畸形桑葉中病毒的鑒定及其小RNA特征分析

孔衛(wèi)青, 凌 君, 楊金宏

(安康學(xué)院, 陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安康 725000)

蠶桑產(chǎn)業(yè)是我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè),近年隨著生物技術(shù)的發(fā)展,蠶桑產(chǎn)業(yè)在食用、飼用、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用得到不斷拓展。桑葉是家蠶的唯一食物來源,桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要影響。植物病毒病可導(dǎo)致宿主品質(zhì)降低、產(chǎn)量下降、甚至絕收,危害嚴(yán)重。近年常見桑葉病毒病的相關(guān)報(bào)道,病害導(dǎo)致桑葉卷曲、畸形、發(fā)黃、萎縮等,影響桑葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。迄今為止已報(bào)道的感染桑樹病毒有桑花葉型萎縮病相關(guān)病毒(mulberry mosaic dwarf associated virus， MMDaV)[1]、桑花葉卷葉病相關(guān)病毒(mulberry mosaic leaf roll associated virus, MMLRaV)[2]、桑桿狀DNA病毒1(mulberry badnavirus-1, MBV-1)[3]、桑脈帶相關(guān)病毒(mulberry vein banding associated virus, MVBaV)[4]、?；ㄈ~萎縮類病毒(mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)[5]、柑橘葉斑病毒(citrus leaf blotch virus, CLBV)[6]、李壞死環(huán)斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)、桑潛隱病毒(mulberry cryptic virus, MuCV)[7]、煙草線條病毒(tobacco streak virus, TSV)[8]等,分屬于8個(gè)科。

陜西安康地區(qū)是我國(guó)優(yōu)質(zhì)繭絲生產(chǎn)基地,近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)桑園病毒病害日趨嚴(yán)重。小RNA(small RNA, sRNA)深度測(cè)序技術(shù)直接以宿主中sRNA為研究對(duì)象,是一種發(fā)現(xiàn)新病毒、監(jiān)控病毒變異的有效方法,在植物、無脊椎動(dòng)物和人體細(xì)胞病毒的鑒定和分類等方面有較多的應(yīng)用[9]。本研究對(duì)安康主要桑樹種植區(qū)進(jìn)行采樣調(diào)查,利用RT-PCR對(duì)9種病毒在樣品中的存在情況進(jìn)行鑒定,對(duì)MMLRaV、MMDaV、MMDVd和MuCV復(fù)合侵染的桑樹葉片小RNA(small RNA,sRNA)進(jìn)行深度測(cè)序和分析,為桑樹病毒病的防控和抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年春在安康市漢濱區(qū)五里鎮(zhèn)、大同鎮(zhèn)、恒口鎮(zhèn)等地調(diào)查桑病毒病發(fā)生情況,采集表現(xiàn)為畸形的桑樹病毒病癥狀的葉片68份,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取與RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證

利用EastepTMSuper 總RNA提取試劑盒(LS1040)提取桑樹葉片的總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5001)和2×PCR反應(yīng)混合液(M7122)進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,以桑樹actin基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照,檢測(cè)畸形桑樹葉片中的病毒。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 5 min預(yù)變性;94℃ 30 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。檢測(cè)引物來自文獻(xiàn)或利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 病毒檢測(cè)引物1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.3 sRNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

為進(jìn)一步鑒定桑樹中的病毒,對(duì)經(jīng)RT-PCR檢測(cè)復(fù)合感染了MMDaV、MMLRaV、MMDVd和MuCV的‘淮陰4號(hào)’桑樹進(jìn)行小RNA測(cè)序。取單株5個(gè)枝條,混合單枝條的3片桑葉為一個(gè)樣本,共5個(gè)重復(fù)樣本。以無病毒侵染的健康‘淮陰4號(hào)’桑樹葉片為對(duì)照,3個(gè)重復(fù)。提取各樣本總RNA,利用Qubit RNA檢測(cè)試劑盒(Q32855,Life)進(jìn)行定量,檢測(cè)合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司構(gòu)建sRNA文庫(kù),Qubit DNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)合格的sRNA文庫(kù)進(jìn)行Hiseq 2500平臺(tái)高通量測(cè)序。

1.4 候選病毒sRNA序列分析

對(duì)測(cè)序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù),篩選長(zhǎng)度為18～28 nt的sRNA,使用Bowtie 1.0軟件和無參考基因組分析候選寄主病毒sRNA,統(tǒng)計(jì)sRNA數(shù)量、長(zhǎng)度、5′-末端核苷酸組成。對(duì)基因組環(huán)狀病毒,通過在完整基因組序列后面手動(dòng)加入其自身的第1～27 nt序列作參考基因組進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 侵染桑樹的主要病毒種類檢測(cè)

RT-PCR對(duì)68份畸形桑樹葉片進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果共檢測(cè)到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4種病毒,其中MuCV只在1份樣品中被檢出,該樣品同時(shí)檢出了MMDaV、MMLRaV、MMDVd(圖1b),為4種病毒的復(fù)合侵染(圖1a)。MMDVd的檢出率為47.06%,且所有檢出MMDVd的樣本均同時(shí)檢測(cè)到MMDaV和MMLRaV(圖1c)。MMLRaV的檢出率為83.82%(圖1d),MMDaV在68份樣品均檢測(cè)(圖1e)。MBV-1、MVBaV、CLBV、PNRSV和TSV等5種病毒在本次采集樣本中沒有檢測(cè)到。

圖1 4種病毒復(fù)合侵染桑樹的癥狀及病毒侵染樣本的檢測(cè)Fig.1 Symptom of mulberry infected by four viruses and the detection of samples infected by viruses

2.2 sRNA及其特征分析

去除低質(zhì)量和長(zhǎng)度小于18 nt大于28 nt的測(cè)序數(shù)據(jù),復(fù)合侵染桑樹樣本和對(duì)照樣本分別得到sRNA序列58 920 928條和32 715 082條,數(shù)據(jù)過濾后復(fù)合侵染桑樹樣本獲得病毒sRNA序列6 470 767條,對(duì)照樣本僅獲得74條,幾乎沒有病毒來源序列(表2)。與GenBank病毒數(shù)據(jù)庫(kù)和桑樹病毒序列進(jìn)行比對(duì),所得sRNA可以比對(duì)到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4種病毒的核酸序列,與前述RT-PCR鑒定結(jié)果一致。

表2 復(fù)合侵染和對(duì)照桑樹樣本的sRNA數(shù)

統(tǒng)計(jì)sRNA的長(zhǎng)度,MMLRaV、MMDVd、MuCV的sRNA長(zhǎng)度以21 nt最多,而MMDaV的sRNA長(zhǎng)度以24 nt最多(圖2)。分別統(tǒng)計(jì)來自本研究4種病毒基因組鏈和互補(bǔ)鏈的sRNA的末端序列(圖3),結(jié)果顯示MMDaV基因組鏈sRNA的5′-末端以A和T為主,分別占總數(shù)的37.10%和32.39%,互補(bǔ)鏈以A為主,占總數(shù)的44.57%。MMLRaV和MMDVd基因組鏈sRNA的5′-末端以T最多,均占總數(shù)的50%以上,而其互補(bǔ)鏈剛好相反,以A和G居多。MuCV基因組鏈sRNA的5′-末端以C最多,占總量的54.15%,互補(bǔ)鏈主要為A,占其總量的70.66%。

圖2 4種病毒sRNA長(zhǎng)度分布Fig.2 Length distribution of sRNA from four viruses

圖3 4種病毒基因組鏈和互補(bǔ)鏈sRNA 5′-末端堿基Fig.3 The 5′-terminal nucleotide bias of sRNA from genomic and negative strands of four viruses

3 討論

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,近年來報(bào)道的病毒種類不斷增多,同時(shí),由于媒介昆蟲能傳播多種病毒,植物病毒的復(fù)合侵染現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。桑樹病毒病在我國(guó)江蘇、廣東、廣西、陜西等地均有發(fā)生,且復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重,發(fā)生癥狀多為卷葉、花葉、皺縮等,難以區(qū)分,如孫勛勛等[10]從皺縮狀和花葉狀桑葉樣品中同時(shí)檢測(cè)到MMDaV和MVBaV,Ma等[1]從畸形的桑樹葉片中同時(shí)檢測(cè)到3種病毒MMDaV、MMLRaV和MMDVd。本文利用RT-PCR對(duì)安康地區(qū)3個(gè)蠶桑重點(diǎn)鎮(zhèn)桑園的68份桑葉樣本的感染情況進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了最多4種病毒的復(fù)合侵染。

MMDaV為雙生病毒科Geminiviridae成員,又被稱為桑樹皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus, MCLV),目前的研究主要集中在病毒的檢測(cè),先后建立了酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、核酸斑點(diǎn)雜交(nucleic acid spot hybridization,NASH)、基于SYBR GreenⅠ的qPCR檢測(cè)等方法[12-14]。柴建萍等對(duì)發(fā)病桑園中半翅目Hemiptera粉虱科Aleyrodidae桑粉虱Pealiusmori的研究顯示,其可通過取食獲毒,是該病毒的攜帶者和傳播媒介[15]。但關(guān)于MMDaV的侵染性、宿主范圍及其損害評(píng)估等缺乏相關(guān)研究。MMLRaV為豇豆花葉病毒科Comoviridae成員,2014年盧全有在花葉卷葉癥狀桑葉中發(fā)現(xiàn)[2]。MMDVd為植物亞病毒感染因子,又稱為小分子環(huán)狀RNA(mulberry small circular RNA,mscRNA),最新研究顯示其為MMLRaV的衛(wèi)星RNA。MuCV為雙分病毒科Partitiviridae成員[7],2020年在陜西安康地區(qū)發(fā)現(xiàn),MuCV的感染是首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn),該病毒引起癥狀不顯著,同時(shí)存在于無癥狀桑葉中,給桑樹病毒病的預(yù)防和防治提供了參考。

植物在對(duì)抗病毒侵染的過程中,通過RNA沉默機(jī)制靶向病毒基因組可產(chǎn)生病毒小RNA[16],近年來,利用小RNA深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)植物病原應(yīng)用廣泛。本文對(duì)復(fù)合病毒感染的畸形桑葉進(jìn)行了小RNA深度測(cè)序,分析葉片感染的病毒,所得結(jié)果與RT-PCR鑒定一致,未發(fā)現(xiàn)其他新病毒。病毒sRNA的產(chǎn)生和其在寄主體內(nèi)的復(fù)制機(jī)制有關(guān),本文進(jìn)一步分析4種病毒sRNA的長(zhǎng)度和5′-末端組成。從長(zhǎng)度組成,3種RNA病毒MMLRaV、MMDVd和MuCV的sRNA長(zhǎng)度主要為21 nt,DNA病毒MMDaV以24 nt最多,與非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)中的研究一致[17],說明3種RNA病毒和DNA病毒由不同Dicer-like(DCL)蛋白加工生成[18]。不同sRNA的5′-末端組成決定了其結(jié)合的宿主蛋白[19-20],5′-末端序列組成方面,MMLRaV和MMDVd比較一致,與MuCV和MMDaV均不相同,說明本研究復(fù)合病毒侵染桑樹中存在多個(gè)sRNA識(shí)別裝載機(jī)制,為桑樹病毒的復(fù)制侵染機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。