植物誘抗劑AHO聯(lián)合莖尖培養(yǎng)脫除馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒

張麗珍, 趙立華, 吳 闊, 陳永對, 蘇曉霞, 張仲凱, 董家紅

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650205; 2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650500)

馬鈴薯是世界上繼水稻、玉米、小麥后的第四大主糧作物。我國馬鈴薯年種植面積穩(wěn)定在500萬hm2以上,在保障糧食安全、助力脫貧攻堅(jiān)中起到重要作用。馬鈴薯的種薯繁殖主要靠無性繁殖,極易感染病毒,由于病毒在馬鈴薯體內(nèi)的積累,造成馬鈴薯種性退化,品質(zhì)與產(chǎn)量降低。能侵染馬鈴薯屬的病毒有40余種,病毒病害是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的重要危害[1-3]。近年的研究數(shù)據(jù)顯示,馬鈴薯S病毒(potato virus S, PVS)、馬鈴薯Y病毒(potato virus Y, PVY)是我國馬鈴薯試管苗和種薯上檢出率最高的2種病毒,檢出率近20%,高于其他病毒的檢出率[4-5]。有效控制馬鈴薯病毒病的主要方法是通過莖尖脫毒,然而傳統(tǒng)的莖尖脫毒,較難脫除PVS、PVY等[6]。使用抗病毒化合物病毒唑(ribavirin)干擾病毒復(fù)制,聯(lián)合莖尖脫毒可成功脫除馬鈴薯X病毒(potato virus X, PVX)、馬鈴薯M病毒(potato virus M, PVM)、PVY和PVS,獲得健康馬鈴薯植株[7-11]。由于植物種類、品種、感染病毒種類的不同,病毒唑會對植物產(chǎn)生不同程度的毒性,即使在5 μg/mL的濃度條件下,植株的生長也會受到嚴(yán)重影響[8],在0～150 mg/L濃度范圍,馬鈴薯試管苗株高和鮮重會隨著病毒唑的濃度增加而降低[12]。

3-丙酮基-3-羥基羥吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO)是從板藍(lán)Strobilanthescusia中分離得到的一種天然產(chǎn)物,對菊科白粉菌Erysiphecichoracearum、煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus)有較好的抑制效果[13-15],作用機(jī)制研究表明,AHO作用于植物水楊酸途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)而激活植物的系統(tǒng)獲得抗性[13,16],以抵抗病原菌的侵染。AHO屬于植物源的抗性誘導(dǎo)劑,能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,抑制病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制、運(yùn)動,且不影響植物正常生長。

本研究在繼代培養(yǎng)前的馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)小苗上噴施100 mg/L AHO水劑,經(jīng)過3次處理后,能快速有效地獲得無病毒健康馬鈴薯再生苗,為生產(chǎn)馬鈴薯無病毒種苗提供了有效措施。

1 材料與方法

1.1 植物材料、誘抗劑及質(zhì)粒

帶病毒馬鈴薯材料為‘定薯3號’ ‘定薯4號’ ‘靖薯3號’ ‘靖薯4號’的薯塊,經(jīng)ELISA、負(fù)染色電鏡觀察方法檢測,確定‘定薯3號’和‘定薯4號’的薯塊攜帶PVS,‘靖薯3號’和‘靖薯4號’的薯塊攜帶PVY。

AHO干粉由中國科學(xué)院昆明植物所郝小江實(shí)驗(yàn)室提供,取1 g AHO干粉先溶于1 mL二甲基亞砜,然后用ddH2O定容至100 mL,獲得1%的AHO水劑(濃度為10 g/L)作為儲存液,用細(xì)菌過濾器過濾后保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取儲存液用ddH2O稀釋100倍(濃度為100 mg/L)。

用于構(gòu)建PVS、PVY熒光定量檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 馬鈴薯莖尖剝離、莖尖組織培養(yǎng)、擴(kuò)繁

馬鈴薯薯塊用10～20 mg/L赤霉素溶液浸種15～30 min,晾干后催芽至芽長1～2 cm。取健壯芽,流水沖洗30 min,無菌條件下用75%乙醇浸泡30 s,無菌水沖洗2次;再用0.1%升汞浸泡6 min,無菌水漂洗5～8次,消毒的外植體接種在MS培養(yǎng)基上[17],培養(yǎng)獲得馬鈴薯植株。剪取該馬鈴薯植株的莖尖,借助40倍雙目解剖鏡,剝離莖尖直至露出半圓形光滑的生長點(diǎn),用鋒利的無菌解剖針小心切取0.2 mm以下的帶1～2個(gè)葉原基的莖尖,迅速接種于已準(zhǔn)備好的莖尖培養(yǎng)基(MS+0.6 mg/mL 6-BA+0.3 mg/mL GA+0.1 mg/mL NAA)上,于溫度20～25℃,光照2 000～3 000 lx,每天光照12 h條件下培養(yǎng),直至長成帶4～5個(gè)葉片的完整馬鈴薯試管苗。每個(gè)試管苗植株可剪成4～5段擴(kuò)繁,每隔一節(jié)帶一片葉,切段直立地插入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 AHO處理試管苗

培養(yǎng)11 d 后,分別取帶有PVS的‘定薯3號’和‘定薯4號’以及帶有PVY的‘靖薯3號’和‘靖薯4號’的試管苗,各24株(平均株高5 cm左右),噴施100 mg/L AHO水劑,以噴施不含AHO(其他條件相同)的溶液為對照,每隔2 d噴施1次,共噴施3次,再培養(yǎng)2 d后取試管苗測株高、根長和鮮重;剝離莖尖置于莖尖培養(yǎng)基培養(yǎng)長至4～5個(gè)葉片,用負(fù)染色電鏡觀察、ELISA以及熒光定量PCR檢測。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 Excel 2007、 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 負(fù)染色方法

馬鈴薯芽眼部分或者組培苗負(fù)染參考文獻(xiàn)[18]。取0.5 g病葉置于20 μL的2.5%戊二醛上切碎,將銅網(wǎng)置于浸出液表面吸附3 min,吸干銅網(wǎng)表面液體后置于1%的鉬氨酸(m/V,溶于pH 7.2 的0.2 mol/L磷酸緩沖液)染色2 min。在透射電鏡(FEI TECNAI G2,USA)下觀察。

1.5 ELISA

采用ELISA對‘定薯3號’ ‘定薯4號’ ‘靖薯3號’ ‘靖薯4號’中的病毒進(jìn)行檢測。所檢病毒包括PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM。TZSV為本實(shí)驗(yàn)室自制抗體,其余病毒的檢測試劑盒購自美國Agdia公司,按照說明書進(jìn)行檢測。陽性樣品為本實(shí)驗(yàn)室保存,陰性樣品為健康馬鈴薯試管苗。

1.6 熒光定量RT-PCR

用于熒光定量RT-PCR檢測的引物采用Primer 5設(shè)計(jì),引物序列見表1。用購自Ambion公司的TRIzol試劑提取樣品總RNA。用北京全式金公司One-Step gDNA Removal 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈,用FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)制備反應(yīng)體系,包括cDNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL,Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)10 μL, ddH2O 4 μL。反應(yīng)在Applied Biosystems StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min;95℃ 10 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)5個(gè)重復(fù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:用Nano Drop 2000 測定重組質(zhì)粒的PVS濃度為141.70 ng/μL,OD260/OD280為1.83;PVY濃度為135.25 ng/μL,OD260/OD280為1.84。對重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍連續(xù)梯度稀釋,作為病毒檢測用陽性標(biāo)準(zhǔn)品,用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 PVS和PVY的檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)染色電鏡及ELISA檢測種薯芽帶毒種類

在‘定薯3號’ ‘定薯4號’ ‘靖薯3號’ ‘靖薯4號’的薯塊新芽汁液中,用電鏡均觀察到線狀病毒粒子(圖1),未發(fā)現(xiàn)其他病毒粒子。ELISA檢測結(jié)果表明‘定薯3號’和‘定薯4號’的樣品中帶有PVS,‘靖薯3號’和‘靖薯4號’中帶有PVY,沒有檢測到其他病毒。

圖1 電鏡觀察到的病毒粒子Fig.1 Virus particles under the electron microscope

2.2 AHO處理

2.2.1AHO處理對馬鈴薯試管苗生長的影響

攜帶PVS的‘定薯3號’和‘定薯4號’以及攜帶PVY的‘靖薯3號’和‘靖薯4號’的試管苗,噴施3次100 mg/L的AHO后2 d(擴(kuò)繁后的第20天)取試管苗測量株高(cm)、根長(cm)和鮮重(g)。由圖2可見,噴施100 mg/L AHO的4個(gè)品種株高、根長和鮮重較對照略有增加,無不良影響。

圖2 AHO對馬鈴薯試管苗生長的影響Fig.2 Effect of AHO on the growth of in vitro potato plantlets

2.2.2ELISA和電鏡檢測AHO處理后的試管苗

每個(gè)品種各挑選24株試管苗,分別用100 mg/L AHO噴施,對照不含AHO(其他條件相同),每隔2 d噴施1次,共3次,末次噴施2 d后取試管苗再進(jìn)行莖尖剝離脫毒,培養(yǎng)30 d后,取存活試管苗用ELISA檢測PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM等病毒,各品種均未檢測到PVX、PLRV、PVA、TSWV、TZSV和 PVM,在‘定薯3號’和‘定薯4號’檢測到PVS,在‘靖薯3號’和‘靖薯4號’檢測到PVY,與用于脫毒的薯塊檢測結(jié)果一致,但AHO處理的試管苗陰性率要高于對照(表2)。

進(jìn)一步計(jì)算ELISA檢測的OD值平均值發(fā)現(xiàn),處理前、對照、AHO處理的試管苗,PVS、PVY的ELISA檢測OD值平均值呈遞減趨勢(圖3)。

表2 馬鈴薯試管苗存活率及病毒脫除率1)

圖3 處理前、對照、AHO處理的馬鈴薯試管苗ELISA檢測Fig.3 ELISA detection for in vitro potato plantlets of pre-treatment, control and AHO-treatment

抽取每個(gè)處理ELISA檢測值最低的試管苗進(jìn)行負(fù)染色電鏡觀察驗(yàn)證,結(jié)果見表3、4,電鏡觀察顯示處理前、對照、AHO處理的試管苗中的病毒粒子數(shù)量也呈下降趨勢。

表3 ‘定薯3號’和‘定薯4號’試管苗處理前、對照、AHO處理ELISA和電鏡負(fù)染色檢測1)

續(xù)表3 Table 3(Continued)

表4 ‘靖薯3號’和‘靖薯4號’試管苗處理前、對照、AHO處理ELISA、電鏡負(fù)染色檢測

2.2.3熒光定量RT-PCR檢測病毒相對量

為證實(shí)AHO對病毒的抑制作用,用熒光定量RT-PCR對分別噴施1、2、3次AHO的馬鈴薯試管苗進(jìn)行病毒相對量檢測,檢測結(jié)果見圖4。抑制率由病毒相對濃度計(jì)算而得,計(jì)算公式:抑制率=(1-噴施AHO/不噴施AHO)×100%。由圖4可知,AHO對‘定薯3號’‘定薯4號’和‘靖薯3號’‘靖薯4號’試管苗中的PVS和PVY具有顯著的抑制效果,噴施3次后,抑制率可達(dá)99.97%以上。

圖4 AHO處理后馬鈴薯試管苗中病毒相對量Fig.4 Virus relative concentration of in vitro plantlets

3 討論

馬鈴薯大田種薯和試管苗樣品中PVS、PVY的檢測率較高[4-5],可能與這兩種病毒較難通過莖尖培養(yǎng)脫除有關(guān)。AHO能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性,本研究用100 mg/L AHO噴施攜帶PVS的‘定薯3號’‘定薯4號’和攜帶PVY的‘靖薯3號’‘靖薯4號’的試管苗,莖尖剝離培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)用AHO處理與對照的苗存活率均在50%,株高、根長、鮮重?zé)o顯著差異(圖2),說明AHO對‘定薯3號’ ‘定薯4號’‘靖薯3號’‘靖薯4號’的試管苗無毒性;病毒檢測發(fā)現(xiàn),攜帶PVS的‘定薯3號’和‘定薯4號’試管苗用AHO處理后PVS陰性率為19.80%,未處理的試管苗PVS陰性率為4.17%;用AHO處理的‘靖薯3號’和‘靖薯4號’試管苗PVY陰性率為11.85%,未處理的為3.84%。ELISA檢測顯示,帶毒試管苗檢測到病毒OD值,相對未處理呈下降趨勢(圖3)。負(fù)染色電鏡觀察顯示,用AHO處理,帶毒試管苗平均每30個(gè)視野觀察的病毒粒子低于未處理(表3、4)。熒光定量RT-PCR檢測了未處理、處理1次、2次、3次后(第3次的取ELISA檢測為陰性的試管苗),對PVS、PVY具有顯著的抑制效果(圖4),抑制率高于99.97%。通常馬鈴薯病毒的脫除效率依據(jù)病毒種類、病毒量等特性,往往需要莖尖剝離3次以上,才能普遍獲得無毒(或檢測不到病毒)的試管苗,我們的研究結(jié)果表明,使用AHO處理后,提高了病毒的脫除效率。莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得馬鈴薯無病毒苗非常有效的方法,但脫毒效率往往會受到莖尖分生組織大小、病毒特性、品種的影響,在分生組織培養(yǎng)前,通過熱處理、冷凍處理、病毒唑或幾種方法聯(lián)合可以提高脫除病毒的效率[11],但因病毒唑的植物毒性,會降低莖尖分生組織存活率[19-20]。本文使用的AHO除對植物有較好的誘抗作用外,與對照比較并沒有植物毒性,為有效脫除馬鈴薯病毒提供了一個(gè)可選的方法。