pH區(qū)帶精制逆流色譜法分離制備越南槐中具有抑制α-糖苷酶活性的生物堿

梁森林， 黃永林， 何瑞杰， 王亞鳳， 陽丙媛， 李典鵬， 司紅彬

( 1. 廣西大學 動物科學技術學院， 南寧 530005； 2. 廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室， 廣西壯族自治區(qū)中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

山豆根為豆科植物越南槐()干燥的根和根莖(陳興廣等, 2020)，主要分布于廣西、云南、貴州等地(中華人民共和國藥典，2010)，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，用于治療胃部、牙齦、咽部、肺部等部位的炎癥(Hou et al., 2020)。山豆根藥材中的生物堿具有毒性(田雪松, 2016)，也有抗炎(Ding et al., 2006)、抗病毒(戴五好等, 2012)、抑菌(He et al., 2019)等多種生物活性，其中苦參堿和氧化苦參堿(李豐等, 2020)等喹諾里西啶類生物堿為主要的生物堿成分(陳影等, 2017)。由于山豆根生長環(huán)境較為特殊，家種栽培模式尚處于探索階段，近年來山豆根產量下滑趨勢明顯，而越南槐的地上部分作為山豆根非藥用部位富含生物堿，但尚未得到開發(fā)利用。因此，為了提高藥用植物的利用率，創(chuàng)建快速分離制備山豆根非藥用部位中的生物堿的方法顯得尤為必要。

高速逆流色譜(HSCCC)是近數十年發(fā)展起來的液-液分配色譜(步知思等, 2018)，具有無柱污染、無不可逆吸附、進樣量大，同一根逆流色譜柱既可用于分析，也可用于制備等的優(yōu)點(劉倩, 2016)。pH區(qū)逆流色譜由高速逆流色譜發(fā)展而來，利用待分離物質的酸堿解離常數和疏水性的不同進行分離，目前被廣泛應用于離子型化合物如有機酸(徐敏和修彥鳳, 2016)、生物堿(馬濤等, 2014)等的分離。本研究利用pH區(qū)帶精制逆流色譜法對越南槐地上部分總生物堿進行分離制備，共得到兩個高純度的生物堿化合物：苦參堿和氧化苦參堿(化學結構見圖1)。該方法簡單，高效，分離純度高。

圖 1 苦參堿和氧化苦參堿的化學結構式Fig. 1 Chemical structures of matrine and oxymatrine

隨著生活水平的提高，糖尿病這一代謝性疾病的發(fā)病率逐年升高，對糖尿病的研究也因此成為中內外學者近年來所關注的熱點(宋彤彤等, 2019)。本研究也報道了越南槐地上部分總提取物、總生物堿及分離得到的兩個生物堿的-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 儀器與材料

TBE-300C高速逆流色譜儀(上海同田生物技術股份有限公司)、TBP5002 TAUTO恒流泵(上海同田生物技術股份有限公司)、UV100紫外檢測器(賽譜銳思科技有限公司)、GeneVac miVac真空離心濃縮儀(英國GeneVac公司)、TC-1050恒溫循環(huán)器(上海同田生物技術股份有限公司)、CBM-20A系統控制器(日本島津公司)、DGU-20A5脫氣機(日本島津公司)、LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)、Brucker Avance Ш HD-500 MHz超導核磁共振波譜儀(瑞士，Brucker公司)、SPD-M20A光電二極管陣列檢測器(日本島津公司)、XS205 DualRange(瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團)分析天平、BRUKER HCT電噴霧質譜(美國，布魯克道爾頓公司)和MAT 95XP高分辨質譜 (美國，Thermo)、ADP440+ 旋光計(德國，優(yōu)萊博有限公司)、OSB-2100油浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)、SP-MAX3500FL多功能熒光酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

阿卡波糖、-葡萄糖苷酶、對硝基苯酚--D-吡喃葡萄糖苷均購自上海源葉生物科技有限公司；20×PBS(北京索萊寶科技有限公司)；無水碳酸鈉、乙腈、二氯甲烷、甲醇(西隴化工股份有限公司，分析純)；HPLC分析用水為實驗室自制超純水。

越南槐()的地上部分于2018年11月采自廣西百色市那坡縣，由廣西大學黃榮韶教授鑒定，標本(編號：20181103)保存于廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室。

2 實驗方法

2.1 越南槐的地上部分總生物堿的制備

取越南槐的地上部分干燥的莖葉1 kg，粉碎后用95%乙醇浸泡一周，將濾液濃縮旋干得浸膏，取部分浸膏用HCl調pH至3，離心后將上清液減壓旋干后用適量水溶解過AB-8大孔樹脂柱，順次加入水，20%氨水，70%甲醇-水進行洗脫，收集70%甲醇-水洗脫餾分，旋干即得到總生物堿。

2.2 樣品溶劑系統及樣品溶液的制備

2.2.1 樣品溶劑系統的制備 選取二氯甲烷-甲醇-水(5∶3∶2，)為溶劑系統進行試驗，量取1 000 mL二氯甲烷、600 mL甲醇、400 mL水置于分液漏斗中，劇烈震蕩后靜置半小時，取出下相和上相，在上相中加入HCl (10 mmol·L) 0.344 mL 作為固定相，在下相中加入TEA (10 mmol·L) 0.444 mL作為流動相，超聲脫氣30 min后備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 取1.2 g總生物堿放于試管中，加入7.5 mL含有HCl的上相和7.5 mL未添加TEA的下相，超聲震蕩使其充分溶解，準備用于pH區(qū)帶逆流色譜分離。

2.3 分離及鑒定

2.3.1 pH區(qū)帶逆流色譜分離過程 將超聲脫氣過的上相以20 mL·min的速度泵入高速逆流主機中作為固定相使用，15 min后觀察到出口有液體流出，說明固定相已完全充滿螺旋管。樣品溶液用等量的已加入酸的上相和未加入堿的下相溶解，在load模式中將樣品溶液注入進樣環(huán)，旋轉進樣口旋鈕至inject檔位，將主機旋轉方向調為順時針后，慢慢調節(jié)主機轉速至850 r·min，待轉速穩(wěn)定后，以2 mL·min的速度泵入流動相，同時開啟紫外檢測器及記錄儀，設置紫外檢測波長為210 nm，通過觀察色譜圖的出峰情況手動收集餾分，分離完成后，將主機內液體用壓縮空氣吹出，使用500 mL量筒收集并計算固定相保留率。

2.3.2 HPLC分析 用HPLC分析越南槐地上部分生物堿粗提物和分離后的各組分。液相色譜柱為Eclipse XDB-C(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水(5∶95)，進樣量為20 μL；流速設定為0.8 mL·min；檢測波長為210 nm，柱溫為室溫。

對pH區(qū)帶逆流色譜分離到的結構采用高分辨質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析進行鑒定。

2.3.3 化合物結構鑒定

化合物白色粉末，(+)HR-ESI-MS: 249.196 67 [M+H](計算相對分子質量為249.196 62)，其對應的分子式為CHNO。H NMR (500 MHz，CDCl)δ: 4.38 (1H, dd,= 12.5, 4.1 Hz, H-17e), 3.80 (1H, dt,= 9.5, 6.1 Hz, 11-H), 3.03 (1H, t,= 12.5 Hz, H-17a), 2.80 (2H, d,=11.6 Hz, H-10e, H-2e), 2.41 (1H, dt,= 17.0, 4.1 Hz, H-14e), 2.23 (1H, m, H-14a), 2.07 (2H, m), 1.90 (3H, m), 1.79 (1H, m, H-9a), 1.73～1.34 (11H, m)。C NMR(125 MHz，CDCl)δ: 165.98 (C-15), 63.93 (C-6), 57.43 (C-2), 57.36 (C-10), 43.37 (C-17), 41.60 (C-7), 35.49 (C-5), 32.97 (C-14), 27.90 (C-12), 27.28 (C-4), 26.60 (C-8), 21.32 (C-3), 20.91 (C-9), 19.11 (C-13)。將數據與文獻(董劉宏等，2010)比較，確定其為苦參堿。

化合物無色粉末，(+)HR-ESI-MS: 265.191 61 [M+H](計算相對分子質量265.191 60)，其對應的分子式為CHNO。H NMR (500 MHz，CDCl): 5.07 (1H, dt,= 10.4, 6.1 Hz, H-11), 4.38 (1H, dd,= 12.0, 5.2 Hz, H-17e), 4.15(1H, t,= 12.0, H-17a), 3.07 (5H, m), 2.64 (2H, m), 2.42 (1H, m, H-14e), 2.20(2H, m, H-14a, H-12e), 2.02 (1H, m, H-8e), 1.85～1.50 (9H, m), 1.23 (1H, m, H-12a)。C NMR(125 MHz, CDCl): 170.26 (C-15), 69.67 (C-10), 69.32 (C-2), 67.32 (C-6), 53.10 (C-11), 42.86 (C-7), 41.84 (C-17), 34.71 (C-5), 33.05 (C-14), 28.67 (C-12), 26.29 (C-4), 24.85 (C-8), 18.78 (C-13), 17.37 (C-3), 17.32 (C-9)。將數據與文獻(郭依俐和劉慶，2019)比較，確定其為氧化苦參堿。

2.4 阿卡波糖IC50值的測定

2.4.1 PBS溶液的配制 將20×PBS溶液用蒸餾水稀釋20倍即得。

2.4.2 1 U·mL-葡萄糖苷酶溶液的配制 準確稱取1 mg-葡萄糖苷酶，溶于25.4 mL PBS中，現配現用。

2.4.3 1 mmol·LPNPG溶液的配制 稱取3 mg PNPG加入10 mL PBS溶液中超聲溶解，現配現用。

2.4.4 0.2 mol·LNaCO溶液配制 稱取2.16 g NaCO于燒杯中，加蒸餾水定容至100 mL。

2.4.5 實驗步驟 采用PNPG法進行測定(李古月等，2015)，反應在96孔板中進行，按照順序加入50 μL PBS緩沖液，20 μL不同濃度的阿卡波糖溶液，10 μL-葡萄糖苷酶溶液，置于37 ℃油浴鍋中預熱5 min，然后加入20 μL PNPG溶液，于37 ℃油浴鍋中繼續(xù)加熱25 min后取出，加入50 μL NaCO終止反應。實驗平行3次，于波長405 nm處測定吸光度。通過Statistical Product and Service Solutions軟件計算出其IC值。

將待測樣品代替阿卡波糖按照上述步驟操作，得到待測樣品IC值。實驗平行3次，將測得結果與陽性對照品阿卡波糖的IC值對比。

-葡萄糖苷酶抑制率公式：

抑制率= [1-(-/-)]×100%。

式中：、、、分別代表405 nm下測得的樣品組、背景組、陰性對照組、空白對照組的吸光值。

表 1 α-葡萄糖苷酶反應體系 (單位： μL)Table 1 α-glucosidase reaction system (Unit： μL)

3 結果與分析

3.1 HPLC的條件優(yōu)化

實驗優(yōu)化了液相色譜條件以確保各組分達到基線分離，對流動相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1% TEA水、乙腈-0.1% TEA水、甲醇-0.1% 磷酸水、乙腈-0.1% 磷酸水的分離效果進行了比較，結果顯示，當選用乙腈-0.1% 磷酸水(5∶95)作為流動相，流速為0.8 mL·min時，越南槐地上部分總生物堿中各成分能實現基線分離，分離效果見圖2。

1. 苦參堿; 2. 氧化苦參堿。1. Matrine; 2. Oxymatrine.圖 2 總生物堿的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of total alkaloids

3.2 pH區(qū)帶精制逆流色譜色譜條件的優(yōu)化

在分離生物堿的經典pH區(qū)帶精制逆流色譜正向置換模式下，總生物堿中的各類化合物依據其解離常數及疏水性不同，在保留酸的前方形成一系列的溶質區(qū)帶，達到平衡后，每個溶質區(qū)帶和保留酸以相同的速率移動。以本實驗為例，固定相水相位于管道的上半部分，有機流動相位于下半部分，保留酸形成了一個陡峭的邊界，如圖3所示，在邊界右側，堿性待分離物質從保留酸中獲得質子并進入固定相中(位置④)，當保留酸邊界向前推移時，溶質正離子被置于高pH值范圍內(位置①)，被奪去質子后回到疏水性的非離子形式迅速進入流動相中(位置②)，溶質穿過邊界后重新置于低pH值范圍內(位置③)，獲得質子而回到固定相中(位置④)，這一過程不斷重復直至保留堿流出色譜柱。會出現具有最小重疊的矩形平臺峰(Cai et al.，2020)，物質被高度濃縮在平臺內(Tong et al.，2013)而雜質被有效祛除并集中在平臺兩側(Wang et al.，2012)。本實驗首先使用了二氯甲烷-甲醇-水(5∶3∶2，)(上相加入10 mmol·LHCl,下相加入10 mmol·LTEA)為溶劑系統對總生物堿進行pH區(qū)帶精制逆流色譜分離，其結果如圖4：A所示， 49～98 min餾分經HPLC檢測為化合物，162～178 min餾分為化合物，但化合物中夾雜有化合物，未能實現完全分離。由于待分離物質的解離常數在一定的條件下為常數，其解離程度主要由保留酸決定。調整保留酸的濃度，會導致矩形峰的寬度及出峰時間發(fā)生改變。因此，為了獲得更好的洗脫效果，加20 mmol·LHCl于固定相中，流動相中TEA的濃度不變，用pH區(qū)帶精制逆流色譜分離總生物堿的效果如圖4：B所示，68～113 min出現了化合物，148～200 min出現了化合物，經HPLC分析，其純度分別為98.7%和98.2%。

圖 3 pH區(qū)帶精制逆流色譜分離原理圖Fig. 3 Schematic figure of PZRCCC separation principle

1. 苦參堿; 2. 氧化苦參堿。溶劑系統: 二氯甲烷-甲醇-水 (5∶3∶2, V/V)。A. 上相添加10 mmol·L-1鹽酸，下相添加10 mmol·L-1三乙胺； B. 上相添加20 mmol·L-1鹽酸，下相添加10 mmol·L-1三乙胺。1. Matrine; 2. Oxymatrine. Solvent system: CH2Cl2 -MeOH-H2O (5∶3∶2, V/V). A. 10 mmol·L-1 HCl in upper phase and 10 mmol·L-1 TEA in lower phase; B. 20 mmol·L-1 HCl in upper phase and 10 mmol·L-1 TEA in lower phase.圖 4 越南槐的地上部分生物堿pH區(qū)帶精制逆流色譜Fig. 4 PZRCCC of total alkaloids from the aerial part of Sophora tonkinensis

3.3 樣品對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

以樣品濃度和抑制率作圖，求得各樣品的IC值如表2所示。結果表明，越南槐地上部分總提取物及總生物堿對-葡萄糖苷酶抑制作用微弱，而苦參堿和氧化苦參堿均對-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性，且氧化苦參堿的抑制作用明顯強于苦參堿。

表 2 樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 α-glucosidase inhibitory activity of samples

4 討論與結論

生物堿是天然產物中藥理活性較好和成藥性較高的一類化合物，對這類化合物使用傳統的柱色譜法往往存在拖尾嚴重和收率低的問題，因此生物堿的分離一直是分離科學與技術領域中的一個研究熱點和難點問題。pH區(qū)帶精制逆流色譜法是近年來由高速逆流色譜的基礎上發(fā)展而來一種分離方法，由于其依據物質的解離常數(pKa)和疏水性的不同而實現分離。本實驗以選定的二氯甲烷-甲醇-水為溶劑系統，采用化學手段，根據待分離樣品的酸堿特性，通過增加上層水相中HCl濃度、下層有機相中TEA濃度保持不變，使樣品的色譜分離過程呈現按pH區(qū)帶聚集的特征，組分的洗脫過程變成了類似置換色譜的洗脫過程，其色譜圖為按pH值的大小排列的邊界陡峭的矩形峰，同時雜質被集中在峰的兩側，其結果是分離容量增大、分離效率提高。因此，pH區(qū)帶精制逆流色譜法目前廣泛用于生物堿、有機酸的制備性分離。然而，溶劑系統的選擇是一大難點，一個合適的溶劑系統往往需要經過較長時間的摸索，而且是決定試驗成敗的關鍵因素。本研究利用pH區(qū)帶精制逆流色譜法從山豆根非藥用部位中快速高效地分離制備苦參堿及氧化苦參堿，為其他生物堿的分離制備提供了參考。-葡萄糖苷酶抑制活性實驗結果顯示總提物的最大抑制率數倍于總生物堿的最大抑制率，提示總提取物中可能含抑制活性更強的成分，這些成分有待進一步的挖掘。同時，越南槐的莖葉作為中藥——山豆根的一個副產物, 資源豐富，富含苦參堿和氧化苦參堿等生物堿成分，開發(fā)潛力巨大，能否成為山豆根替代資源仍亟待進一步的研究。