八角炭疽病生防菌株篩選及發(fā)酵條件研究

劉連金, 李正令, 李雪理, 李興田, 侯 青,楊友聯(lián), 廖旺姣, 嚴(yán) 凱,*, 張曉勇,*

(1. 六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 六盤水 553004; 2. 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530022)

八角IlliciumverumHook. f.是著名的調(diào)味和藥用植物。炭疽病是八角樹在高溫季節(jié)發(fā)生最普遍、最嚴(yán)重的病害之一,尤其在人工種植或自然生長的八角植株上分布廣泛。該病害多始發(fā)于葉尖和葉緣,并逐漸擴(kuò)展成圓形或不規(guī)則形的水漬狀病斑,后期病斑干枯呈棕色，常引起落葉,嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量。據(jù)前人報(bào)道八角炭疽病病原菌主要有球炭疽菌Colletotrichumcoccodes[1]、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[2]和哈銳炭疽菌C.horii[3]。

近年來,生產(chǎn)上對(duì)八角炭疽病的防治主要采取化學(xué)藥劑。苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、氟硅唑和腈菌唑等對(duì)八角炭疽病防治效果較為理想,但長期施用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)提高病原抗性[4],同時(shí)還帶來了食品安全和生態(tài)環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。高效生防菌劑的研發(fā)和推廣應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)八角病害綠色防控最重要的途徑之一。相比傳統(tǒng)防治方法,生防菌具有抑菌效果好、成本低、抗菌譜廣和安全性高等優(yōu)勢,開發(fā)潛力巨大。生防菌可通過合成、分泌抑菌活性物質(zhì),競爭作用占領(lǐng)生態(tài)位,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等多種途徑發(fā)揮高效的生防功能[5-6]。

本研究以組織分離法從八角葉片中分離出拮抗菌株,并通過與哈銳炭疽菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)篩選出高效拮抗菌株,結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子學(xué)方法對(duì)拮抗菌株進(jìn)行鑒定,并對(duì)拮抗菌發(fā)酵濾液抑菌活性進(jìn)行檢測,以及采用離體葉片法測定拮抗菌對(duì)八角炭疽病的防治效果,再設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)菌株最佳發(fā)酵條件進(jìn)行研究,為八角炭疽病綠色防控研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 拮抗菌株的分離和篩選

采用組織分離法[7]分離健康八角葉片的內(nèi)生細(xì)菌菌株。選取健康八角葉片,自來水洗凈后將其剪成5 mm×5 mm的小塊,用75%乙醇快速消毒30 s,2%次氯酸鈉溶液消毒1 min,無菌水清洗5次,滅菌的濾紙吸干表面水珠后采用五點(diǎn)法接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,水1 000 mL,自然pH)平板,30℃培養(yǎng)48 h后用接種環(huán)挑取葉片周圍的細(xì)菌菌落,重復(fù)3次進(jìn)行平板劃線獲得單一菌株,所得菌株懸浮于30%甘油中并凍存于-20℃冰箱中備用。

指示菌八角炭疽病病原菌哈銳炭疽菌C.horii由廣西林業(yè)科學(xué)院廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廖旺姣等分離及鑒定[3]。所有供試菌株現(xiàn)保藏于六盤水師范學(xué)院基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

采用三點(diǎn)平板對(duì)峙法篩選哈銳炭疽菌的生防菌株。用6 mm無菌打孔器打取已活化的哈銳炭疽菌菌落邊緣菌餅接種于PDA平板的中央。在距離中央菌餅3 cm的上、左、右3個(gè)點(diǎn)分別用接種針蘸取微量內(nèi)生菌菌體進(jìn)行點(diǎn)接。25℃下培養(yǎng),待下側(cè)菌絲長至平板的邊緣時(shí)測量對(duì)峙側(cè)的菌落半徑(mm),并計(jì)算抑菌率,3次重復(fù)。抑菌率=(對(duì)照側(cè)菌落半徑-對(duì)峙側(cè)菌落半徑)/對(duì)照側(cè)菌落半徑×100%。

1.2 拮抗菌株的鑒定

挑取活性菌株進(jìn)行簡單染色和革蘭氏染色,并對(duì)芽胞進(jìn)行染色觀察[8]。提取培養(yǎng)48 h的活性菌株DNA,利用細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F/1492R)和DNA促旋酶B亞單位蛋白基因gyrB引物(UP-1S/UP-2Sr)分別對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9-10]。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序。所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì),并選擇已詮釋的模式菌株或可信度高的同源菌株的基因組序列,比較各菌株的16S rDNA 和gyrB序列,用MEGA 11軟件以極大似然法(maximum likelihood method, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。

1.3 拮抗菌株發(fā)酵濾液的抑菌效果測定

用無菌接種環(huán)挑取少量拮抗菌菌體接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,在32℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h得種子液。取100 μL種子液接入100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于32℃、180 r/min 下振蕩培養(yǎng)7 d,10 000 r/min離心10 min，吸取上清液,用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾2次制得無菌發(fā)酵濾液。向冷卻至50℃左右未凝固的PDA培養(yǎng)基中分別加入無菌發(fā)酵濾液,使其濃度為2.5%、5%、10%、15%和20%(V/V),充分搖勻后制成平板,以不加發(fā)酵濾液的PDA為對(duì)照。打取6 mm哈銳炭疽菌菌落邊緣菌餅接種于平板中央,26℃下培養(yǎng),待對(duì)照PDA平板中的菌絲長滿后以十字交叉法測量各處理的菌落直徑(mm),3次重復(fù)并計(jì)算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.4 拮抗菌株對(duì)八角炭疽病的離體防治效果測定

剪取健康無損傷、大小基本一致的成熟八角葉片,用流水洗凈表面塵土后用0.1%吐溫-80溶液清洗,再依次用75%乙醇和2% NaClO溶液擦拭表面進(jìn)行消毒,無菌水漂洗5次后用無菌吸水紙吸干表面水珠;用無菌針尖在八角葉片上距葉脈1 cm處分別打取4個(gè)約3 mm的微創(chuàng)口,再用無菌濕棉球包住葉柄后放置在培養(yǎng)皿內(nèi)備用。取100 μL拮抗菌種子液接入100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,在32℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d后用無菌水稀釋獲得OD600為0.6的菌懸液,再將該菌懸液用0.22 μm無菌微孔濾膜抽濾3次得無菌發(fā)酵濾液。設(shè)置6個(gè)處理(表1)來測定拮抗菌株發(fā)酵液對(duì)八角炭疽病的離體抑制效果和安全性。

表1 拮抗菌株對(duì)八角炭疽病離體抑制效果測定處理設(shè)置

每處理設(shè)置6次重復(fù),處理后置于25℃、自然光照條件下保濕培養(yǎng)。病原菌接種5 d后統(tǒng)計(jì)各處理葉片上病斑數(shù)量,并用十字交叉法測量各個(gè)病斑的平均直徑(D),最后計(jì)算病斑面積(mm2)和侵染抑制率(%)。病斑面積(mm2)=πD2/4,侵染抑制率=(對(duì)照組病斑面積-處理組病斑面積)/對(duì)照組病斑面積×100%。

1.5 活性菌株發(fā)酵條件研究

配制 KMB液體培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g,蛋白胨 20 g,MgSO41.5 g,K2HPO41.5 g,蒸餾水 1 000 mL)[11]作為基本液體培養(yǎng)基,改變其中的營養(yǎng)成分和外界環(huán)境等發(fā)酵條件,分別進(jìn)行菌株吸光度和拮抗特性的測定,用吸光度表示菌株生長情況,用抑菌圈大小表示菌株發(fā)酵液對(duì)哈銳炭疽菌的拮抗情況。

1)不同pH條件對(duì)菌株生長的影響。將基本液體培養(yǎng)基KMB的pH用1 mol/L HCl或NaOH分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9、10等7個(gè)梯度,分裝于300 mL錐形瓶中,每瓶150 mL,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。滅菌后均加入100 μL菌株種子液,在25℃、180 r/min振蕩72 h后吸取適量的菌懸液測定600 nm處吸光度(OD600)。吸取適量上述菌懸液用0.22 μm微孔濾膜抽濾3遍,制得無菌發(fā)酵濾液;在PDA平板的上、左、右距離邊緣10 mm處各放置一個(gè)滅菌牛津杯,取100 μL無菌發(fā)酵濾液加入牛津杯中,并將1塊 6 mm 哈銳炭疽菌菌餅接種于平板中央,以加100 μL無菌水作為空白對(duì)照,接種后在25℃、自然光照條件下培養(yǎng)7 d后測量牛津杯周圍抑菌圈直徑(mm)。設(shè)置3次重復(fù)。

2)不同溫度條件對(duì)菌株生長的影響。除設(shè)置不同溫度外，其余試驗(yàn)方法同1)。自然pH，培養(yǎng)溫度分別為15、20、25、30、32、35、37℃。

3)不同碳源條件對(duì)菌株生長的影響。將基本液體培養(yǎng)基KMB中的葡萄糖等質(zhì)量替換為甘油、蔗糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇等不同碳源,分裝于300 mL的錐形瓶中,每瓶150 mL,余下步驟與1)相同。

4)不同氮源對(duì)菌株生長的影響。將基本液體培養(yǎng)基KMB中的蛋白胨等質(zhì)量替換為硝酸鉀、硝酸鈉、酵母粉、(NH4)2SO4、尿素等不同氮源,分裝于300 mL的錐形瓶中,每瓶150 mL,余下步驟與1)相同。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS V7.05進(jìn)行LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離及篩選

從健康八角葉片內(nèi)分離到8株內(nèi)生細(xì)菌,與哈銳炭疽菌對(duì)峙培養(yǎng)中有3株抑制率達(dá)50%以上。其中編號(hào)為L0517的菌株抑菌率高達(dá)67.78%(圖1a～b)。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 拮抗菌株 L0517 對(duì)哈銳炭疽菌的拮抗效果及菌株形態(tài)特征Fig.1 The antagonism of strain L0517 against Colletotrichum horii and its morphological characteristics

2.2.2生理生化鑒定

在氮代謝上,菌株L0517的硝酸鹽還原、尿素、硝酸鉀、磷酸二氫銨代謝陽性。碳代謝上D-葡萄糖、D-木糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖發(fā)酵和淀粉水解呈陽性。其他特征性反應(yīng)中明膠液化、V-P試驗(yàn)、卵磷脂水解試驗(yàn)和過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性。甲基紅試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)性測試為陰性。具有芽胞桿菌屬細(xì)菌典型的生理生化反應(yīng)特征。

2.2.3分子生物學(xué)鑒定

將菌株L0517的16S rDNA和gyrB序列輸入GenBank的BLAST中進(jìn)行同源性比對(duì),下載20個(gè)詮釋菌株的兩個(gè)基因序列用MEGA 11軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株L0517與貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis、解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens和暹羅芽胞桿菌B.siamensis聚為一支,但B.amyloliquefaciens和B.siamensis獨(dú)立于B.velezensis分別獨(dú)立聚為一支,而L0517與B.velezensis無支長差異,結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征,將菌株L0517鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis。

圖2 基于 16S rDNA 和 gyrB 序列構(gòu)建的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Maximum likelihood phylogenetic tree inferred from combined 16S rDNA and gyrB sequences

2.3 拮抗菌株發(fā)酵濾液抑菌活性

哈銳炭疽菌菌絲生長顯著受到菌株L0517發(fā)酵濾液的影響(圖3,表2),其菌落隨著L0517發(fā)酵濾液添加量的增大而顯著減小。發(fā)酵濾液添加量為2.5%時(shí)菌落即顯著減小,菌絲開始出現(xiàn)不正常腫脹或囊泡狀結(jié)構(gòu)。而5%發(fā)酵濾液添加量接近對(duì)哈銳炭疽菌的抑制中濃度,當(dāng)發(fā)酵濾液添加量為10%、15%和20%時(shí),其菌絲生長抑制率分別達(dá)到74.67%、77.33%、83.67%。表明L0517菌株發(fā)酵濾液可有效抑制八角炭疽菌菌絲生長(圖3,表2)。

圖3 菌株L0517發(fā)酵濾液對(duì)哈銳炭疽菌抑制效果(a～f)及菌絲生長的影響(g～l)Fig.3 Effects of fermentation broth of strain L0517 on inhibition effect (a-f) and mycelial growth (g-l) of Colletotrichum horii

表2 菌株 L0517 發(fā)酵濾液對(duì)哈銳炭疽菌菌絲生長的影響1)

2.4 拮抗菌株對(duì)八角炭疽病的離體防治效果

離體條件下，拮抗菌L0517對(duì)八角炭疽病有顯著的預(yù)防效果(圖4,表3)。在含0.1%吐溫-80的葉片處理液中添加10%的L0517菌株發(fā)酵濾液和10%菌懸液(處理1和處理2),抑制率分別為82.5%和80.4%;僅用0.1%吐溫-80處理再接種病原菌的處理(處理4)的葉片其形成的病斑面積與對(duì)照(處理6)相比差異不顯著,說明L0517菌株發(fā)酵濾液和10%菌懸液都可顯著降低八角炭疽病病原菌的致病能力,對(duì)八角炭疽病表現(xiàn)出高效的預(yù)防作用。先接種病原菌,1 d后再用10% L0517發(fā)酵濾液處理葉片(處理5)后抑制率僅為4.2%,而且未能有效阻止病原菌在離體葉片傷口中擴(kuò)展,說明菌株L0517對(duì)八角炭疽病治療效果不佳,使用中應(yīng)重在發(fā)病前預(yù)防。菌株L0517菌懸液單獨(dú)處理傷口(處理3)未形成病斑,說明對(duì)八角葉片無致病性,安全性高。

表3 菌株 L0517對(duì)八角炭疽病的離體防治效果1)

圖4 菌株 L0517 對(duì)八角炭疽病的防治效果Fig.4 The control effect of strain L0517 against star anise anthracnose

2.5 拮抗菌株發(fā)酵條件對(duì)其生長和抑菌活性的影響

拮抗菌株 L0517在不同培養(yǎng)條件下的生長及其發(fā)酵濾液對(duì)哈銳炭疽菌抑菌活性的影響如圖5所示。菌株 L0517在pH為 6～7的營養(yǎng)液內(nèi)生長良好,在 pH 為7時(shí)菌株發(fā)酵濾液抑菌活性最強(qiáng)(圖5a)。菌株L0517的增殖和抑菌活性受培養(yǎng)溫度的影響,在25℃ 時(shí)最適其生長及抑菌物質(zhì)積累(圖5b)。不同碳源和氮源也對(duì)拮抗菌株 L0517的增殖和抑菌活性影響達(dá)到顯著水平。在 KMB培養(yǎng)基中,以麥芽糖作為碳源時(shí)菌株的OD600和抑菌圈最大,其次為蔗糖,甘露醇為碳源生長最差,甘油為碳源抑菌活性最弱(圖5c)。以酵母粉作為氮源時(shí),菌株L0517的增殖速率和抑菌活性都最高,其次是硫酸銨和硝酸鈉,以尿素為氮源時(shí)最差(圖5d)。說明拮抗菌株 L0517生長及積累抑菌成分的最適宜pH為7,最適發(fā)酵溫度為25℃,最適的碳源和氮源分別為麥芽糖和酵母粉。

3 結(jié)論與討論

貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis最早由Ruiz-García等于2005年從貝萊斯河(Vélez)中分離得到[12],其近緣種為死亡谷芽胞桿菌B.vallismortis和解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。3種細(xì)菌菌體大小、產(chǎn)芽胞方式和鞭毛分布都類似,難以區(qū)分,但在生理生化反應(yīng)如卵磷脂水解、明膠液化和吲哚測試上都與解淀粉芽胞桿菌和死亡谷芽胞桿菌存在顯著區(qū)別[12-14]。本研究表明，貝萊斯芽胞桿菌菌株L0517可高效抑制哈銳炭疽菌對(duì)八角葉片的侵染。貝萊斯芽胞桿菌抗菌譜較廣,對(duì)很多細(xì)菌性和真菌性病害如辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病[15]、水稻條斑病[16],魔芋軟腐病[17]、番茄灰霉病[18]、杧果炭疽病[19]和黃瓜葉斑病[20]等都具有很好的防治效果。大量研究證實(shí)貝萊斯芽胞桿菌對(duì)植物不具有致病性[21],并可用于食品工業(yè)發(fā)酵[22],對(duì)動(dòng)植物安全性高。同時(shí),貝萊斯芽胞桿菌還可促進(jìn)甜菜、胡蘿卜、黃瓜、馬鈴薯和番茄等植物幼苗的生長[23],在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域開發(fā)潛力巨大。

本研究中,貝萊斯芽胞桿菌菌株L0517的發(fā)酵濾液可高效抑制哈銳炭疽菌菌絲生長,并引起菌絲不正常腫脹,出現(xiàn)囊泡狀結(jié)構(gòu),與前人研究結(jié)果一致[18]。研究表明,貝萊斯芽胞桿菌可合成桿菌抗霉素D、伊枯草菌素A和表面活性素C等高效的脂肽類抑菌成分[19],其中桿菌抗霉素D能抑制真菌細(xì)胞壁前體物質(zhì)的合成,并能溶解細(xì)胞壁,導(dǎo)致菌絲細(xì)胞變形和破裂[24];伊枯草菌素和表面活性素可促使真菌形成小囊泡,破壞質(zhì)膜正常結(jié)構(gòu),加大質(zhì)膜透性和離子通道開放,導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)和大分子物質(zhì)流出而引起細(xì)胞死亡[25-26]。

圖5 不同pH、溫度、碳源、氮源對(duì)菌株 L0517 生長及抑菌活性的影響Fig.5 Effects of different pH, temperatures, carbon and nitrogen sources on the growth and antifungal activity of strain L0517

貝萊斯芽胞桿菌L0517對(duì)八角炭疽病病原菌具有高效的抑制效果,其發(fā)酵濾液中的抑菌活性物質(zhì)可高效阻擋病原菌侵入八角葉片,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。下一步要開展田間試驗(yàn),以探究菌株在自然條件下的抑菌效果及在八角葉片中的定殖能力。同時(shí)要基于菌株L0517基本發(fā)酵條件設(shè)計(jì)多因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,研究適于細(xì)胞快速增殖和抑菌物質(zhì)積累的發(fā)酵方案,以為菌株L0517的工業(yè)化運(yùn)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。