種子種苗上黃瓜綠斑駁花葉病毒IC-RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

任春梅, 楊 柳, 繆 倩, 陸 芳, 季英華, 程兆榜

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 南京 210014)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)屬于帚狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus,主要侵染葫蘆科作物,造成葉片斑駁、褪綠和畸形等癥狀。目前,CGMMV已在全球近20多個(gè)國家被發(fā)現(xiàn)[1-3],我國自2005年遼寧省蓋州市大田暴發(fā)西瓜CGMMV病[4]以來,廣西、廣東、遼寧、山東、湖北、湖南、云南、河南、甘肅和上海等地相繼報(bào)道了黃瓜綠斑駁花葉病的發(fā)生[5-6]。2012年以來,本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)幾年對江蘇葫蘆科作物上CGMMV的調(diào)查結(jié)果也顯示,CGMMV已在江蘇定殖,在蘇南、蘇中和蘇北的20余個(gè)縣/市/區(qū)均有分布[7],表明CGMMV病害在我國已呈蔓延勢態(tài),對我國葫蘆科作物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害和經(jīng)濟(jì)損失。

黃瓜綠斑駁花葉病是我國重要的檢疫性病害,引起了檢疫部門的重視[8]。其病毒具有高危害性、流行性和難防治等特點(diǎn),所以對于該病害主要采取源頭控制為主的綜合防治措施。種子傳播被認(rèn)為是CGMMV流行的主要來源,所以種子上病毒的檢測尤為重要[9]。此外農(nóng)事操作是關(guān)鍵傳播途徑,“檢、消、撲、治”是可行的防治措施。其中在嫁接苗生產(chǎn)中短期內(nèi)農(nóng)事操作多、時(shí)間發(fā)生早,有利于病毒的傳播,常導(dǎo)致后期病害的嚴(yán)重發(fā)生,對嫁接苗在定植前進(jìn)行早期診斷和預(yù)警是病害防控的關(guān)鍵措施。

該病毒的檢測歷經(jīng)了幾個(gè)重要的階段:傳統(tǒng)生物學(xué)、免疫化學(xué)和核酸分子檢測。早期的生物學(xué)測定方法主要在研究病毒的株系[10]、寄主[11]、癥狀[12]等上起重要作用,因其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性不高逐漸被舍棄;血清學(xué)方法基于多克隆抗體建立了Dot-ELISA法[13],基于單克隆抗體建立了ACP-ELISA和TAS-ELISA法[14],該方法操作簡單,適合大批量樣本的檢測,但是檢測的靈敏度有限,具有一定的局限性。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,分子生物學(xué)檢測技術(shù)逐漸成熟,不僅有常規(guī)的RT-PCR[15],更有MNP-RT-PCR[16]、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[17]、RPA[18]等,這些方法的檢測靈敏度和特異性較高,但檢測的試劑較為昂貴,對檢測的專業(yè)要求較高,不適合大樣本量檢測。而延伸發(fā)展出的芯片[19]、熒光原位雜交[20]等檢測技術(shù)的專業(yè)要求更高,更不適合推廣應(yīng)用。

綜上所述,亟待開發(fā)出一種擁有較高靈敏度,操作簡便,適合大樣本量檢測,能夠?qū)GMMV進(jìn)行早期檢測與診斷的方法。由于葫蘆科植物種子一般具有較為堅(jiān)硬的外殼不便研磨，種子中富含多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，提取的RNA質(zhì)量不高，而種苗中病毒含量低,本試驗(yàn)在嘗試了多種檢測方法的基礎(chǔ)上,最終利用自制的CGMMV單克隆抗體,結(jié)合優(yōu)化的PCR方法,確定了IC-RT-PCR為CGMMV早期檢測的最佳方法。該方法的檢測靈敏度與RT-PCR相當(dāng),簡便度與DAS-ELISA相當(dāng),彌補(bǔ)了RT-PCR操作復(fù)雜和DAS-ELISA靈敏度不高的問題,操作簡便,結(jié)果可靠,具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CGMMV來源于江蘇南通發(fā)病西瓜病葉,經(jīng)RT-PCR檢測為CGMMV陽性,并在葫蘆(品種名稱:‘親抗水瓜’)上接種繁殖,病葉表現(xiàn)為花葉、斑駁、脈綠,樣品保存于-70℃冰箱中。CGMMV帶毒種子由本研究室在接毒葫蘆上由病瓜上收集,血清學(xué)檢測后-70℃冰箱中保存。對照樣品為健康葫蘆上采集葉片和收集的種子。

CGMMV單克隆抗體及HRP標(biāo)記的二抗由上海佑隆生物科技有限公司制備,總RNA提取試劑盒購自Biouniquer公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和RNase抑制劑購自Fermentas公司,Taq酶購自TaKaRa公司,其余國產(chǎn)分析純試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 DAS-ELISA法的建立及靈敏度分析

1.2.1DAS-ELISA法檢測種子中的CGMMV

應(yīng)用DAS-ELISA法對江蘇高郵收集的葫蘆種子帶毒率進(jìn)行檢測。具體試驗(yàn)參考楊柳等[21]的方法,取約0.1 g葫蘆種子置于1.5 mL離心管中,加入1 mL自來水于4℃冰箱浸泡過夜,制備樣品液。用5%的碳酸鹽包被緩沖液以300倍的比例稀釋CGMMV單克隆抗體,酶標(biāo)板每孔加入100 μL的CGMMV單克隆抗體包被,用錫箔紙包裹置于4℃孵育過夜或37℃反應(yīng)2 h。單克隆抗體包被結(jié)束后,倒出剩余液,每孔加入100 μL沖洗緩沖液沖洗3次。然后每孔加入事先處理好的樣品100 μL,設(shè)置葫蘆帶毒種子和病葉為陽性對照、不帶毒種子和健康葉片為陰性對照,用錫箔紙包裹37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,倒出剩余樣品,每孔加入100 μL沖洗緩沖液沖洗3～5次?？贵w稀釋緩沖液以300倍比例稀釋酶標(biāo)二抗,每孔加入100 μL的酶標(biāo)二抗,錫箔紙包裹37℃反應(yīng)2 h。再倒出剩余液,每孔加入100 μL沖洗緩沖液沖洗3～5次。最后每孔加入100 μL底物顯色液,酶標(biāo)板用錫箔紙包裹,置于37℃下孵育1 h。顯色后在酶標(biāo)儀中測定OD450,測出陰性對照的值N,若樣品OD值P≥2N,則視為陽性,否則為陰性。

1.2.2DAS-ELISA靈敏度分析

按照1.2.1的方法和質(zhì)量體積比浸泡種子,取處理過的帶毒樣品、無毒樣品浸泡液分別稀釋25、50、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600倍進(jìn)行DAS-ELISA檢測,以清水為空白對照，用酶標(biāo)儀測定OD450,計(jì)算其檢測靈敏度。

1.3 RT-PCR法的建立及靈敏度分析

1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上登錄的黃瓜綠斑駁花葉病毒相對保守基因序列 (CGMMV-cp基因,登錄號:DQ217778),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CGMMV的特異性引物,上游引物:5′-ATGGCTTACAATCCGATCAC-3′,下游引物:5′-TGGGCCCCTACCCGGGGAAAAG-3′,擴(kuò)增片段長度約為700 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2RT-PCR法檢測種子中的CGMMV

根據(jù)TaKaRa公司RNA提取試劑盒的說明書提取0.1 g葫蘆種子總RNA,用20 μL DEPC水溶解。取1 μL RNA為模板,Oligo (dT)18為引物,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈。以1 μL cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL擴(kuò)增體系:2×PCR Master Mix (With Dye) 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA 1 μL,DEPC水11.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性50 s,53℃退火50 s,72℃延伸1 min,循環(huán)30次;72℃延伸10 min。4℃保存?zhèn)溆?。? μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,25 min,TAE緩沖液)，核酸染料染色15 min,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.3.3RT-PCR靈敏度分析

按1.3.2方法提取0.1 g葫蘆種子總RNA,用20 μL DEPC水溶解。將RNA按10倍(101～109)梯度稀釋,取1 μL RNA為模板進(jìn)行20 μL體系反轉(zhuǎn)錄,再取1 μL cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測RT-PCR方法的靈敏度。

1.4 IC-RT-PCR法的建立及靈敏度分析

1.4.1IC-RT-PCR法檢測種子和葉片中的CGMMV

分別取0.1 g葫蘆種子和葉片,液氮研磨后加入1 mL碳酸鹽包被緩沖液,4℃冰箱過夜。用5%的碳酸鹽包被緩沖液以300倍的比例稀釋CGMMV單克隆抗體,用CGMMV單克隆抗體包被PCR管,每管50 μL,4℃孵育過夜或37℃反應(yīng)3 h。用0.01 mol/L PBST沖洗緩沖液洗滌3～4次后,分別加入50 μL事先處理好的樣品、陰性對照或空白對照,37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)過后吸去樣品液,再用沖洗緩沖液洗滌3次后用無菌去離子水洗1次,吸盡管底余液后直接在包被了樣品的PCR管中進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR方法、體系及程序同1.3.2。

1.4.2IC-RT-PCR法抗體工作濃度的確定

對CGMMV單克隆抗體以300、400、500倍比例稀釋,分別取50 μL包被PCR管,再分別取檢測過的種子和葉片樣品陽性各3個(gè)和陰性各1個(gè),進(jìn)行IC-RT-PCR并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,確定抗體使用的最佳工作濃度。

1.4.3IC-RT-PCR靈敏度分析

0.1 g/mL葫蘆種子陽性樣品液,分別稀釋50、100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600倍后取50 μL進(jìn)行IC-RT-PCR,檢測IC-RT-PCR的靈敏度。

1.5 IC-RT-PCR檢測生產(chǎn)中所用的種子

取江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所委托鑒定的西瓜種子‘蘇夢5號’進(jìn)行檢測。按1.4.1的方法處理0.1 g 西瓜種子，分別以陽性和陰性種子的樣品液為對照。用1.4.2確定的最適抗體工作濃度進(jìn)行IC-RT-PCR方法檢測,測定這批西瓜種子的帶毒率。

1.6 IC-RT-PCR檢測種苗

在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地對葫蘆、南瓜、黃瓜、西葫蘆、西瓜和甜瓜等6種葫蘆科作物接毒,采收種子經(jīng)DAS-ELISA檢測帶毒率為100%。分別取上述6種葫蘆科作物種子各4粒,在穴盤中常規(guī)育苗,待長至發(fā)芽期、兩葉一心期、2～3片真葉期、伸蔓期各取其葉片0.1 g用已確定的最適抗體工作濃度的IC-RT-PCR方法檢測,確定苗期可檢測到病毒的最早時(shí)期。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測種子中的CGMMV

應(yīng)用DAS-ELISA法對江蘇高郵收集的葫蘆種子帶毒率進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1所示,根據(jù)酶標(biāo)儀檢測OD450,檢測的91粒種子中,有25粒種子檢測結(jié)果顯示OD450≥2N,為陽性,帶毒率為27.47%。

圖1 葫蘆種子上CGMMV的DAS-ELISA檢測結(jié)果Fig.1 Detection of CGMMV in Lagenaria siceraria seeds by DAS-ELISA

2.2 DAS-ELISA檢測靈敏度

對DAS-ELISA的檢測靈敏度進(jìn)行分析,圖2a可見,隨著種子浸泡液稀釋倍數(shù)增大,檢測孔顏色逐漸減弱,結(jié)合檢測數(shù)據(jù)結(jié)果(圖2b),發(fā)現(xiàn)在稀釋1 000倍時(shí)與陰性對照的OD450比值仍大于2,所以確定DAS-ELISA檢測靈敏度為種子浸泡液稀釋1 000倍,所以檢測的種子量為:0.1 g/(1 000×10)=10 μg(0.1 g表示檢測種子重量;1 000為稀釋1 000 倍;10表示取1 mL中的100 μL,即1/10檢測量),相當(dāng)于從10 μg的種子上可檢測到病毒。

圖2 DAS-ELISA檢測種子上CGMMV的靈敏度分析Fig.2 Sensitivity analysis of DAS-ELISA for detecting CGMMV in seeds

2.3 RT-PCR檢測種子中的CGMMV

將2.1中檢測的葫蘆種子應(yīng)用RT-PCR方法再檢測一次,樣品順序一一對應(yīng),部分結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)除原有檢出樣品均檢出條帶外,還有一些血清學(xué)未顯示陽性的樣品擴(kuò)增出特異性條帶,檢測的91粒種子中,有30粒種子為陽性,帶毒率為32.97%。說明RT-PCR檢測靈敏度高于DAS-ELISA。

圖3 葫蘆種子上CGMMV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of CGMMV in Lagenaria siceraria seeds by RT-PCR

2.4 RT-PCR檢測靈敏度

提取0.1 g葫蘆種子總RNA,以10倍梯度進(jìn)行稀釋,圖4顯示,隨稀釋倍數(shù)的增加條帶逐漸減弱,至稀釋107時(shí)條帶消失,所以檢測的種子量為:0.1 g/(20×20×106)=25 ng(0.1 g表示檢測種子重量;20表示取1/20 μL的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;另一個(gè)20表示1/20 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR;106為稀釋倍數(shù)),相當(dāng)于從25 ng的種子上可檢測到病毒。所以RT-PCR法的靈敏度大大高于DAS-ELISA。

圖4 RT-PCR檢測種子上CGMMV靈敏度分析Fig.4 Sensitivity analysis of RT-PCR for detecting CGMMV in seeds

2.5 IC-RT-PCR檢測種子和葉片中的CGMMV

取2.1中檢測的葫蘆種子,另取一些葫蘆葉片應(yīng)用IC-RT-PCR方法檢測,部分檢測結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明,葫蘆種子的檢測結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果一致,檢出帶毒率也為32.97%。說明IC-RT-PCR檢測靈敏度與RT-PCR相當(dāng),高于DAS-ELISA。

2.6 IC-RT-PCR法中抗體工作濃度的確定

為確定IC-RT-PCR法中CGMMV單克隆抗體使用的最佳工作濃度,測定了不同倍數(shù)稀釋抗體的檢測效果,結(jié)果(圖6)表明,抗體稀釋300倍時(shí)檢測效果最佳,所以確定IC-RT-PCR法中抗體以300倍稀釋使用。

圖6 不同抗體濃度IC-RT-PCR法檢測葫蘆種子和葉片上CGMMV的結(jié)果Fig.6 Detection of CGMMV in Lagenaria siceraria seeds and leaves by IC-RT-PCR with different antibody concentrations

2.7 IC-RT-PCR檢測靈敏度

對葫蘆種子浸泡液直接稀釋,采用IC-RT-PCR檢測不同稀釋倍數(shù)的樣品液中病毒結(jié)果(圖7)表明, 0.1 g/mL種子在稀釋12 800倍后仍能檢測到病毒,檢測的種子量為:0.1 g/(20×20×12 800)=20 ng(0.1 g表示檢測種子重量;20表示取1/20 μL的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;另一個(gè)20表示取1/20 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR;12 800為稀釋倍數(shù)),相當(dāng)于從20 ng的種子上可檢測到病毒。所以IC-RT-PCR法與RT-PCR法的靈敏度相當(dāng),都大大高于DAS-ELISA。

圖7 IC-RT-PCR檢測種子上CGMMV靈敏度分析Fig.7 Sensitivity analysis of IC-RT-PCR for detecting CGMMV in seeds

2.8 IC-RT-PCR檢測種子中的CGMMV

用建立的IC-RT-PCR法檢測江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供的西瓜種子(‘蘇夢5號’),部分電泳結(jié)果如圖8所示,92粒西瓜種子中有8粒帶毒,帶毒率為8.70%,與RT-PCR檢測結(jié)果相同,檢出帶毒的種子也完全對應(yīng),證明該方法較為靈敏、準(zhǔn)確,但操作上較RT-PCR法要簡便許多,所以適合樣本量大、要求高的種子上的CGMMV檢測。

圖8 IC-RT-PCR檢測西瓜種子中CGMMV的結(jié)果Fig.8 Detection results of CGMMV in Citrullus lanatus seeds by IC-RT-PCR

2.9 IC-RT-PCR檢測種苗上的CGMMV

用建立的IC-RT-PCR法檢測葫蘆、南瓜、黃瓜、西葫蘆、西瓜和甜瓜種苗上的病毒,分別測定發(fā)芽期、兩葉一心期、2～3片真葉期、伸蔓期的葉片,電泳結(jié)果如圖9所示,可見發(fā)芽期各種瓜類均未檢測到CGMMV(圖9a);兩葉一心期的葫蘆上有2株陽性,南瓜和黃瓜中分別有1株陽性(圖9b); 2～3片真葉期的葫蘆和南瓜的檢測結(jié)果同兩葉一心期,此外黃瓜中檢出2株陽性,西葫蘆和西瓜分別檢出1株陽性,甜瓜也檢出1株陽性(條帶較弱)(圖9c);伸蔓期的檢測結(jié)果顯示甜瓜樣品確實(shí)是陽性,其他結(jié)果和2～3片真葉期的檢測結(jié)果完全一致(圖9d)。以上結(jié)果說明可檢測出病毒的最早時(shí)期在2～3片真葉期,這為種苗的早期篩查工作提供了可靠便捷的方法,可保證種苗公司種苗的安全生產(chǎn)。

圖9 IC-RT-PCR檢測種苗中CGMMV的結(jié)果Fig.9 Detection results of CGMMV in seedlings by IC-RT-PCR

3 結(jié)論與討論

黃瓜綠斑駁花葉病毒是葫蘆科作物上可種傳的重要病毒之一,其發(fā)生常導(dǎo)致毀滅性損失,據(jù)統(tǒng)計(jì),一旦感染CGMMV輕則造成15%～30%的減產(chǎn),重則減產(chǎn)超過50%,甚至絕收,嚴(yán)重影響瓜類作物的安全生產(chǎn)[22]。CGMMV具有種子帶毒傳播、病毒穩(wěn)定性強(qiáng)、可侵染多種瓜類作物等特性,一旦侵入常連片多點(diǎn)嚴(yán)重發(fā)生,并在當(dāng)?shù)囟ㄖ澈蠛茈y根除,對瓜類作物的生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅,尤其是對我國多地推行的高效設(shè)施瓜類作物栽培造成重大影響。監(jiān)測和檢疫是防控CGMMV的重要措施,對CGMMV實(shí)行強(qiáng)制檢疫和長期監(jiān)測將是未來一段時(shí)間內(nèi)我國瓜類作物生產(chǎn)上的重要工作。

目前CGMMV已在全國二十多個(gè)省市均有分布,據(jù)田間實(shí)地調(diào)查,因當(dāng)?shù)剞r(nóng)技人員不熟悉此病或病害發(fā)生較輕等原因出現(xiàn)漏報(bào)、漏檢的現(xiàn)象,實(shí)際分布范圍更廣。因此,精準(zhǔn)、靈敏、便捷的檢測方法十分重要。前期我們通過免疫小鼠制備了一株特異性較強(qiáng)的單克隆抗體,并創(chuàng)制了DAS-ELISA試劑盒[21],可實(shí)現(xiàn)對CGMMV的初步診斷。但是在進(jìn)行種子和種苗的檢測過程中,我們發(fā)現(xiàn)由于病毒含量低,常常存在漏檢的現(xiàn)象,這就需要更加靈敏的檢測方法。RT-PCR法靈敏度高于DAS-ELISA法,可實(shí)現(xiàn)低含量病毒的檢測,但是RT-PCR法對操作人員的要求比較高,且由于種子中富含多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì),提取的RNA質(zhì)量不高又不穩(wěn)定,對于大批量種子和種苗的檢測不太現(xiàn)實(shí)。綜合考慮基于抗血清的ELISA和特定序列引物的RT-PCR法,結(jié)合形成了IC-RT-PCR方法,該方法既省卻了普通RT-PCR檢測中需提取RNA的麻煩,又通過特定抗體增加了檢測結(jié)果的特異性和可靠性,同時(shí)與普通ELISA方法相比利用PCR擴(kuò)增增加了檢測的靈敏度。本研究結(jié)果顯示,在確定了最佳抗體工作濃度的基礎(chǔ)上,IC-RT-PCR法與RT-PCR法的靈敏度相當(dāng),可檢出20～25 ng種子上的病毒,而DAS-ELISA法只可檢出10 μg種子上的病毒;IC-RT-PCR法的特異性與RT-PCR法一致,操作上與DAS-ELISA法一樣簡便,所以對于樣本量大、前期處理復(fù)雜、病毒含量又低的樣品來說,采用操作簡便、靈敏度高的IC-RT-PCR法檢測是比較合適的。

江蘇是農(nóng)業(yè)大省,近年來設(shè)施農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展,據(jù)統(tǒng)計(jì)近幾年江蘇西、甜瓜種植面積達(dá)13.3萬hm2次,已經(jīng)形成規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化。因此研發(fā)一項(xiàng)符合科學(xué)客觀的黃瓜綠斑駁花葉病毒的早期檢測技術(shù),反映當(dāng)前該病害研究和防控的發(fā)展水平,對貫徹檢疫為先的黃瓜綠斑駁花葉病毒的綜合治理策略,保障江蘇省西、甜瓜等瓜類作物的安全生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。關(guān)于CGMMV的檢測技術(shù),尚海麗等[13]、宋西嬌等[23]、蔣慶琳等[24]、 Chen等[17]、Jiao等[18]從血清學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面做了研究,但是技術(shù)的應(yīng)用性等有待驗(yàn)證。本研究是在總結(jié)了已有檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合病毒傳播特點(diǎn)研發(fā)的早期檢測技術(shù),應(yīng)用結(jié)果證明該法種子檢測結(jié)果與RT-PCR法結(jié)果一致,種苗在基本無癥狀的2～3片真葉期可檢出病毒,該項(xiàng)技術(shù)已實(shí)施應(yīng)用于山東、安徽、江蘇等幾個(gè)大型種苗育種基地和科研部門。因此,種苗企業(yè)進(jìn)行健康無毒瓜苗生產(chǎn)時(shí)利用該技術(shù)對黃瓜綠斑駁花葉病毒進(jìn)行早期檢測,可避免無癥帶毒瓜苗流入市場及其可能帶來的后續(xù)相關(guān)糾紛和賠償風(fēng)險(xiǎn),從種苗開始實(shí)施源頭控制黃瓜綠斑駁花葉病毒的發(fā)生,對病害防控起到了關(guān)鍵作用,從而有效指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用。