基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的黃連炮制前后生物堿變化規(guī)律

龍成燕，楊 煬，黃思行，張 莉，陽(yáng) 勇，郭延壘

基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的黃連炮制前后生物堿變化規(guī)律

龍成燕，楊 煬，黃思行，張 莉，陽(yáng) 勇，郭延壘*

重慶市中藥研究院，重慶 400065

構(gòu)建黃連生物堿類(lèi)成分的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（HR-MS-Database），研究不同炮制方法炮制前后黃連生物堿類(lèi)化學(xué)成分的變化。采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/Q-TOF-MS）技術(shù)手段，借助SCIEX公司LibraryView數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，建立黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)不同黃連炮制品中炮制前后的生物堿類(lèi)成分含量進(jìn)行測(cè)定和差異分析。建立黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，包含黃連生物堿類(lèi)成分31種；對(duì)姜黃連、酒黃連、萸黃連及黃連生品4種樣品測(cè)定結(jié)果顯示，黃連炮制前后生物堿成分差異明顯。黃連經(jīng)姜炙后，藥根堿、表小檗堿、非洲防己堿含量略有上升，黃連堿、小檗堿含量略有下降，巴馬汀含量未見(jiàn)改變；萸黃連中藥根堿、表小檗堿、小檗堿含量下降，黃連堿、巴馬汀及非洲防己堿含量未見(jiàn)變化；而酒黃連中所測(cè)定的6種生物堿含量均顯著提高（＜0.05）。建立了一種黃連炮制前后生物堿類(lèi)成分變化規(guī)律的快速識(shí)別方法，并定量了在黃連炮制前后含量變化顯著的6種生物堿，為黃連炮制品的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

黃連；生物堿；高分辨質(zhì)譜；數(shù)據(jù)庫(kù)；炮制品；藥根堿；表小檗堿；小檗堿；黃連堿；巴馬汀；非洲防己堿

黃連來(lái)源于毛茛科黃連屬多年生植物黃連Franch.、三角葉黃連C. Y. Cheng et Hsiao或云連Wall.的干燥根莖，以上3種分別習(xí)稱(chēng)“味連”“雅連”“云連”[1]。黃連味苦，性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱燥濕、瀉火解毒功效，用于治療濕熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、黃疸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、心悸不寧、血熱吐魈、目赤、牙痛、消渴、癰腫疔瘡；外治濕疹、濕瘡、耳道流膿[2]。藥理研究結(jié)果表明，黃連具有抗炎、抗病毒、抑菌及降血糖等藥用、保健價(jià)值[3-7]。黃連的化學(xué)成分包括生物堿、木脂素、香豆素、黃酮、萜類(lèi)、甾體、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等[5]，種類(lèi)眾多，其功效成分以生物堿類(lèi)為主[8-11]?！吨袊?guó)藥典》2020年版黃連項(xiàng)下以小檗堿、巴馬汀、表小檗堿、黃連堿作為黃連指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制[1]。

生黃連苦寒之性較甚，過(guò)服或久服易傷脾胃，中醫(yī)臨床常使用姜黃連、酒黃連、萸黃連等黃連炮制品。黃連的不同炮制方法也各有側(cè)重，酒黃連善清上焦火熱，用于目赤，口瘡[12]；姜黃連清胃和胃止嘔，用于寒熱互結(jié)、濕熱中阻、痞滿嘔吐[13]；萸黃連舒肝和胃止嘔[14]。有研究曾建立黃連生品、姜炙、醋炙、酒蒸、酒炙、萸炙等不同炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明在酒蒸、酒炙、萸炙與生品黃連飲片中，鹽酸非洲防己堿等6種生物堿成分存在明顯差異[15]。近年來(lái)，對(duì)黃連炮制的相關(guān)文獻(xiàn)盡管較多，但大多圍繞黃連的炮制工藝優(yōu)化及炮制品的質(zhì)量控制進(jìn)行研究[16-19]。而對(duì)于化學(xué)成分復(fù)雜、炮制前后主要藥效物質(zhì)差異明顯的黃連而言，以往的研究仍具有一定的局限性。

課題組結(jié)合前期研究，基于高分辨質(zhì)譜（HR-MS）分析策略，建立黃連生物堿類(lèi)成分的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（HR-MS-Database），探索性的對(duì)黃連不同炮制品的成分變化進(jìn)行分析，拓展了對(duì)黃連不同炮制品成分的認(rèn)識(shí)，期望為黃連炮制品的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的參考。

1 儀器與材料

Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，API4000三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)AB SCIEX公司）；LC-30AD型超高效液相色譜（日本SHIMADZU公司）；Allegra X-12型離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；Elix10型超純水凈化系統(tǒng)（美國(guó)MILLIPOER公司）；XS105DU十萬(wàn)分之一精密電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；UC-2型超聲波清洗器（上海泰坦科技股份有限公司）。

對(duì)照品鹽酸黃連堿（批號(hào)6020-18-4）、小檗堿（批號(hào)2086-83-1）、黃連堿（批號(hào)3486-66-6）、硫酸黃連堿（批號(hào)1198398-71-8）、格蘭地新（批號(hào)38691-95-1）、甲基黃連堿（批號(hào)38763-29-0）、四氫黃連堿（批號(hào)7461-02-1）、8-氧黃連堿（批號(hào)19716-61-1）、異黃連堿（批號(hào)30426-66-5）、北美黃連堿（批號(hào)118-08-1）、去氫紫堇堿（批號(hào)83218-34-2）、降氧化北美黃連次堿（批號(hào)21796-14-5），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；表小檗堿（批號(hào)6873-09-2）、巴馬?。ㄅ?hào)3486-67-7）、非洲防己堿（批號(hào)3621-36-1）、藥根堿（批號(hào)3621-38-3），購(gòu)自南京源植生物科技有限公司。所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%

甲酸（Sigma-Aldrich公司，批號(hào)156068）、乙腈（LC-MS級(jí)，美國(guó)Fisher公司，批號(hào)178508）、甲醇（LC-MS級(jí)，美國(guó)Fisher公司，批號(hào)146503）、水（LC-MS級(jí)，美國(guó)Fisher公司，批號(hào)L-12968）、鹽酸（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）。

黃連生品由重慶市中藥研究院生藥研究所瞿顯友研究員團(tuán)隊(duì)提供，并經(jīng)瞿顯友研究員鑒定為黃連（味連）Franch.的干燥根莖。黃連炮制品姜黃連、酒黃連、萸黃連等黃連飲片由重慶市中藥研究院藥物化學(xué)研究所陽(yáng)勇副研究員團(tuán)隊(duì)提供，按照《中國(guó)藥典》2020年版一部附錄規(guī)定的炮制方法，采用同一批次黃連藥材（味連）加工制備而成。

2 方法

2.1 黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

2.1.1 定性用對(duì)照品溶液的制備 為獲取黃連生物堿類(lèi)成分的高分辨質(zhì)譜圖，精密稱(chēng)取對(duì)照品鹽酸黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿、黃連堿、硫酸黃連堿、格蘭地新、甲基黃連堿、四氫黃連堿、8-氧黃連堿、異黃連堿、北美黃連堿、去氫紫堇堿、降氧化北美黃連次堿各10 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容、搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存，使用時(shí)根據(jù)高分辨質(zhì)譜分析時(shí)所得的化合物分子離子峰的強(qiáng)度稀釋至適當(dāng)工作濃度。

2.1.2 色譜條件 LC-30AD超高效液相色譜采用菲羅門(mén)ACE Super C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為含0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.50 min，10%B；0.50～9.00 min，10%～80% B，9.00～12.00 min，80% B；12.00～12.10 min，80%～10% B；12.10～15.00 min，10% B。體積流量300 μL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。

2.1.3 質(zhì)譜條件 Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI-Positive模式，質(zhì)量采集掃描范圍/50～1000；鞘氣壓力379.225 kPa，輔助氣壓力379.225 kPa，氣簾氣壓力172.375 kPa，霧化氣溫度600 ℃；采用TOF-MS-Product Ion-IDA掃描模式，TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描Product Ion-IDA離子累積時(shí)間分別為200、100 ms，采用多重質(zhì)量虧損和動(dòng)態(tài)背景扣除作為二級(jí)觸發(fā)條件，解簇電壓80 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為（35±15）eV。采用利血平進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)實(shí)時(shí)校正，數(shù)據(jù)采集采用Analyst TF 1.6.1，并采用MasterView2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2 黃連生物堿成分HR-MS Database數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置

2.2.1HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)源數(shù)據(jù)采集與錄入 基于Analyst TF 1.6.1工作站的LibraryView譜庫(kù)編輯程序（SCIEX公司），錄入高分辨質(zhì)譜儀器采集的各對(duì)照品數(shù)據(jù)信息，錄入信息包括化合物CAS號(hào)、中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、LC分析條件、保留時(shí)間、高分辨質(zhì)譜MS譜圖、MS/MS譜圖、離子源、離子化模式、精確相對(duì)分子質(zhì)量。

2.2.2 HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充與擴(kuò)展 為了充實(shí)HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)以擴(kuò)大使用范圍，基于LibraryView譜庫(kù)編輯程序，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，收集整理黃連生物堿類(lèi)化學(xué)成分，并將相關(guān)信息錄入數(shù)據(jù)庫(kù)以擴(kuò)充相關(guān)數(shù)據(jù)，錄入數(shù)據(jù)庫(kù)信息包括化合物CAS號(hào)、中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、理論離子化模式、精確相對(duì)分子質(zhì)量。

2.2.3 HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)主要參數(shù)設(shè)置與應(yīng)用 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置的主要參數(shù)包括：精確質(zhì)量數(shù)、精確分子質(zhì)量誤差值、同位素分布比（F）、MS/MS碎片純凈度（Purity）和綜合打分結(jié)果（Fit）。應(yīng)用HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)，樣品進(jìn)樣后導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)給定參數(shù)誤差值、F和Purity同時(shí)為高可信度時(shí)，給出綜合打分（Fit），打分值越高則結(jié)果可信度越高。同時(shí)，精確相對(duì)分子質(zhì)量誤差值通常作為重要參考，精確分子質(zhì)量誤差值用于判斷測(cè)定結(jié)果與理論精確質(zhì)量數(shù)的差異，＜5×10?6：可信度高；5×10?6～1×10?5：可信度一般，需結(jié)合其他方式確證；＞1×10?5，可信度低。當(dāng)參數(shù)在多個(gè)打分均較高的平行結(jié)果中，則可以根據(jù)候選化合物的MS/MS 裂解規(guī)律來(lái)確定或推斷目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)；對(duì)于同分異構(gòu)體可結(jié)合保留時(shí)間參數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 基于HR-MS Database數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用于黃連炮制前后生物堿類(lèi)差異成分鑒定

2.3.1 定性用供試品溶液的制備 為比較黃連不同炮制品成分差異，將姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片以及黃連生品分別干燥粉碎后過(guò)二號(hào)篩，取各飲片粉末0.2 g，各平行10份。姜黃連、酒黃連、萸黃連以及黃連生品的樣品編號(hào)分別為Jiang_01～10、Jiu_01～10、Yu_01～10、SP_001～010。上述各樣品分別置100 mL的具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇-鹽酸（100∶1），稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，提取2次，再次稱(chēng)定質(zhì)量，甲醇-鹽酸（100∶1）補(bǔ)足減失質(zhì)量，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取上清液作為供試品溶液，待測(cè)。

2.3.2 黃連炮制前后樣品高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 為識(shí)別姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片以及黃連生品之間的化學(xué)成分差異，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件，通過(guò)TOF-MS-Product Ion-IDA掃描，獲取待測(cè)樣品全掃描數(shù)據(jù)。

2.3.3 聚類(lèi)分析識(shí)別黃連炮制前后成分變化 為了識(shí)別黃連不同炮制前后成分的變化，基于高分辨質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)，采用MarkerView（Version1.2.1，SCIEX）進(jìn)行峰提取、峰匹配、峰識(shí)別以及歸一化等預(yù)處理，通過(guò)單位質(zhì)量峰面積的值，采用Simca-P（Version 14.5，Umetrics）進(jìn)行偏最小二乘法（partial least squares method，PLS-DA）多元變量統(tǒng)計(jì)分析。以PLS-DA方法建立姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片以及黃連生品之間的分類(lèi)模型，以2、2和2判斷分類(lèi)模型的精度，以VIP(variable importance for the projection)值確定不同組間差異成分。

2.3.4 基于HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)的黃連生物堿類(lèi)化學(xué)成分鑒定 以PLS-DA識(shí)別黃連炮制前后不同樣品間差異成分為基礎(chǔ)，結(jié)合黃連生物堿HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索、比對(duì)，鑒定出黃連炮制前后生物堿類(lèi)差異成分。

為進(jìn)一步明確黃連炮制前后生物堿變化規(guī)律，以文獻(xiàn)報(bào)道較多的作為黃連質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥理活性評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分為依據(jù)，擬選擇黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀及非洲防己堿等進(jìn)行含量測(cè)定分析。同時(shí)，所選取的黃連堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀也是藥典質(zhì)量控制成分[1,20]。

2.4 黃連炮制前后生物堿類(lèi)成分變化規(guī)律研究

2.4.1 供試品溶液的制備 將姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片以及黃連生品分別干燥粉碎后過(guò)二號(hào)篩，取各飲片粉末0.2 g，置100 mL的具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇-鹽酸（100∶1），稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，提取2 次，再次稱(chēng)定質(zhì)量，甲醇-鹽酸（100∶1）補(bǔ)足失重，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取上清液作為供試品溶液，待測(cè)。

2.4.2 定量用對(duì)照品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)1 mg/mL的黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀及非洲防己堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，用于黃連生物堿類(lèi)成分定量分析方法的建立。

2.4.3 色譜條件 LC-30AD超高效液相色譜采用菲羅門(mén)ACE Super C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流動(dòng)相為2 mmol/L甲酸銨（含0.2%甲酸）（A）-乙腈（B），采用梯度洗脫程序：0～0.50 min，15 %B；0.50～1.50 min，15%～90 % B，1.50～3.60 min，90 % B；3.60～3.70 min，90%～15% B；3.70～6.00 min，15% B。體積流量為300 μL/min；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL。

2.4.4 質(zhì)譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) API4000三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI-Positive-MRM模式，鞘氣壓力379.225 kPa，輔助氣壓力379.225 kPa，氣簾氣壓力172.375 kPa，霧化氣溫度600 ℃，碰撞氣（CAD）壓力為41.370 kPa，解離電壓（CXP）為15 V。分別精密吸取“2.4.1”與“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液，并按“2.4.3”和“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，并記錄譜圖。

2.4.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀及非洲防己堿的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于同一10 mL量瓶中，得混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋至100、50、25、10、5、1、0.5 ng/mL系列質(zhì)量濃度，按“2.4.3”和“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋至10 ng/mL，并按“2.4.3”和“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取姜黃連樣品6份，按“2.4.1”項(xiàng)下樣品溶液制備，并按“2.4.3”和“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定并計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的姜黃連樣品6份，加入混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下樣品溶液制備，并按“2.4.3”和“2.4.4”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)定并計(jì)算平均加樣回收率和RSD。

2.4.9 樣品含量測(cè)定 按上述方法對(duì)黃連生品及姜黃連、酒黃連、萸黃連4種黃連飲片生物堿含量進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)采集采用Analyst TF 1.6.1，并采用SCIEX MultiQuant?進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)：所有檢驗(yàn)水平α＝0.05（雙側(cè)），以＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃連生物堿類(lèi)成分HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)建立

黃連生物堿類(lèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建是基于SCIEX公司Analyst TF 1.6.1工作站的LibraryView譜庫(kù)編輯程序。數(shù)據(jù)庫(kù)錄入數(shù)據(jù)包括2類(lèi)，一類(lèi)為高分辨質(zhì)譜儀器采集的對(duì)照品數(shù)據(jù)，另一類(lèi)為來(lái)源于文獻(xiàn)的收集整理。錄入數(shù)據(jù)庫(kù)的信息包括化合物CAS號(hào)、中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)式、理論離子化模式、精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)于來(lái)源于高分辨質(zhì)譜儀器采集的對(duì)照品數(shù)據(jù)，軟件后臺(tái)還包括LC分析條件、保留時(shí)間、高分辨質(zhì)譜MS譜圖、MS/MS譜圖等信息。建立的黃連生物堿類(lèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)共包含黃連屬生物堿31種（表1）。

3.2 基于聚類(lèi)分析的黃連炮制前后化學(xué)成分變化

通過(guò)TOF-MS-Product Ion-IDA掃描分析，將獲取的1544個(gè)高分辨質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA的多元變量統(tǒng)計(jì)分析?；赑LS-DA方法建立姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片、黃連生品之間的多元分類(lèi)模型，模型評(píng)估參數(shù)[2=0.858、2=0.985、2=0.982]和Score plot圖顯示，4種黃連飲片間化學(xué)成分存在明顯差異（圖1）?；赑LS-DA分析結(jié)果，以VIP值大于1為判斷指標(biāo)，獲取姜黃連、酒黃連、萸黃連飲片與黃連生品之間差異成分。

將差異成分進(jìn)一步采用已建立的黃連生物堿類(lèi)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)藥根堿、鹽酸黃連堿、小檗堿、去氫紫堇堿等多種黃連生物堿為差異性指標(biāo)成分，表明不同炮制方法均對(duì)黃連中的化學(xué)成分存在一定影響，尤其是生物堿類(lèi)成分。

3.3 6種黃連生物堿類(lèi)成分定量測(cè)定方法學(xué)考察

建立6種黃連生物堿類(lèi)成分含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示系統(tǒng)適用性良好。取定量用對(duì)照品溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2，各測(cè)定成分線性關(guān)系良好。黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿6種黃連生物堿6次測(cè)定精密度RSD分別為3.37%、0.90%、4.82%、2.86%、1.50%和1.29%，表明檢測(cè)精密度良好；黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿6種黃連生物堿6次測(cè)定重復(fù)性RSD分別為2.96%、2.08%、0.80%、0.88%、1.39%和4.91%，表明該方法重復(fù)性良好；取已測(cè)定的姜黃連樣品6份測(cè)定黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，6種黃連生物堿平均加樣回收率分別為96.59 %、104.26%、102.50%、94.78%、89.47%和95.82%，RSD分別為1.86%、1.33%、3.57%、1.67%、1.88%和1.60%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 黃連生物堿成分HR-MS-Database數(shù)據(jù)庫(kù)

Table 1 HR-MS-Database of alkaloid constituent in C. chinensis

序號(hào)中文名稱(chēng)英文名稱(chēng)分子式精確相對(duì)分子質(zhì)量CAS號(hào)離子模式m/z HL01紫堇定corydineC20H23NO4341.162 7476-69-7＋H342.170 0 HL02異黃連堿#isocoptisineC21H17NO6379.105 630426-66-5＋H380.112 9 HL03藥根堿#jatrorrhizineC20H20NO4338.139 23621-38-3＋H339.146 5 HL04氧化血根堿oxysanguinarineC20H13NO5347.079 4548-30-1＋H348.086 7 HL05黃連堿#coptisineC19H14NO4320.092 33486-66-6＋H321.099 6 HL06鹽酸黃連堿#coptisine chlorideC19H14ClNO4355.061 16020-18-4＋H356.068 4 HL07硫酸黃連堿#coptisine sulfateC19H15NO8S417.051 81198398-71-8＋H418.059 1 HL08血根堿sanguinarineC20H14NO4＋332.092 32447-54-3＋H332.092 3 HL09小檗亭berberastineC20H18NO5352.118 52435-73-6＋H353.125 8 HL10小檗堿#berberineC20H18NO4336.123 62086-83-1＋H337.130 9 HL11小檗紅堿berberrubineC19H15NO4321.100 115401-69-1＋H322.107 4 HL12小檗胺berberamineC37H40N2O6608.288 6478-61-5＋H609.295 9 HL13唐松草定堿thalifendineC19H15NO4321.100 118207-71-1＋H322.107 4 HL14四氫小檗堿tetrahydroberberineC20H21O4N339.147 1522-97-4＋H340.154 3 HL15四氫黃連堿#tetrahydrocoptisineC19H17NO4323.115 87461-02-1＋H324.123 0 HL16去氫紫堇堿#dehydrocorydalineC21H18NO4348.123 683218-34-2＋H349.130 9 HL17去甲血根堿norsanguinarineC19H11NO4317.068 8522-30-5＋H318.076 1 HL18木蘭花堿magnoflorineC20H24NO4342.170 52141-09-5＋H343.177 8 HL19降氧化北美黃連次堿#noroxyhydrastineineC10H9NO3191.058 221796-14-5＋H192.065 5 HL20甲基小檗堿worenineC21H19NO4349.131 454260-72-9＋H350.138 7 HL21甲基黃連堿#methylcoptisineC20H16NO4＋334.107 938763-29-0＋H334.107 9 HL22格蘭地新#groenlandicineC19H16NO4＋322.107 938691-95-1＋H322.107 9 HL23非洲防己堿#columbamineC20H20NO4338.139 23621-36-1＋H339.146 5 HL24表小檗堿#epiberberineC20H18NO4336.123 66873-09-2＋H337.130 9 HL25北美黃連堿#（-)beta-hydrastineC21H21NO6383.136 9118-08-1＋H384.144 2 HL26巴馬汀#palmatineC21H22NO4＋352.154 93486-67-7＋H352.154 9 HL27thalifaurinethalifaurineC19H15NO4321.100 175491-95-1＋H322.107 4 HL288-氧化小檗堿8-oxoberberineC20H17NO5351.110 7549-21-3＋H352.118 0 HL298-氧化黃連堿#8-oxocoptisineC19H13NO5335.079 419716-61-1＋H336.086 7 HL308-氧化表小檗堿8-oxoepiberberineC20H17NO5351.110 719716-60-0＋H352.118 0 HL316-丙酮基-5,6-二氫血根堿6-acetonyl-5,6-dihydro- sanguinarineC23H19NO5389.126 337687-34-6＋H390.133 6

#表示通過(guò)黃連生物堿類(lèi)對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)

#identified by control substance

圖1 黃連炮制品高分辨質(zhì)譜全掃描數(shù)據(jù)PLS-DA分析后的Score plot圖

表2 黃連生物堿成分MRM定量分析

Table2 MRM quantitative analysis of alkaloid constituents in C. chinensis

樣品名稱(chēng)稱(chēng)樣量/mg離子對(duì)定量范圍/(ng·mL?1)標(biāo)準(zhǔn)曲線r 黃連堿10.29*321.1/303.10.515～102.9Y＝6 985.32 X＋337.120.999 6 小檗堿11.14*337.1/319.10.557～111.4Y＝2 516.11 X＋106.470.999 8 表小檗堿10.37*337.1/281.10.514～103.7Y＝395.28 X＋86.390.999 3 巴馬汀10.02*352.2/308.10.501～100.2Y＝4 432.91 X＋336.150.999 1 非洲防己堿11.34*339.2/323.10.567～113.4Y＝2 001.82 X＋726.330.999 1 藥根堿10.66*339.2/281.10.533～106.6Y＝98 255.34 X＋496.580.999 6

*為定量離子對(duì)

*quantitative ion pair

3.4 不同炮制方法的黃連飲片中6種生物堿含量變化

為進(jìn)一步探討黃連生品經(jīng)不同炮制方法處理后的含量變化，本研究對(duì)黃連生品、姜黃連、酒黃連、萸黃連4種黃連飲片的6種生物堿（黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀、非洲防己堿、藥根堿）含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖2），不同黃連炮制品中的生物堿含量具有一定差異，黃連經(jīng)姜炙后，藥根堿、表小檗堿、非洲防己堿含量略有上升，黃連堿、小檗堿含量略有下降，巴馬汀含量未見(jiàn)改變；萸黃連中藥根堿、表小檗堿、小檗堿含量下降，黃連堿、巴馬汀及非洲防己堿含量未見(jiàn)變化；而酒黃連中所測(cè)定的6種生物堿含量均顯著提高（＜0.05）。

4 討論

黃連因苦寒性較甚，在臨床上一般用其炮制品，但不同的炮制方法對(duì)黃連的關(guān)鍵活性成分造成了一定的影響。有學(xué)者采用高效液相色譜法分析了姜制黃連炮制前后藥性、藥效關(guān)系及有效成分含量，結(jié)果表示炮制前后黃連中生物堿含量及其物質(zhì)群發(fā)生顯著差異，導(dǎo)致姜黃連的藥效和藥性有所改變[21-23]。另外，有研究表明，黃連經(jīng)吳茱萸炮制后，生物堿等苦寒之性的物質(zhì)含量降低，而用黃酒、醋及膽汁炮制黃連后，炮制品的生物堿含量均比生黃連高[24-25]。生物堿作為黃連的主要活性成分，炮制工藝會(huì)影響其含量變化，加上黃連炮制品本身成分復(fù)雜，使得當(dāng)前黃連及其制劑的質(zhì)量控制方法無(wú)法做到全面的控制和反映黃連炮制品的質(zhì)量。高分辨質(zhì)譜技術(shù)因其快速、高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，常作為當(dāng)前天然產(chǎn)物的快速識(shí)別、篩查工具，以此為技術(shù)支撐構(gòu)建具有高專(zhuān)屬性的黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，必將為黃連炮制品質(zhì)量的快速、準(zhǔn)確鑒別提供有效的解決方法[26]。

*P＜0.05

同時(shí)，黃連中除小檗堿、巴馬汀等主要生物堿類(lèi)成分發(fā)揮著關(guān)鍵藥用活性外，其他生物堿類(lèi)成分的藥理作用及其優(yōu)勢(shì)也正逐步得到體現(xiàn)，但黃連中其他生物堿類(lèi)成分的檢測(cè)分析技術(shù)還不夠成熟，應(yīng)用研究工作較少，無(wú)法真正利用和深度開(kāi)發(fā)其新用途和新價(jià)值。本研究通過(guò)建立黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于開(kāi)展黃連生物堿類(lèi)資源性化學(xué)成分的再認(rèn)識(shí)，提高黃連資源產(chǎn)品價(jià)值和利用效益。

此外，本研究在黃連生物堿類(lèi)成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)基礎(chǔ)上對(duì)酒黃連、萸黃連、姜黃連及黃連生品進(jìn)行生物堿差異分析得知，4種黃連制品中生物堿類(lèi)成分差異明顯，推測(cè)除所測(cè)定的藥根堿、表小檗堿、小檗堿、黃連堿、巴馬汀及非洲防己堿6種生物堿有所不同外，其他生物堿類(lèi)成分可能也是導(dǎo)致黃連炮制品差異的原因之一，建議對(duì)黃連中其他生物堿類(lèi)成分進(jìn)行更為深入的研究，以便獲得黃連較全面的指標(biāo)成分。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Changing regularity of alkaloids frombefore and after processing based on HR-MS-Database

LONG Cheng-yan, YANG Yang, HUANG Si-xing, ZHANG Li, YANG Yong, GUO Yan-lei

Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China

To establish high-resolution mass spectrometry database (HR-MS-Database) of alkaloid constituents from, and explore alkaloids variation oftreated by different processing methods.Ultra-performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）was used to create HR-MS-Database of alkaloid constituents fromby means of LibraryView database platform of SCIEX Corporation. And content determination and difference analysis of the alkaloids frombefore and after processing were conducted.The HR-MS-Database of alkaloid constituents fromcontaining 31 species of alkaloids was built. The determination results showed that the composition of alkaloids in four types of(Huanglian) pieces (ginger juice stir-fried pieces, wine stir-fried pieces, evodiae juice stir-fried pieces, crude pieces) was obviously different. The contents of jatrorrhizine, epiberberine and columbamine inpieces slightly increased by ginger juice stir-fried processing, but the contents of coptisine and berberine were slightly decreased, and the content of palmatine remained unchanged; contents of jatrorrhizine, epiberberine and berberine in evodiae juice stir-fried pieces were decreased, yet contents of coptisine, palmatine, columbamine still stayed stable. Moreover, the contents of six alkaloids (jatrorrhizine, epiberberine, berberine, coptisine, palmatine and columbamine) in wine stir-fried pieces obviously improved (< 0.05).The study will provide an effective method for fast identification of alkaloid variation. It was found that the contents of six species of alkaloids fromchanged significantly before and after processing, which provided a reference for their pharmacodynamic material basis and quality control standard of processed.

Franch.; alkaloids; HR-MS; database; processed products; jatrorrhizine; epiberberine; berberine; coptisine; palmatine; columbamine

R284.1

A

0253 - 2670(2022)19 - 5972 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.004

2022-02-21

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng)（2017ZX09101002-002-004）；重慶市科技局激勵(lì)績(jī)效引導(dǎo)專(zhuān)項(xiàng)（jbky20210019）；重慶市科技局自然科學(xué)基金（cstc2021jcyj-msxmX0885）；重慶市重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（cstc2016zdcy-ztzx10005）

龍成燕（1993—），女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail: 1206900012@qq.com

郭延壘，男，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幋鷦?dòng)力學(xué)與代謝組學(xué)。E-mail: guoyanlei1210@cqacmm.com

[責(zé)任編輯 王文倩]