基于TaqMan MGB探針的可可花癭病菌快速檢測方法

呂 燕, 郭立新, 段維軍*

(1. 寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 寧波 315012; 2. 寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司, 寧波 315012;3. 寧波海關(guān), 寧波 315012)

可可花癭病菌Albonectriarigidiuscula(Berk. & Broome) Rossman & Samuels屬真菌界Fungi子囊菌門Ascomycota糞殼菌綱Sordariomycetes肉座菌目Hypocreales叢赤殼科Nectriaceae白殼屬Albonectria,其無性階段也被稱作多隔鐮刀菌FusariumdecemcellulareBrick。目前,該病菌主要分布在亞洲的印度、印度尼西亞、伊朗、馬來西亞、菲律賓、斯里蘭卡;非洲的喀麥隆、中非、剛果、科特迪瓦、加納、馬達(dá)加斯加、尼日利亞、塞拉利昂;北美洲的伯利茲、哥斯達(dá)黎加、古巴、多米尼克、多米尼加、格林納達(dá)、危地馬拉、洪都拉斯、牙買加、墨西哥、尼加拉瓜、巴拿馬、波多黎各(美)、特立尼達(dá)和多巴哥、美國;大洋洲的美屬薩摩亞、法屬波利尼西亞、密克羅尼西亞、新喀里多尼亞(法)、巴布亞新幾內(nèi)亞;南美洲的阿根廷、巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、圭亞那、秘魯、蘇里南、委內(nèi)瑞拉;我國局部地區(qū)有發(fā)生危害報(bào)道[1-2]?？煽苫ò`病菌寄主范圍十分廣泛,包括可可Theobromacacao、芒果Mangiferaindica、毛葉棗Ziziphusmauritiana、羅漢松Podocarpusmacrophyllus、番荔枝Annonasquamosa、腰果樹Anacardiumoccidentale、中粒咖啡Coffeacanephora等多種植物[1-9]?？煽苫ò`病菌可造成多種病害,如在印度該病菌危害可可,嚴(yán)重時(shí)造成可可絕收[9],在多米尼加該病菌能造成芒果樹癌腫,發(fā)病率可達(dá)到10%～50%[4],在我國四川省攀枝花市該病菌危害芒果樹,造成3個(gè)芒果園內(nèi)樹木枯死[10]。該病菌也是《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中的一種檢疫性真菌[11]。

目前,口岸植物檢疫對可可花癭病菌的檢疫鑒定主要是按照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《可可花癭病菌檢疫鑒定方法》(SN/T 3284-2012)進(jìn)行[1],即通過對病健交界處進(jìn)行組織分離培養(yǎng),觀察病原菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀,并將病菌接種到寄主植物觀察致病性,整個(gè)過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且難以區(qū)分近似種,無法滿足口岸快速檢測通關(guān)需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外已有大量應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測植物病原真菌的報(bào)道[12-15],為準(zhǔn)確、快速檢測病原菌提供了重要參考。但是關(guān)于可可花癭病菌的分子檢測技術(shù)研究相對較少,段維軍等[8]通過rDNA ITS、28S、EF1α和TUB基因序列比對分析,發(fā)現(xiàn)可可花癭病菌及其近似種的ITS、28S序列差異較小,難以有效區(qū)分,而EF1α和TUB序列能夠進(jìn)一步對該病菌進(jìn)行有效劃分。迄今,尚未有利用TaqMan 實(shí)時(shí)熒光PCR方法對可可花癭病菌進(jìn)行檢測的報(bào)道。本研究中,我們對可可花癭病菌及其近似種的EF1α基因序列進(jìn)行了比較分析,設(shè)計(jì)了1對特異性引物和1條探針,建立了可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法,以期為口岸檢疫和該病菌防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用菌株共計(jì)34株,包括7株可可花癭病菌,其中5株由本實(shí)驗(yàn)室從日本進(jìn)境羅漢松上分離鑒定獲得[8],2株來源于福州海關(guān)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室,以及一些其他種屬植物真菌27株(表1)。以上菌株均保存于盛有無菌水的凍存管中(4℃)備用。

表1 供試菌株信息1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.2 試劑和儀器

TaqMan?Universal PCR Master Mix 購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司、TANbead?Plant DNA Auto Kit購自臺灣奈米技術(shù)開發(fā)有限公司、全自動核酸提取儀Kingfisher mL(美國Thermo Fisher)、實(shí)時(shí)熒光PCR儀ABI Prism 7900(美國ABI)、超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000C(美國Thermo Fisher)、生化培養(yǎng)箱Friocell 222(德國3M公司)。

1.3 DNA提取

用滅菌槍頭刮取在PDA平板上培養(yǎng)2周左右的菌絲,按照TANBead?Plant DNA Auto Kit說明書提取DNA,DNA經(jīng)過濃度檢測后保存于-20℃冰箱備用。

1.4 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的可可花癭病菌EF1α基因(登錄號:KJ648617)的保守區(qū)域,利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對分析,應(yīng)用軟件 Primer Express 3.0設(shè)計(jì)正向引物NR-F(5′-GAGCGACGTTGGCACAATG-3′),反向引物NR-R(5′-GGTTCGGAACACGTGACGAT-3′),探針NR-P(5′-CCTGGCCCCTGCAC-3′),擴(kuò)增目的片段大小為 78 bp(圖1)。探針5′端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán),3′端標(biāo)記非熒光猝滅基團(tuán)和MGB。上述引物和探針由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

圖1 可可花癭病菌及其近似種EF1α序列比對Fig.1 EF1α sequence comparison among Albonectria rigidiuscula and closely related species

1.5 特異性試驗(yàn)

以表1中供試菌株DNA為模板,無菌水為空白對照,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),在20 μL反應(yīng)體系中加入10 μL 2×TaqMan?Universal PCR Master Mix,0.5 μL引物NR-F(10 μmol/L),0.5 μL引物NR-R(10 μmol/L),0.5 μL探針NR-P(10 μmol/L),1 μL DNA,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為:50℃ 2 min;95℃ 10 min;然后95℃ 15 s,60℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.6.1引物濃度優(yōu)化

以AR1 菌株DNA為模板,參照1.5中反應(yīng)體系,其他成分保持不變,將NR-F/NR-R正反向引物濃度設(shè)置為0.1 μmol/L至1.0 μmol/L,以0.1 μmol/L遞增。

1.6.2探針濃度優(yōu)化

以AR1 菌株DNA為模板,參照1.5中反應(yīng)體系,其他成分保持不變,選用1.6.1中優(yōu)化后的NR-F/NR-R引物濃度,將NR-P探針濃度設(shè)置為0.1 μmol/L 至1.0 μmol/L,以0.1 μmol/L遞增。

1.7 靈敏度試驗(yàn)

為確定可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測限度,將AR1 菌株的DNA用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋,共7個(gè)梯度,每個(gè)梯度做3次重復(fù)。在20 μL反應(yīng)體系中,DNA含量分別為0.01 pg、0.1 pg、1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng,利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng),測定靈敏度并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

以AR1 菌株DNA為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),在同一個(gè)試驗(yàn)中,每個(gè)濃度重復(fù)3次,分析組內(nèi)差異;在不同時(shí)間段進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn),進(jìn)行組間差異分析。根據(jù)獲得的Ct值計(jì)算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation, SD)和變異系數(shù)(coefficient of variation, CV),來評價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.9 接種試驗(yàn)及接種樣品的檢測

選用健康的羅漢松幼苗,參照段維軍等[8]的方法進(jìn)行接種試驗(yàn)。取PDA平板上培養(yǎng)好的AR1菌株的菌絲塊接種到幼苗傷口上,共接種3個(gè)幼芽,分別編號為S1、S2、S3,作為試驗(yàn)組;取無菌的PDA培養(yǎng)基塊接種1個(gè)幼芽,編號為S0,作為對照組。接種后的幼苗在25℃條件下進(jìn)行隔離培養(yǎng),2周后提取試驗(yàn)組和對照組幼芽處DNA進(jìn)行檢測,以AR1菌株DNA為陽性對照,DP1菌株DNA為陰性對照,H2O為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性分析

對表1所列34個(gè)供試菌株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,結(jié)果顯示,7株可可花癭病菌均為陽性,有明顯的擴(kuò)增曲線生成,而其他27個(gè)供試菌株均為陰性,表明本研究設(shè)計(jì)的NR-F/NR-R引物和NR-P探針具有較強(qiáng)的特異性(圖2)。

圖2 可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性擴(kuò)增試驗(yàn)Fig.2 Specific amplification of the real-time fluorescence PCR assay for Albonectria rigidiuscula

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

2.2.1引物濃度優(yōu)化

由圖3可知,當(dāng)引物濃度為0.2 μmol/L時(shí),ΔRn值最大、Ct值最小。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)后,最終確定0.2 μmol/L為最佳引物濃度。

圖3 NR-F/NR-R引物濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of NR-F/NR-R primer concentration

2.2.2探針濃度優(yōu)化

由圖4可知,當(dāng)探針濃度為0.6 μmol/L時(shí),ΔRn值最大、Ct值最小。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)后,最終確定0.6 μmol/L為最佳探針濃度。

圖4 NR-R探針濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of NR-R probe concentration

2.2.3優(yōu)化后的反應(yīng)體系

通過引物濃度和探針濃度優(yōu)化試驗(yàn),確定實(shí)時(shí)熒光PCR的最佳反應(yīng)體系,即20 μL反應(yīng)體系中加入10 μL 2×TaqMan?Universal PCR Master Mix,0.4 μL NR-F引物(10 μmol/L),0.4 μL NR-R引物(10 μmol/L),1.2 μL NR-P探針(10 μmol/L),1 μL DNA,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

2.3 靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

對不同濃度DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,結(jié)果顯示當(dāng)可可花癭病菌DNA含量為1 pg時(shí),3次重復(fù)試驗(yàn)中只有一條擴(kuò)增曲線,且熒光信號很弱,Ct值大于36;而DNA含量為10 pg時(shí),有明顯的擴(kuò)增曲線,說明本研究所建立的可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的最低檢測限是10 pg(圖5)。

圖5 可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度檢測Fig.5 Relative sensitivity of the real-time fluorescence PCR assays for Albonectria rigidiuscula

通過對已知濃度的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn),DNA含量越高,Ct值越小,即DNA含量與可檢測到的熒光信號的循環(huán)數(shù)呈負(fù)相關(guān),標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.99x+23.97(R2=0.993 4)(圖6)。

圖6 可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of the real-time fluorescence PCR assays for Albonectria rigidiuscula

2.4 重復(fù)性分析

以AR1菌株4個(gè)濃度的DNA(0.01、0.1、1、10 ng)進(jìn)行3次組內(nèi)及3次組間重復(fù)測定。從表2可知,組內(nèi)重復(fù)CV值在0.35%～0.83%之間,組間重復(fù)CV值在0.21%～0.90%之間,二者的CV值均小于1%,說明本研究所建立的可可花癭病菌TaqMan MGB熒光PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.5 接種樣品檢測結(jié)果

對試驗(yàn)組和對照組樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測,結(jié)果顯示試驗(yàn)組樣品S1、S2、S3 及陽性對照AR1的DNA擴(kuò)增后有明顯的擴(kuò)增曲線生成,而對照組樣品S0、陰性對照DP1及空白對照H2O均無擴(kuò)增(圖7)。以上結(jié)果表明該方法能快速、準(zhǔn)確檢出可可花癭病菌。

表2 可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

圖7 接種樣品的可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果Fig.7 Detection of Albonectria rigidiuscula by real-time fluorescence PCR assays from inoculated samples

3 討論

可可花癭病菌是一種重要的檢疫性真菌,該病菌寄主種類較多,能夠引起植物花序枯萎和維管束壞死,在花芽、莖基和枝條等侵染部位可形成癌腫,造成植物萎蔫、畸形或頂枯[5, 7, 16]。種苗、水果、糧谷等植物產(chǎn)品是植物病害遠(yuǎn)距離傳播的重要載體,是病害初次侵染的重要來源。目前,全球范圍內(nèi)由可可花癭病菌在不同地理區(qū)域不同寄主上造成的植物病害種類在不斷增加,為避免該病菌在我國傳播擴(kuò)散,亟須建立特異、準(zhǔn)確的檢測方法,以滿足口岸快速檢測的需求,防止攜帶該病菌的植物產(chǎn)品的傳入。

目前,我國口岸已多次截獲可可花癭病菌,2013年寧波口岸首次從日本進(jìn)境羅漢松種苗上截獲該病菌[8];2017年重慶口岸從越南的番荔枝上截獲該病菌;2021年福建口岸從臺灣的番荔枝上也截獲該病菌[17]。其截獲率不高的原因可能在于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測效率較低、靈敏度不夠等。國內(nèi)外現(xiàn)有關(guān)于可可花癭病菌的研究主要集中在新病害發(fā)現(xiàn)報(bào)道、檢疫鑒定和防控等方面[5-7, 10, 16, 18],但未有該病菌的快速檢測技術(shù)研究的相關(guān)報(bào)道。結(jié)合早期研究我們發(fā)現(xiàn),EF1α基因序列能夠準(zhǔn)確鑒定可可花癭病菌[5, 8, 10, 19]。本研究在收集了可可花癭病菌及其近似種的基礎(chǔ)上,根據(jù)它們的EF1α序列差異設(shè)計(jì)特異性引物和探針,建立了該病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。研究結(jié)果表明,該方法能有效地?cái)U(kuò)增可可花癭病菌目的基因(EF1α)片段,具有良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性;同時(shí)該方法具有實(shí)用性,可用于疑似攜帶可可花癭病菌樣品的檢測與初篩。另外,根據(jù)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果,確定了在20 μL反應(yīng)體系中,該方法能夠檢測到可可花癭病菌的最低DNA含量為10 pg。段麗君等[20]建立了杜鵑花枯萎病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法,10 μL反應(yīng)體系中能夠檢出該病菌的最低DNA含量為0.25 pg;段維軍等[21]建立了向日葵黑莖病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法,20 μL反應(yīng)體系中能夠檢出該病菌的最低DNA含量為0.1 pg,以上2種檢測方法的靈敏度均較高,原因在于它們的特異性引物和探針是根據(jù)ITS基因序列設(shè)計(jì)的,而ITS基因在整個(gè)基因組DNA中串聯(lián)重復(fù),含量較高。本文建立的檢測方法靈敏度相對較低,可能原因是EF1α基因在基因組中含量較低所致。盡管本文所建立的可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法靈敏度較低,但在實(shí)際檢測工作中可滿足使用需求?？煽苫ò`病菌已在口岸多次檢出[8, 17],該方法能夠解決可可花癭病菌以往檢測方法中存在的不足之處,縮短檢測周期,建議盡快修訂《可可花癭病菌檢疫鑒定方法》(SN/T 3284-2012)標(biāo)準(zhǔn),增加分子生物學(xué)檢測方法,以提高該病菌檢出率。