引起浙貝母黑斑病的交鏈格孢單抗及檢測試紙條的制備

溫思思, 趙福運, 郭飄逸, 徐云飛, 趙偉春

(浙江中醫(yī)藥大學, 杭州 310053)

浙貝母FritillariathunbergiiMiq.是著名的“浙八味”之一,具有清熱化痰,散結(jié)解毒的作用,可治療風熱咳嗽、肺癰喉痹、瘰疬、瘡瘍腫毒等癥[1]。浙貝母黑斑病是由交鏈格孢Alternariaalternata等引起的真菌性病害[2],侵染的早期癥狀為葉尖發(fā)病,隨后向葉基部蔓延,最后導(dǎo)致浙貝母鱗莖瘦小,產(chǎn)量及質(zhì)量降低[3]。近年來,分子生物學[4-5]、光譜學[6]、紅外熱成像[7]等檢測技術(shù)逐步應(yīng)用于病害監(jiān)測,但是上述檢測手段技術(shù)復(fù)雜,成本高昂,不適于田間應(yīng)用。農(nóng)戶依靠肉眼辨別癥狀,易誤判且發(fā)現(xiàn)癥狀時通常已錯過最佳防治時期。農(nóng)戶大多只能通過過量噴灑農(nóng)藥進行防治,不僅不能精準防治,還會造成病原微生物耐藥性、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題?；诖?本項目采用雜交瘤技術(shù)制備針對交鏈格孢的單抗,并研發(fā)膠體碳免疫層析試紙條,為農(nóng)戶提供準確、高效、經(jīng)濟、便捷的浙貝母黑斑病檢測產(chǎn)品,為田間浙貝母黑斑病的早發(fā)現(xiàn)、早防治提供技術(shù)支持,為研究浙貝母交鏈格孢的侵染機制提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種:從浙貝母黑斑病病株上分離并經(jīng)分子鑒定的交鏈格孢菌株[2],本實驗室保存。供試動物:Bal b/c小鼠,生產(chǎn)許可證:SYXK(浙)2021-0006,由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。RPMI-1640干粉、HAT干粉、HT干粉、PEG-4000、降植烷均購自美國Sigma公司,辣根過氧化酶標記羊抗小鼠IgG(酶標二抗)購自KPL公司,兔IgG、羊抗兔IgG、預(yù)染蛋白Marker均購自Solarbio公司,小鼠單抗亞類鑒定試劑盒購自佰奧通實驗材料中心,膠體碳標記抗體試劑盒購自北京納晶生物科技有限公司。

1.2 儀器

酶標儀Multiskan Flash購自Thermo公司,超聲波細胞粉碎機BILON-250Y購自上海比郎儀器制造有限公司,電泳儀DYY-6C購自北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1抗原制備和小鼠免疫

挑取交鏈格孢單菌落接種于100 mL PDB培養(yǎng)基中,25℃振蕩培養(yǎng)5 d后,收集菌絲和孢子,超聲波破碎后6 000 r/min離心20 min,收集上清,酶標儀測定上清的蛋白含量,用pH7.2的PBS調(diào)節(jié)至蛋白濃度為1 mg/mL作為免疫抗原及后期檢測用抗原。其他分離自浙貝母的真菌包括木賊鐮刀菌Fusariumequiseti、灰葡萄孢Botrytiscinerea、半裸鐮刀菌F.incarnatum、尖孢鐮刀菌F.oxysporum、細極鏈格孢A.tenuissima、茄病鐮刀菌F.solani、莖點霉屬真菌Phomasp.和Phomopsisoblonga等抗原的制備方法同上。取交鏈格孢抗原免疫3只6～8周齡的Bal b/c小鼠[8],0.1 mg/只。第3次免疫后7 d,取小鼠頜下腺血,4℃冰箱放置15 min后,4 000 r/min離心10 min,取上層血清-20℃保存。采用間接ELISA測定血清效價[9]。用碳酸鹽緩沖液將交鏈格孢抗原稀釋1 000倍后包被酶標板(即1 μg/mL),4℃過夜,PBST洗滌3次后用3%脫脂奶封閉60 min。將小鼠血清倍比稀釋加入包被孔,以1% BSA為陰性對照,每孔100 μL,37℃溫育1 h,PBST洗滌3次后加入稀釋5 000倍的酶標二抗100 μL/孔,37℃溫育1 h,PBST洗滌后加入鄰苯二胺(OPD)底物顯色液顯色,使用50 μL 2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)后,酶標儀測定OD值(λ=490 nm),以與陰性對照比值大于2為陽性,最低陽性值對應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)即為抗體的效價。

1.3.2單抗的制備

采用雜交瘤技術(shù)制備單抗[10]。取效價>104的小鼠制備脾細胞懸液,與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0在PEG-4000的作用下進行細胞融合。將融合細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板,用HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)13 d后,換用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此時仍在生長的細胞即為雜交瘤細胞。待細胞鋪滿96孔板孔底1/4時,取細胞培養(yǎng)上清液,以稀釋1 000倍的交鏈格孢抗原包被酶標板,采用間接ELISA檢測各細胞培養(yǎng)孔中細胞分泌抗體的陽性反應(yīng)情況。篩選出強陽性的細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板進行擴大培養(yǎng)。待細胞鋪滿24孔板孔底 1/4 時,取細胞培養(yǎng)上清液,以稀釋1 000倍的木賊鐮刀菌、茄病鐮刀菌、半裸鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、交鏈格孢、細極鏈格孢、灰葡萄孢、莖點霉屬真菌和P.oblonga的抗原分別包被酶標板,用間接ELISA法檢測抗體的特異性,篩選只與交鏈格孢反應(yīng)的特異性細胞株,用有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)[10];重復(fù)進行陽性孔篩選、擴大培養(yǎng)、特異性篩選和克隆化培養(yǎng),直至獲得陽性率為100%的單株細胞。進一步擴大培養(yǎng),以細胞數(shù)5×105～1×106個/只注入預(yù)先腹腔注射降植烷的小鼠。收集腹水,純化后 -80℃ 保存。

1.3.3單抗的特性鑒定

1.3.3.1單抗的效價檢測

采用間接ELISA測定抗體的效價。操作流程見1.3.1,將小鼠血清替換為純化后的腹水型單抗。

1.3.3.2單抗的特異性檢測

以1.3.2所述的8種真菌為檢測對象,將上述抗原用包被液稀釋至1 μg/mL后包被酶標板。以1% BSA為陰性對照,用間接ELISA法檢測腹水型單抗的特異性,其中單抗稀釋20 000倍,酶標二抗稀釋5 000倍。操作流程見1.3.1。

1.3.3.3單抗的靈敏度檢測

采用間接ELISA測定單抗的靈敏度。步驟同1.3.1,將抗原倍比稀釋(1∶80×20～1∶80×210)后包被在酶標板上,重復(fù)8次,第12列為陰性對照,用1% BSA包被。以稀釋20 000倍的單抗作為一抗,與陰性對照比值大于2則視為陽性,測得抗原最大稀釋倍數(shù),檢測靈敏度=1 000 μg/mL÷最大稀釋倍數(shù)。

1.3.3.4單抗的類型及亞類鑒定

用鑒定小鼠單抗亞類的ELISA試劑盒對單抗類型和亞類進行鑒定。單抗稀釋20 000倍用于檢測,每種單抗重復(fù)3次,其他操作步驟按試劑盒說明書進行。陽性孔所對應(yīng)的抗體Ig類型及亞類即為該單抗的抗體類型及亞類。

1.3.3.5抗體結(jié)合蛋白的檢測

采用Western blot技術(shù)檢測抗體結(jié)合蛋白。濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和10%,樣品和預(yù)染的Marker的上樣量分別為20 μL和3 μL。經(jīng)10 mA 恒流后改為120 V恒壓。半干轉(zhuǎn)印法在25 V恒壓下轉(zhuǎn)印30 min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)印后的膜用3%脫脂奶室溫封閉,單抗稀釋20 000倍,酶標二抗稀釋5 000倍,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色,蒸餾水終止顯色反應(yīng)。以標準蛋白(M)的對數(shù)對相對遷移率(x)擬合線性方程。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率,計算其相對分子質(zhì)量:log(M)=alogx+b。

1.3.4膠體碳免疫層析試紙條的制備及初步應(yīng)用

試紙條的制備:取稀釋10倍后的腹水型單抗AaA1和兔IgG抗體,按照膠體碳標記抗體試劑盒說明書分別制備碳標抗體。將15 μL碳標單抗AaA1、25 μL碳標兔IgG抗體與25 μL噴碳稀釋液混合后按4 μL/cm噴點在玻璃纖維膜上,37℃烘干。在NC膜上,噴涂45 μL羊抗兔IgG作為質(zhì)控線,噴涂45 μL單抗AaC2作為檢測線,37℃干燥過夜。將樣品墊、噴有碳標抗體的玻璃纖維膜、包被有羊抗兔IgG和單抗AaC2的NC膜、吸水紙按序粘于雙面膠板上,完成后切割成3 mm的試紙條,組裝至包裝盒內(nèi)成膠體碳免疫層析試紙條[11]。

試紙條的初步應(yīng)用:取1 000 μg/mL的交鏈格孢抗原,用PBS緩沖液倍比稀釋(1∶10×21～1∶10×26),吸取100 μL滴加于試紙條加樣孔中。以滴加相同體積的PBS緩沖液為空白對照。10 min內(nèi)觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色變化。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交瘤細胞株的制備

共獲得雜交瘤細胞生長孔189個,融合率為33.1%,其中陽性孔26個,陽性率為13.7%。最終得到3株穩(wěn)定分泌針對交鏈格孢抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為AaA1、AaC2和AaC5。各細胞株分別制備獲得腹水型單抗約10 mL。

2.2 單抗的效價測定

如圖1所示,AaA1的效價為稀釋6.40×105倍,AaC2、AaC5的效價均為稀釋1.28×106倍,稀釋20 000倍時OD值明顯降低,選擇稀釋20 000倍用于后續(xù)試驗。

圖1 交鏈格孢單抗效價Fig.1 Titer of monoclonal antibody (McAbs) against Alternaria alternata

2.3 單抗的特異性檢測

單抗AaA1、AaC2、AaC5均只與交鏈格孢抗原反應(yīng),均不與木賊鐮刀菌、灰葡萄孢、半裸鐮刀菌、細極鏈格孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、莖點霉屬真菌、P.oblonga的抗原反應(yīng)。結(jié)果見圖2。

圖2 交鏈格孢單抗的特異性檢測Fig.2 Specific detection of McAbs against Alternaria alternata

2.4 單抗的靈敏度測定

如圖3所示,AaA1的抗原最大稀釋倍數(shù)為81 920倍,即檢測靈敏度為:1 000 μg/mL÷81 920=12.21 ng/mL。AaC2、AaC5的抗原最大稀釋倍數(shù)均為40 960倍,即檢測靈敏度為:24.41 ng/mL。

圖3 交鏈格孢單抗靈敏度Fig.3 Sensitivity of McAbs against Alternaria alternata

2.5 單抗類型及亞類測定

當單抗與某種已知類型或亞型的酶標第二抗體特異性結(jié)合時,則該單抗即為對應(yīng)的抗體Ig類型及亞類。如圖4所示,AaC2、AaC5抗體類型均為IgG3,AaA1則為IgG2a。

2.6 單抗結(jié)合蛋白檢測

如圖5和表1所示,以標準蛋白質(zhì)M的對數(shù)對相對遷移率x擬合方程,計算得出AaA1、AaC2、AaC5的結(jié)合蛋白分子量分別為37、62 kDa和66 kDa。

圖4 交鏈格孢單抗類型與亞類Fig.4 Antibody type of McAbs against Alternaria alternata

表1 單抗結(jié)合蛋白標準曲線及分子量

2.7 膠體碳免疫層析試紙條的制備及初步應(yīng)用

隨著抗原濃度升高,檢測線從無到有,由淺入深,抗原最低檢測濃度為6.25 μg/mL(圖6)。由于檢測時加樣量為100 μL,抗原最低檢測量為625 ng。

圖5 交鏈格孢單抗結(jié)合蛋白Fig.5 Alternaria alternata McAbs binding protein

圖6 膠體碳免疫層析試紙條的初步應(yīng)用Fig.6 Preliminary application of colloidal carbon immunochromatographic test strips

3 結(jié)論與討論

植物感染真菌性病害是一個病原真菌在體內(nèi)不斷累積的過程。當病原真菌侵染至一定程度時會表現(xiàn)出病害癥狀,此時植物體內(nèi)的病原真菌數(shù)已達到較高的水平,施用殺菌劑的防治效果不盡如人意,亟須一種快捷簡便的早期診斷技術(shù)。近年來,植物病害檢測技術(shù)發(fā)展迅速,趙森等[6]利用高光譜技術(shù),已實現(xiàn)刺五加黑斑病的早期診斷,能夠保證較高的準確性和實時性,但光譜技術(shù)目前僅適用于科學研究;向日葵黑斑病的檢測方式主要集中于PCR檢測技術(shù)[12],不適用農(nóng)戶田間應(yīng)用;月季[13]、冬棗[14]、菊花[15]、浙貝母[2]等植物黑斑病檢測方式集中于形態(tài)學和分子生物學方法,分子生物學檢測方法雖然精準度高,但是需要較高成本,缺乏實用性[7]。因此,為準確且及時地確定病害種類,需要更為精準且實用的檢測手段。制備針對基于單抗的浙貝母黑斑病膠體碳免疫層析試紙條將為診斷黑斑病提供新的便捷手段。

不同于常規(guī)單抗制備過程中采用單一特異性目的蛋白作為免疫原[17-18],本文以交鏈格孢的孢子和菌絲經(jīng)超聲波破碎后溶解于PBS的上清蛋白為抗原免疫小鼠,全菌體蛋白成分復(fù)雜,不同真菌間存在相似抗原成分,尤其是同屬的不同種間,能與抗體發(fā)生相似的分子識別作用,使得相互間可能發(fā)生交叉反應(yīng)。為此,本文通過對抗體進行大規(guī)模的特異性篩選,得到了不與其他8種分離自浙貝母的其他屬的病原真菌交叉反應(yīng),只針對交鏈格孢的單抗及其細胞株。經(jīng)檢測,單抗靈敏度高,且不受浙貝母提取液干擾;特異性強,能夠與交鏈格孢抗原強烈反應(yīng)而不與其他菌種交叉反應(yīng)并且與目標蛋白結(jié)合單一;靈敏度高,與目標蛋白結(jié)合的分子量大小固定,具有良好的開發(fā)前景。

基于此單抗的免疫層析試紙條抗原最低檢測限位為6.25 μg/mL,采用的膠體碳顆粒具備更高的靈敏度、穩(wěn)定性和環(huán)保性[16],更符合田間檢測條件和需求。田間應(yīng)用時操作簡便,只需要利用配備的一次性離心管、研磨棒、吸管等進行簡單的研磨和加樣就可完成全部操作,并且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。檢測時間從采樣到出結(jié)果只需15 min,特別適用于田間樣品的大規(guī)模快速檢測。此外,1株單抗的開發(fā)成本約為3.5萬元,相較于雜交瘤細胞株的制備,后續(xù)單抗及試紙條的制備所需成本更為低廉。并且試紙條的大量生產(chǎn)使得制備雜交瘤細胞株所需的費用分攤至單個試紙條的費用降低,生產(chǎn)成本僅為1.7元/條。同時出于試紙條運輸、儲存、推廣等額外費用及盈利的考慮,試紙條定價5元/條。與其他檢測方法相比較,成本非常低,基層人員普遍可以承受。目前試紙條仍處于實驗室應(yīng)用階段,后期將逐步開展該試紙條的田間檢測應(yīng)用。

由交鏈格孢引起的黑斑病危害農(nóng)作物的種類眾多[19-20],制備針對交鏈格孢的單抗及其檢測試紙條不但可為浙貝母黑斑病的田間快速、簡便、經(jīng)濟的檢測提供手段和方法,也可能為其他植物黑斑病的快速檢測提供科學依據(jù),為植物黑斑病的早發(fā)現(xiàn)、早防治提供可能。