935.668.3994.74 S6190400810.5943.3632.756.7682.87S14190401140.6850.9929.346.0186.34 S7190400860.6745.4335.228.8689.51S15190401160.6752.5634.556.3193.42 S8190400880.6747.7530.9810.4289.15 平均值0.7047.6033.389.3090.27

2.2 急支糖漿多糖的基本化學(xué)組成測(cè)定

2.2.1 中性多糖 采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定急支糖漿多糖的中性多糖含量。精密稱取-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用蒸餾水定容于50 mL量瓶，得質(zhì)量濃度100.0 μg/mL的葡萄糖母液。分別精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的-葡萄糖母液于20 mL具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，配成系列質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的-葡萄糖對(duì)照溶液；按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[11]，依次加入5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，待反應(yīng)完成后，使用紫外分光光度儀于490 nm下檢測(cè)吸光度（）值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以值為縱坐標(biāo)（），得-葡萄糖的線性回歸方程為＝0.035 3＋0.014 7，r＝0.998 1，線性范圍為2.86～14.29 μg/mg。

2.2.2 糖醛酸 采用間羥基聯(lián)苯法[12]測(cè)定急支糖漿多糖的糖醛酸含量。精密稱取-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用蒸餾水定容于10 mL量瓶，得質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的-半乳糖醛酸母液，精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL-半乳糖醛酸母液于10 mL量瓶中，加蒸餾水定容，配成系列質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的-半乳糖醛酸對(duì)照溶液。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[12]，依次吸取-半乳糖醛酸對(duì)照溶液0.5 mL、四硼酸鈉硫酸溶液3 mL和間羥基聯(lián)苯溶液50 μL于20 mL具塞試管，待反應(yīng)完成后，使用紫外分光光度儀于520 nm下檢測(cè)值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以值為縱坐標(biāo)（），得-半乳糖醛酸的線性回歸方程為＝0.030 8＋0.016 1，r＝0.998 6，線性范圍為2.82～14.08 μg/mg。

2.2.3 蛋白質(zhì) 依照Bardford法[13]原理采用試劑盒測(cè)定急支糖漿多糖的蛋白質(zhì)含量。以5.0 mg/mL BSA蛋白溶液為母液，加水依次稀釋成1000、750、500、250、125、62.5 μg/mL的BSA蛋白對(duì)照品溶液。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13]，依次吸取50 μL BSA蛋白對(duì)照品溶液、50 μL水和2.5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液于20 mL具塞試管，待反應(yīng)完成后，使用紫外分光光度儀于595 nm下檢測(cè)值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），得BSA蛋白的線性回歸方程為＝0.014 4－0.002 6，＝0.998 5，線性范圍為1.20～19.23 μg/mg。

2.2.4 樣品測(cè)定 同時(shí)檢測(cè)15批急支糖漿多糖樣品的值，平行測(cè)定2次。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分別對(duì)15批急支糖漿多糖的中性多糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行含量計(jì)算。結(jié)果（表1）顯示，15批急支糖漿多糖的中性多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.60%、糖醛酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.38%，蛋白質(zhì)的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.30%。上述中性多糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為90.27%，可以確認(rèn)15批急支糖漿多糖的基本化學(xué)組成中已知成分含量較高。

2.3 急支糖漿多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用HPGPC法[10,14]測(cè)定急支糖漿多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量及分散系數(shù)（重均相對(duì)分子質(zhì)量/數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量）。

2.3.1 HPGPC色譜條件 使用Acquity Arc液相色譜系統(tǒng)；Waters Ultrahydrogel Linear色譜柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3；體積流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；洗脫時(shí)間50 min。以Waters葡聚糖系列對(duì)照品（相對(duì)分子質(zhì)量1030～225 000）作對(duì)照，計(jì)算所測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量信息。

2.3.2 供試品溶液的制備 精確稱取3.00 mg急支糖漿多糖樣品，加超純水配制成質(zhì)量濃度為3.00～3.50 mg/mL的急支糖漿多糖供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，平行測(cè)定15批急支糖漿多糖供試品溶液。

2.3.3 15批急支糖漿多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量 15批急支糖漿多糖的HPGPC圖譜如圖1所示，色譜峰A的保留時(shí)間在24.0～34.0 min，色譜峰B的保留時(shí)間在34.0～35.0 min，色譜峰C的保留時(shí)間在35.0～38.0 min，參照對(duì)照品數(shù)據(jù)依次計(jì)算重均相對(duì)分子質(zhì)量和分散系數(shù)，結(jié)果如表2。色譜峰A、B、C的重均相對(duì)分子質(zhì)量均值分別為19 675、1453、443，說(shuō)明保留時(shí)間越小，則重均相對(duì)分子質(zhì)量越大，其中色譜峰B、C的重均相對(duì)分子質(zhì)量為寡糖量級(jí)，色譜峰A的重均相對(duì)分子質(zhì)量在多糖量級(jí)，是急支糖漿多糖的主要色譜峰（簡(jiǎn)稱主峰）。基于主峰重均相對(duì)分子質(zhì)量均值為19 675（RSD為28.43%），占比均值在82.72%，以六碳糖相對(duì)分子質(zhì)量180計(jì)算，急支糖漿多糖糖鏈的含糖個(gè)數(shù)在120個(gè)以上；主峰分散系數(shù)均值為2.39，相對(duì)分子質(zhì)量跨度大，說(shuō)明急支糖漿多糖為非均一多糖。使用SPSS 25.0軟件對(duì)15批急支糖漿多糖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果（表2）顯示，與對(duì)照?qǐng)D譜相比，S2、S4、S7～S15的相似度大于0.90，S1的相似度為0.88，S3、S5的相似度在0.78～0.80，表明不同批次間的相似度差異可能是原藥材的來(lái)源不同造成的。

圖1 15批急支糖漿多糖的HPGPC圖譜

2.4 急支糖漿多糖的單糖組成分析

采用HPAEC法[9]，測(cè)定急支糖漿多糖酸水解后的單糖組成。

2.4.1 HPAEC色譜條件 使用ICS-5000＋高效陰離子交換色譜儀，Thermo CarboPac PA100色譜柱（250 mm×9 mm，）；淋洗液：50 mmol/L氫氧化鈉溶液（A）-1 mol/L乙酸鈉溶液（B）-200 mmol/L氫氧化鈉溶液（C）-水（D），淋洗梯度洗脫條件：0～10 min，10% A，90% D；10～10.1 min，0～8% C，90%～92% D；10.1～15 min，8%～10% C，92%～90% D；15～35 min，10%～32% C，90%～68% D；35～37 min，32%～100% C；37～40 min，100% C；40～60 min，15% B，40% C，45% D；60～65 min，100% C。檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。脈沖安培檢測(cè)器采用糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形。

表2 15批急支糖漿多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量、主峰分散系數(shù)、峰面積占比及相似度

Table 2 Results of weight-average molecular weights, main peak polydispersity index, peak area ratio and similarities of 15 batches of Jizhi Syrup polysaccharides

編號(hào)重均相對(duì)分子質(zhì)量主峰分散系數(shù)主峰峰面積占比/%相似度編號(hào)重均相對(duì)分子質(zhì)量主峰分散系數(shù)主峰峰面積占比/%相似度 A峰B峰C峰A峰B峰C峰 S112 08815044531.8974.570.875 6S1024 91514574572.5590.310.964 1 S212 78915094511.9376.320.903 3S1126 24714664462.6585.220.957 0 S313 15614184482.4981.200.783 8S1223 05315104452.4579.670.983 3 S415 53214964532.1280.300.963 5S1320 50314774442.5181.760.996 3 S511 75713464192.2180.260.792 3S1425 34315094432.4683.670.954 2 S615 73912674172.3690.500.941 8S1526 36714834462.6382.780.956 3 S719 89113524442.5291.860.988 3平均值19 67514534432.3982.72? S824 19415104402.5480.460.985 5RSD/%28.45.12.510.06.0? S923 55214924442.4781.870.982 2

2.4.2 急支糖漿多糖的單糖供試品溶液制備 精確稱取急支糖漿多糖3 mg，置于20 mL具塞試管中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，置于100 ℃烘箱中水解6 h，50 ℃氮?dú)獯蹈伤庖骸堅(jiān)由倭考状紡?fù)溶，吹干，重復(fù)3次。將急支糖漿多糖的酸水解殘?jiān)鼜?fù)溶于2 mL超純水得急支糖漿多糖酸水解溶液，精密吸取0.5 mL急支糖漿多糖酸水解溶液，加10%乙醇定容于5 mL量瓶中，震蕩搖勻，10 000 r/min離心10 min，取上清液，即得急支糖漿多糖的單糖供試品溶液。

2.4.3 單糖混合對(duì)照品溶液 精密稱取2.00 mg單糖，加水配制成質(zhì)量濃度分別為1.066、1.048、1.030、1.112、1.050、0.992、2.598、1.136、1.054 mg/mL的-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸、-巖藻糖對(duì)照品溶液，精密吸取-鼠李糖、-甘露糖對(duì)照品溶液80 μL，-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-半乳糖醛酸對(duì)照品溶液400 μL，-木糖、-葡萄糖醛酸、-巖藻糖對(duì)照品溶液40 μL于10 mL量瓶中，加水定容至刻度線，即得單糖混合對(duì)照品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系、定量限、檢測(cè)限考察 取“2.4.3”項(xiàng)下單糖混合對(duì)照品溶液適量，加10%乙醇分別稀釋2、5、10、20、50倍，配制成系列質(zhì)量濃度的單糖混合對(duì)照品溶液。將系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。以峰高信號(hào)在基線噪音高的10倍確定定量限，以峰高信號(hào)在基線噪音高的3倍確定檢測(cè)限。-巖藻糖的回歸方程為＝1.201＋0.178，2＝0.998，線性范圍為0.08～4.22 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.022、0.011 μg/mL；-鼠李糖的回歸方程為＝0.465＋0.104，2＝0.999，線性范圍為0.17～8.53 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.011、0.005 μg/mL；-阿拉伯糖的回歸方程為＝1.041＋2.281，2＝0.997，線性范圍為0.84～41.92 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.052、0.026 μg/mL；-半乳糖的回歸方程為＝1.101＋3.020，2＝0.995，線性范圍為0.82～41.20 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.103、0.052 μg/mL；-葡萄糖的回歸方程為＝1.455＋3.075，2＝0.997，線性范圍為0.89～44.48 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.111、0.056 μg/mL；-甘露糖的回歸方程為＝0.737＋0.195，2＝0.998，線性范圍為0.17～8.40 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.084、0.021 μg/mL；-木糖的回歸方程為＝1.902－0.019，2＝1.000，線性范圍為0.08～3.97 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.020、0.010 μg/mL；-半乳糖醛酸的回歸方程為＝0.117＋0.774，2＝0.997，線性范圍為2.02～103.92 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.260、0.130 μg/mL；-葡萄糖醛酸的回歸方程為＝0.134＋0.013，2＝1.000，線性范圍為0.09～4.54 μg/mL，定量限和檢測(cè)限分別為0.091、0.023 μg/mL。結(jié)果表明，9種單糖在各自檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取急支糖漿多糖樣品（批號(hào)190400790），按“2.4.2”項(xiàng)下樣品處理方法制備急支糖漿多糖供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸峰面積的RSD分別為1.2%、1.5%、2.3%、2.4%、2.2%、1.8%、3.1%、1.0%、1.8%，表明該儀器的精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取急支糖漿多糖樣品（批號(hào)190400790），平行制備6份急支糖漿多糖的單糖供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸峰面積的RSD分別為1.3%、2.2%、1.8%、1.6%、1.6%、2.5%、1.6%、1.8%、2.3%，表明樣品制備工藝穩(wěn)定，試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取急支糖漿多糖的單糖供試品溶液（批號(hào)190400790），分別于室溫放置下0、3、6、9、12、18、24 h時(shí)按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸峰面積的RSD分別為4.5%、4.8%、3.1%、3.1%、2.1%、2.9%、2.3%、4.3%、3.7%，表明單糖供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 基于實(shí)測(cè)1 mg急支糖漿多糖（批號(hào)19040088）酸水解產(chǎn)物中含-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸、-巖藻糖單糖的質(zhì)量為22.38、125.21、103.90、123.58、16.05、7.08、247.97、10.56、2.40 μg。向3 mg急支糖漿多糖中加入約等量的9種單糖，參照“2.4.2”項(xiàng)下平行制備6份急支糖漿多糖的單糖供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸的平均回收率分別為101.5%、99.5%、99.4%、100.3%、98.5%、100.7%、99.0%、99.9%、99.1%，RSD分別為1.5%、3.0%、0.6%、1.4%、0.9%、4.0%、4.7%、4.0%、4.0%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.9 急支糖漿多糖的單糖組成的HPAEC指紋圖譜的建立及相似度分析 平行制備15批次急支糖漿多糖及其單糖供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件下對(duì)急支糖漿多糖的單糖供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得其單糖組成的HPAEC圖譜，結(jié)果如圖2所示。使用SPSS 25.0對(duì)多批次相似度分析（表3），結(jié)果顯示，與對(duì)照?qǐng)D譜比較15批單糖組成相似度在0.943 0～0.977 9，一致性良好。采用對(duì)照品對(duì)色譜圖中14個(gè)色譜峰中的12個(gè)峰進(jìn)行指認(rèn)，見(jiàn)圖3-A。結(jié)果表明，在該條件下，可檢測(cè)到急支糖漿多糖中的9種單糖成分-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-果糖、2種糖醛酸成分-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸及1種二糖成分α-乳糖?；诤康突蚍蛛x度低等原因，本研究?jī)H對(duì)除鹽酸氨基葡萄糖、-果糖、α-乳糖外的7個(gè)單糖及2個(gè)糖醛酸成分定量。單糖混合對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖3-B。

圖2 15批急支糖漿多糖的單糖組成的HPAEC圖譜

表3 HPAEC下15批急支糖漿多糖中各單糖含量及組成物質(zhì)的量比(n = 2)

Table 3 Contents and molar ratio of monosaccharides in 15 batches of Jizhi Syrup polysaccharides monosaccharides by HPAEC (n = 2)

編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(μg?mg?1)相似度 L-巖藻糖L-鼠李糖D-阿拉伯糖D-半乳糖D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖D-半乳糖醛酸D-葡萄糖醛酸總量 S11.6321.78114.73100.71107.0817.436.02207.1918.81595.370.977 9 S21.6922.26110.1798.24102.8016.486.44217.769.02584.870.967 0 S31.9626.61111.32114.26120.4318.796.57245.9711.38657.280.965 6 S42.0825.54116.87110.0388.8811.824.99236.748.58605.520.961 8 S52.4326.72117.36106.64120.1318.535.96278.3811.59687.740.961 4 S62.0521.5389.8771.26118.8412.394.73254.1110.11584.890.963 3 S71.6218.1182.3678.86112.9212.414.64237.8811.79560.590.960 5 S82.4022.38125.21103.90123.5816.057.08247.9710.56659.130.954 4 S92.1019.69133.14109.93135.7913.047.46217.908.39647.440.961 1 S101.8819.14136.64109.29132.0714.027.65201.058.90630.660.950 0 S112.0215.47129.73102.57128.2713.275.17168.416.32571.240.943 3 S121.5214.41114.1792.06107.099.045.47159.567.81511.120.943 0 S132.1618.02121.57104.73113.7710.127.03226.867.33611.580.946 3 S141.8114.83111.9791.63121.6310.265.14169.926.34533.540.945 2 S151.8015.41117.9894.67128.4610.706.13158.697.19541.010.944 5 平均值1.9420.13115.5499.25117.4513.626.03215.239.61598.80? 物質(zhì)的量/(mmol?g?1)0.0120.1120.7700.5510.6520.0760.0401.1090.0503.369? 物質(zhì)的量比1.514.4100.071.684.79.85.2144.16.4??

1-L-巖藻糖 2-L-鼠李糖 3-D-阿拉伯糖 4-鹽酸氨基葡萄糖 5-D-半乳糖 6-D-葡萄糖 7-D-甘露糖 8-D-木糖 9-D-果糖 10-α-乳糖 12-D-半乳糖醛酸 14-D-葡萄糖醛酸

2.4.10 15批急支糖漿多糖的單糖組成的定量分析 15批急支糖漿多糖的單糖供試樣品中-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.94、20.13、115.54、99.25、117.45、13.62、6.03、215.23、9.61 μg/mg，以-阿拉伯糖的物質(zhì)的量為100.0，急支糖漿多糖的單糖組成物質(zhì)的量比-巖藻糖、-鼠李糖、-阿拉伯糖、-半乳糖、-葡萄糖、-甘露糖、-木糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸為1.5∶14.4∶100.0∶71.6∶84.7∶9.8∶5.2∶144.1∶6.4。急支糖漿多糖的單糖總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為598.80 μg/mg，占急支糖漿多糖總質(zhì)量的59.90%，在基本化學(xué)組成測(cè)定中，中性多糖和糖醛酸之和占80.98%，單糖回收率在74.00%，15批次單糖組成測(cè)定的具體結(jié)果見(jiàn)表3。

單糖回收率＝可測(cè)得單糖類(lèi)成分總質(zhì)量/多糖質(zhì)量

2.4.11 急支糖漿多糖與其他4種中藥復(fù)方制劑多糖的單糖組成比較 為驗(yàn)證本方法測(cè)定的急支糖漿多糖的HPAEC指紋圖譜的特異性，引入2個(gè)與急支糖漿相似配伍的中藥復(fù)方制劑和2個(gè)與急支糖漿配伍相異的中藥復(fù)方制劑（表4），同樣測(cè)得各中藥復(fù)方制劑多糖的單糖組成HPAEC圖如圖4所示。川貝枇杷糖漿、杏蘇止咳糖漿、小兒熱速清糖漿、小兒肺熱咳喘口服液多糖均含有9種單糖/糖醛酸，但單糖組成比例有差異（表5）。使用SPSS 25.0，將這4種中藥復(fù)方制劑多糖的HPAEC指紋圖譜與急支糖漿多糖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果為0.904 6～0.957 7，其中杏蘇止咳糖漿（相似配伍）、川貝枇杷糖漿（相異配伍）與急支糖漿多糖的單糖組成相似度分別為0.944 9和0.957 7，整體相似度較高，這源于組成多糖的單糖類(lèi)型是有限的。

表4 急支糖漿與其他4種中藥復(fù)方制劑的藥材組成

Table 4 Herbs of Jizhi Syrup and other four Chinese patent medicine preparations

中藥復(fù)方制劑配伍處方藥材 急支糖漿?四季青、魚(yú)腥草、金蕎麥、紫菀、枳殼、前胡、麻黃、甘草 川貝枇杷糖漿相異川貝母流浸膏、桔梗、枇杷葉、薄荷腦 小兒熱速清糖漿相異柴胡、黃芩、板藍(lán)根、葛根、金銀花、水牛角、連翹、大黃 小兒肺熱咳喘口服液相似麻黃、苦杏仁、石膏、甘草、金銀花、連翹、知母、黃芩、板藍(lán)根、麥冬、魚(yú)腥草 杏蘇止咳糖漿相似紫蘇葉、前胡、苦杏仁、陳皮、桔梗、甘草

1-L-巖藻糖 2-L-鼠李糖 3-D-阿拉伯糖 4-D-半乳糖 5-D-葡萄糖 6-D-甘露糖 7-D-木糖 8-D-半乳糖醛酸 9-D-葡萄糖醛酸

為進(jìn)一步考察主要成分對(duì)15批急支糖漿多糖樣品與其他4種中藥復(fù)方制劑多糖（S16～S19）的差異性，將9個(gè)單糖的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），得分見(jiàn)圖5-A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15批次急支糖漿多糖樣品被明顯歸為1組，其他4中復(fù)方制劑多糖呈明顯離散狀態(tài)。主成分荷載散點(diǎn)圖（圖5-B）顯示，以橫縱坐標(biāo)絕對(duì)值大于0.3為標(biāo)準(zhǔn)，-巖藻糖、-半乳糖和-鼠李糖是區(qū)分急支糖漿多糖與其他4批中藥復(fù)方制劑多糖的主要貢獻(xiàn)成分。將9個(gè)單糖的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA），得分圖見(jiàn)圖5-C。通過(guò)提取OPLS-DA模型中9個(gè)變量的重要值（variable importance plot，VIP），以VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了4個(gè)成分，結(jié)果見(jiàn)圖5-D，按VIP值大小排序分別為-巖藻糖、-葡萄糖、-半乳糖和-鼠李糖。通過(guò)以上分析發(fā)現(xiàn)，-巖藻糖、-葡萄糖、-半乳糖和-鼠李糖的含量可用于急支糖漿多糖的質(zhì)量控制分析。

表5 5種中藥復(fù)方制劑多糖的單糖組成物質(zhì)的量比

Table 5 Comparison of molar ratio of monosaccharide compositions of five kinds of Chinese patent medicine preparations’ polysaccharides

中藥復(fù)方制劑物質(zhì)的量比相似度 L-巖藻糖L-鼠李糖D-阿拉伯糖D-半乳糖D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖D-半乳糖醛酸D-葡萄糖醛酸 急支糖漿1.5414.36100.0071.5884.719.835.22144.056.431.000 0 川貝枇杷糖漿1.3281.45100.0054.3032.5515.0814.34192.2718.770.957 7 小兒肺熱咳喘口服液2.2438.11100.00?244.348.504.59?7.880.944 9 杏蘇止咳糖漿1.2924.31100.0071.5974.3312.167.64212.6013.690.904 6 小兒熱速清糖漿0.5519.69100.001.7555.183.841.35?4.720.906 7

A-PCA得分圖 B-PCA荷載散點(diǎn)圖 C-OPLS-DA得分圖 D-VIP值圖

綜上所述，本研究認(rèn)為結(jié)合單糖組成物質(zhì)的量比的HPAEC指紋圖譜可以作為多糖的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

4 討論

4.1 急支糖漿多糖的制備工藝

參考文獻(xiàn)方法[15]并針對(duì)急支糖漿組成藥味的特點(diǎn)，對(duì)其多糖制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在實(shí)驗(yàn)探索過(guò)程中，對(duì)初步制得的急支糖漿粗多糖進(jìn)行觀察與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急支糖漿粗多糖的顏色較深，其中性多糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)測(cè)得的15批平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.25%、31.07%、10.24%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為68.32%，相對(duì)較低。因此，本研究考察AB-8大孔樹(shù)脂柱法[16]、有機(jī)試劑（乙醇、丙酮、乙醚）洗滌沉淀法[15]、活性炭吸附法和CTAB法[17]等除雜方法。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，CTAB法可有效除去急支糖漿粗多糖的雜質(zhì)，且對(duì)粗多糖的損耗較低，可提高急支糖漿多糖的總糖含量，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80.98%。因此，最終在制備工藝中增加除雜步驟，以完善急支糖漿的多糖制備方法。

4.2 中藥多糖相對(duì)分子質(zhì)量與單糖組成可能存在相關(guān)性

本研究測(cè)得15批急支糖漿多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量是19 675；同時(shí)在測(cè)定4種中藥復(fù)方制劑多糖的單糖組成的基礎(chǔ)上，以HPGPC法測(cè)定了多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，川貝枇杷糖漿、杏蘇止咳糖漿、小兒肺熱咳喘口服液、小兒熱速清糖漿多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為38 538、20 182、2431、1898。可以發(fā)現(xiàn)，與急支糖漿多糖的單糖組成相似度較高的川貝枇杷糖漿、杏蘇止咳糖漿在多糖重均相對(duì)分子質(zhì)量上更為接近；而與急支糖漿多糖的單糖組成相似度較低的小兒肺熱咳喘口服液、小兒熱速清糖漿在多糖的重均相對(duì)分子質(zhì)量上差異較大。由此可以推測(cè)，對(duì)于成分復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑多糖，相對(duì)分子質(zhì)量的量級(jí)與單糖組成存在一定相關(guān)性。

綜上所述，本研究針對(duì)急支糖漿多糖的制備方法，尤其是對(duì)多糖的化學(xué)組成、重均相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成指紋圖譜進(jìn)行了分析，并驗(yàn)證了HPAEC單糖組成譜的特征性，表明建立的中成藥多糖的單糖組成分析方法可用于質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中藥復(fù)方制劑的糖類(lèi)成分的分析以及質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Composition analysis and quality evaluation of polysaccharides from Jizhi Syrup

LIU Feng, DING Hao-ran, WANG Meng-yue, LI Xiao-bo

Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

To study the chemical composition, weight-average molecular weight and monosaccharide composition of Jizhi Syrup (急支糖漿) polysaccharides, and compare the polysaccharides components of different batches, so as to provide a basis for its quality control.Colorimetric method, high performance gel permeation chromatography (HPGPC) and high performance anion exchange chromatography (HPAEC) were used to determine the chemical composition, the weight-average molecular weight and polydispersity index, and the monosaccharide composition of polysaccharides in Jizhi Syrup, respectively.The average contents of neutral polysaccharide, uronic acid and protein in 15 batches of Jizhi Syrup polysaccharides were 47.60%, 33.38%, 9.30%, respectively. The weight-average molecular weight and polydispersity index of 15 batches polysaccharides from Jizhi Syrup ranged from 11 757—26 367 and 1.89—2.65, respectively. The results of monosaccharide composition showed that fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, mannose, xylose, galacturonic acid and glucuronic acid were all contained in 15 batches polysaccharides from Jizhi Syrup, and average mass concentrations of them were 1.94, 20.13, 115.54, 99.25, 117.45, 13.62, 6.03, 215.23, 9.61 μg/mg, and the molar ratio of them was 1.5∶14.4∶100.0∶71.6∶84.7∶9.8∶5.2∶144.1∶6.4. Comparing Jizhi Syrup with Chuanbeipipa Syrup (川貝枇杷糖漿), Xingsu Zhike Syrup (杏蘇止咳糖漿), Xiaoer Feire Kechuan Oral Liquid (小兒肺熱咳喘口服液) and Xiaoer Resuqing Syrup (小兒熱速清糖漿), it was found that the HPAEC fingerprint combined with the molar ratio of monosaccharide composition could be used for the quality control of polysaccharides from Jizhi Syrup.The chemical composition, weight-average molecular weight and monosaccharide composition of 15 batches polysaccharides have high consistency, and the HPAEC fingerprints are specific, which can be used as the quality control index of the polysaccharides from Jizhi Syrup.

Jizhi Syrup polysaccharides; chemical composition; weight-average molecular weight; monosaccharide composition; quality control; fucose; rhamnose; arabinose; galactose; glucose; mannose; xylose; galacturonic acid; glucuronic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 5991 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.006

2022-04-01

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1707300）

劉 峰，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: liufeng163lf@163.com

李曉波，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (021)34204806 E-mail: xbli@sjtu.edu.cn

#共同第一作者：丁浩然，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: dinghaoran99@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]