廣西南寧避雨栽培葡萄炭疽病的病原菌鑒定

譚海蕓, 吳林娜, 張 瑋, 周詠梅, 李興紅*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京 100193; 2. 北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所, 北京 100097; 3. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所, 南寧 530007)

‘陽(yáng)光玫瑰’(Shine Muscat)是一個(gè)歐美雜交葡萄品種,對(duì)霜霉病、白粉病具有較好的耐病性,而對(duì)炭疽病則較為感病[1],目前在我國(guó)云南、廣西、浙江等地廣泛種植[2]。

葡萄炭疽病(grape anthracnose)是葡萄栽培過程中的重要病害之一,主要危害著色期或近成熟期的果實(shí)[3],降低葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。美國(guó)學(xué)者Southworth于1891年首次對(duì)葡萄炭疽病進(jìn)行了描述[4],我國(guó)最早于1988年-1991年間對(duì)其發(fā)生和防治進(jìn)行了研究[5]。引起葡萄炭疽病的病原菌為炭疽菌屬Colletotrichum的17個(gè)種,目前在我國(guó)已報(bào)道的有10種,分別為隱秘炭疽菌Colletotrichumaenigma、河北炭疽菌C.hebeiense[6-7]、C.ampelinum[8]、辣椒炭疽菌C.capsici[9]、C.citri、果生炭疽菌C.fructicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioide、睡蓮炭疽菌C.nymphaeae[7]、平頭炭疽菌C.truncatum[10]、C.viniferum[6-7,10-12]。其中C.ampelinum、C.citri、C.hebeiense和C.nymphaeae4個(gè)種僅在我國(guó)有相關(guān)報(bào)道。2013年,Peng等[11]首次報(bào)道C.viniferum引起葡萄炭疽病。目前,C.viniferum在我國(guó)云南、貴州[11]、北京、山東、河北、江蘇、新疆[6]、福建、浙江、四川、江西、河南[12]等12個(gè)省市自治區(qū)有引起葡萄炭疽病的報(bào)道,是葡萄炭疽病的主要病原菌之一,而國(guó)外僅有日本[13]和韓國(guó)[14]兩個(gè)國(guó)家有相關(guān)報(bào)道。

避雨栽培措施的推廣應(yīng)用有效地控制了葡萄炭疽病的發(fā)生,使露地栽培葡萄發(fā)生重的炭疽病基本消失[15]。然而,2020年廣西部分地區(qū)避雨栽培的葡萄出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的炭疽病,引起了種植者的關(guān)注。為明確引起該病害的病原菌,本研究對(duì)廣西地區(qū)避雨栽培條件下發(fā)生炭疽病的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄進(jìn)行調(diào)查和采集病樣,并在室內(nèi)進(jìn)行了病原菌的分離鑒定,旨在為了解和防治廣西地區(qū)葡萄炭疽病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病樣采集

2020年10月,對(duì)廣西南寧明陽(yáng)基地避雨栽培的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄園炭疽病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查,并采集具有典型葡萄炭疽病癥狀的果實(shí)病樣3份,將其帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

1.2 病原菌的分離與純化

采用單孢分離法[16]對(duì)具有典型癥狀的炭疽病果進(jìn)行病原菌分離。直接從果實(shí)表面發(fā)病部位溢出的粉紅色黏液(分生孢子團(tuán))中挑取分生孢子制成孢子懸浮液,調(diào)到適當(dāng)濃度后,用涂布器將其均勻涂于1.5%水瓊脂平板表面。在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h左右,置于顯微鏡下觀察并用金屬針挑取單個(gè)孢子,轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)至經(jīng)滅菌的PDA斜面凍存管中,培養(yǎng)7 d后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA平板上接種分離純化后的單孢菌株,于25℃、L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng),采用十字交叉法連續(xù)6 d測(cè)量菌落直徑,計(jì)算生長(zhǎng)速率,每個(gè)菌株重復(fù)3次;定期觀察病原菌菌落形態(tài),待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后拍照記錄菌落的形態(tài)和顏色。產(chǎn)孢后在顯微鏡下觀察孢子和附著胞形態(tài),并對(duì)其大小進(jìn)行測(cè)量,根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定病原菌種類。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

單孢系菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后用滅菌牙簽刮取菌絲,采用CTAB法提取病原菌的基因組DNA,用表1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12,17]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,查找并下載相關(guān)種的模式菌株參考序列。在BioEdit 7.0.9.0軟件上對(duì)各菌株的序列進(jìn)行校正,校正后的序列按照ACT、GAPDH、ITS、TUB2、和CAL的順序進(jìn)行拼接,然后在CIPRES Science Gateway網(wǎng)站(https:∥www.phylo.org/portal2/login!input.action)上利用最大似然法(maximum likelihood, ML)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

表1 用于本研究的引物

1.5 致病性測(cè)定

將分離的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅(d=4 mm)備用。依據(jù)柯赫氏法則,選取健康、大小一致的‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄果實(shí),采用刺傷處理和無傷處理兩種方法進(jìn)行接種。將果實(shí)用流動(dòng)自來水沖洗干凈,用經(jīng)75%乙醇處理的剪刀將果實(shí)剪下,保留果柄,在75%乙醇中消毒30 s,再用無菌水沖洗3次,置于滅菌的濾紙上自然晾干。刺傷處理采用滅菌的昆蟲針造成微傷口,然后將準(zhǔn)備好的菌餅接在傷口處;無傷處理直接將菌餅接于葡萄果實(shí)上,以無菌PDA塊作對(duì)照處理。每個(gè)菌株接9個(gè)果實(shí),重復(fù)3次。將接種的果實(shí)放于恒溫(25±1)℃接種室中培養(yǎng),期間用加濕器進(jìn)行加濕,定期觀察并記錄果實(shí)發(fā)病情況。對(duì)發(fā)病果實(shí)進(jìn)行病原菌的再分離,完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查與病原菌分離

圖1 葡萄炭疽病在田間及果實(shí)上的癥狀Fig.1 Symptoms of grape anthracnose on grape berries

通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn),2020年廣西南寧明陽(yáng)基地葡萄炭疽病病穗率高達(dá)70%～80%,產(chǎn)量損失達(dá)50%。該病在田間主要危害果實(shí)(圖1a),受侵染的果實(shí)初期在果實(shí)表面形成黑褐色小斑點(diǎn),后逐漸擴(kuò)大為近圓形病斑(圖1b),有的表皮開裂,發(fā)病部位略凹陷(圖1c),病斑表面出現(xiàn)輪紋狀排列的小黑點(diǎn)(分生孢子盤),天氣潮濕時(shí),小黑點(diǎn)變成粉紅色的黏狀物(分生孢子團(tuán))(圖1d)。嚴(yán)重時(shí),病斑擴(kuò)展到半個(gè)甚至整個(gè)果面,通常整個(gè)果穗的大部分果粒受害,果粒腐爛,脫落或干縮形成僵果(圖1d)。通過單孢分離獲得4個(gè)菌株JZB330315～JZB330318。

2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上,4株菌株的形態(tài)學(xué)特征相似。菌落正面灰白色,背面淡橘黃色,邊緣白色(圖2a)。氣生菌絲致密,生長(zhǎng)速率為3.2～12.1 mm/d(平均:7.9 mm/d±2.7 mm/d,n=20)。培養(yǎng)后期接種點(diǎn)可見粉紅色的黏狀分生孢子團(tuán)(圖2b)。附著胞單胞,深棕色,形狀不規(guī)則,通常內(nèi)有顆粒物,大小為(9.77±2.61)μm×(6.19±1.47)μm(n=24),當(dāng)分生孢子萌發(fā)時(shí)可能形成隔膜(圖2c),分生孢子單胞,無色,光滑,圓柱形,兩端鈍圓,內(nèi)有顆粒物,有時(shí)具油球,大小為(16.08±1.08)μm×(5.37±0.48)μm(n=70)(圖2d)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步鑒定該菌為C.viniferum[14]。

圖2 Colletotrichum viniferum在PDA平板上的形態(tài)學(xué)特征(JZB330318)Fig.2 Morphological characteristics of Colletotrichum viniferum (JZB330318)growing on PDA

2.3 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將供試菌株(JZB330315～JZB330318)的ACT、CAPDH、ITS、TUB2、CAL序列提交至GenBank,獲得登錄號(hào)ACT(MZ557369～MZ557372)、GAPDH(MZ557377～MZ557380)、ITS(MZ557357～MZ557360)、TUB2(MZ615727～MZ615730)、CAL(MZ557373～MZ557376)。以C.trichellum為外群,基于最大似然法(ML)對(duì)4個(gè)菌株及其所在屬的其他菌株構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示,4個(gè)菌株均與C.viniferum聚為一支,自舉支持率為100%(圖3)。

圖3 基于ACT、GAPDH、ITS、TUB2和CAL等5個(gè)基因利用最大似然法(ML)對(duì)炭疽菌屬和相關(guān)分離菌株構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Maximum likelihood phylogenetic tree based on combined ACT, GAPDH, ITS, TUB2 and CAL sequences of Colletotrichum species and related isolates

2.4 致病性測(cè)定

隨機(jī)選取兩個(gè)菌株(JZB330316和JZB330318)進(jìn)行致病性測(cè)定,兩個(gè)菌株在刺傷接種5 d后觀察到接種部位出現(xiàn)圓形病斑,無傷處理和對(duì)照處理葡萄果實(shí)上沒有觀察到病斑產(chǎn)生;接種7～9 d,刺傷處理病斑擴(kuò)大并凹陷。無傷處理菌株JZB330318接種7 d后開始出現(xiàn)病斑,菌株JZB330316接種9 d左右開始出現(xiàn)病斑,后病斑逐漸擴(kuò)大并凹陷,對(duì)照處理未發(fā)病(圖4),2個(gè)菌株接種結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),菌株JZB330318的致病力強(qiáng)于菌株JZB330316。對(duì)接種發(fā)病的果實(shí)進(jìn)行病原菌的再分離,分離得到的菌株與原菌株形態(tài)特征一致。

圖4 Colletotrichum viniferum(JZB330316和JZB330318)接種離體果實(shí)9 d后的發(fā)病情況Fig.4 The incidence of Colletotrichum viniferum (JZB330316 and JZB330318)inoculated with vitro fruits for nine days

3 討論

目前C.viniferum在我國(guó)多個(gè)省份可引起葡萄炭疽病,是我國(guó)葡萄炭疽病的主要病原菌之一。本研究依據(jù)形態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育分析,將引起廣西南寧地區(qū)避雨栽培葡萄炭疽病的病原菌鑒定為C.viniferum,是首次在廣西發(fā)現(xiàn)C.viniferum引起葡萄炭疽病。然而,在我國(guó)引起葡萄炭疽病的病原菌有隱秘炭疽菌Colletotrichumaenigma、果生炭疽菌C.fructicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioide等10余種,因此該地區(qū)是否存在其他種的炭疽病病原菌尚不清楚,需要在今后進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

炭疽病的發(fā)生與環(huán)境條件密切相關(guān),高溫、潮濕多雨天氣有利于病害發(fā)生[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn),該葡萄園前期未能及時(shí)割除雜草,葡萄園通風(fēng)差,微氣候條件適合葡萄炭疽病發(fā)生;加上‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄品種本身較易感炭疽病[2],2種原因綜合起來可能導(dǎo)致2020年明陽(yáng)基地‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄在避雨栽培條件下炭疽病嚴(yán)重發(fā)生。在之后的栽培管理中應(yīng)注意改善田間小氣候,及時(shí)割草,并結(jié)合藥劑防治,減少葡萄炭疽病的發(fā)生。