四川涼山苦蕎種子攜帶細菌多樣性

白凱紅, 阿別小兵, 陳 星, 蔣 娜, 李健強, 羅來鑫

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有害生物監(jiān)測與綠色管理重點實驗室, 種子病害檢驗與防控北京市重點實驗室, 北京 100193)

苦蕎Fagopyrumtataricum是蓼科Polygonaceae蕎麥屬Fagopyrum的一年生作物,其營養(yǎng)豐富,含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、碳水化合物、微量元素等[1-2],還可以提高人體免疫力[3-4]、抗衰老[5]等,享有“五谷之王”的美譽。四川省涼山地區(qū)是我國蕎麥起源中心之一,擁有全國乃至全世界最豐富的苦蕎資源,也是種類最多樣、種植最廣泛、分布最集中的地區(qū)[6-8]。作為當(dāng)?shù)氐闹饕Z食之一,涼山州的17個縣均有苦蕎種植,其中越西、昭覺、喜德、冕寧、美姑等縣是苦蕎的主產(chǎn)區(qū)[9-10]。涼山地區(qū)特殊的地理環(huán)境與獨特的氣候有利于蕎麥的產(chǎn)量與品質(zhì),全州常年種植面積上百萬畝,約占全國總種植面積的一半以上[6, 11]。

真菌、細菌、病毒、線蟲等病原物均可引起蕎麥病害[12],其中真菌病害報道較多,而細菌性病害報道卻很少,僅見丁香假單胞菌Pseudomonassyringae和銅綠假單胞菌P.aeruginosa[13-14]引起的細菌性葉斑病,而關(guān)于蕎麥種子攜帶細菌的報道更少。種子上攜帶的病原菌是田間病害發(fā)生的重要初侵染來源,種子攜帶的有益微生物也會對作物生長起到促進作用。加強對種子攜帶微生物的檢測,有利于明確種子健康狀況,挖掘有益微生物群體。種子帶菌檢測的技術(shù)主要有直接檢測、洗滌檢測、瓊脂培養(yǎng)檢測、免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等,近年來高通量測序技術(shù)也陸續(xù)應(yīng)用在種子帶菌檢測中,但在蕎麥種子健康檢測中還未見報道。

本研究運用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和基于16S rRNA基因的擴增子測序方法,對涼山主要產(chǎn)區(qū)的苦蕎種子攜帶的細菌進行了檢測,旨在明確涼山州苦蕎種子攜帶細菌的多樣性,并為種子健康檢測提供新的技術(shù)手段和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

蕎麥種子樣品:采自四川省涼山州越西縣、昭覺縣、喜德縣、冕寧縣、普格縣、美姑縣和鹽源縣不同鄉(xiāng)村的46份苦蕎種子(表1)用于種子攜帶細菌的檢測,其中選取不同地點的13份種子用于16S rRNA基因擴增子測序。

表1 來自四川省涼山苦蕎種子樣品信息1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.2 試劑與儀器

LBA培養(yǎng)基:5 g/L酵母浸粉、5 g/L氯化鈉、10 g/L胰蛋白胨、16 g/L瓊脂。

供試試劑:1% NaClO;AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒,AXYGEN;Omega-soil DNA Kit,Omega Bio-Tek;TruSeqTM DNA Sample Prep Kit,TransGen。

供試儀器:K30型金屬浴,干式恒溫器,Alphamager HP凝膠成像儀,H1650R離心機(cence?湘儀),ABSON MiFly-6小型離心機(合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司),球磨儀(Retsch MM400),MyCycler580BR型PCR儀(Bio-Rad),ABI GeneAmp?9700型PCR儀(ABI),DYY-12型電泳儀與DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠),粉碎研磨儀TL-48R(上海萬柏生物科技有限公司),NanoDrop 2000(Thermo Scientific),微型熒光計TBS380(TurnerBioSystems),MISEQ測序儀Illumina Miseq(Illumina)。

1.3 分離培養(yǎng)結(jié)合16S rRNA基因序列鑒定

分離培養(yǎng):從每一份供試的苦蕎種子中隨機選取100粒,放入滅菌的50 mL錐形瓶中,加入10 mL無菌水,置于搖床中振蕩培養(yǎng)30 min(120 r/min),之后吸取2 mL培養(yǎng)液,用無菌水進行10倍梯度稀釋,稀釋液均勻涂布于LBA培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),2 d后開始觀察、記錄、計算分離頻率(分離頻率=某分離物總數(shù)/分離物的總數(shù)×100%),并進行細菌的純化分離培養(yǎng)。

形態(tài)學(xué)鑒定:觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣特征、有無分泌物等。

分子生物學(xué)鑒定:挑取1個單菌落置于10 μL無菌水中,在金屬浴100°C加熱10 min破壁獲得總DNA。利用細菌通用引物27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[15]擴增16S rRNA基因序列。PCR體系(25 μL)為:16.89 μL ddH2O、2.5 μL 10×rTaqDNA 聚合酶緩沖液、2.4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL 上游引物(10 μmol/L)、1 μL 下游引物(10 μmol/L)、0.25 μLrTaqDNA 聚合酶(2.5 U/uL)、1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min。最后將符合目標(biāo)條帶的樣品進行測序(北京博邁德科技發(fā)展有限公司),并將所得序列在NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.4 基于16S rRNA基因擴增子測序的多樣性分析

樣本預(yù)處理:在50 mL離心管里加入種子至10 mL刻度線,再加入10 mL滅菌水,渦旋振蕩5 min,種子洗脫液轉(zhuǎn)移至新管中備用。

DNA 提取、文庫構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析:利用Omega-soil DNA Kit對基因組DNA進行抽提,利用擴增16S rRNA V3-V4區(qū)域通用引物385F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTA-

CHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增,以檢測是否滿足后續(xù)擴增子測序要求。滿足要求后,通過文庫構(gòu)建,進行Miseq測序,對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控過濾處理以及去嵌合體后獲得最終的有效數(shù)據(jù)(effective tag),之后進行物種注釋和分析,包括OTU(operational taxonomic units)分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)合16S rRNA基因序列鑒定苦蕎種子攜帶細菌

對46份苦蕎種子攜帶的細菌進行分離培養(yǎng),共獲得618株細菌分離物。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,獲得的細菌分離物隸屬于10個屬,分別為賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、芽胞桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、微桿菌屬Microbacterium、泛菌屬Pantoea、短小桿菌屬Curtobacterium、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、類芽胞桿菌屬Paenibacillus、根瘤菌屬Rhizobium,具體分離物的菌落形態(tài)如圖1所示,上述細菌的16S rRNA基因序列與NCBI上已知對應(yīng)屬的細菌序列的比對結(jié)果相似性均在97%以上。通過對苦蕎種子細菌分離物的分離頻率計算與分析,泛菌屬的分離頻率最高,為52.5%,短小桿菌屬、假單胞菌屬、微桿菌屬分別為20.7%、16.5%、5.5%,其他菌群占比為4.8%(圖2)。

2.2 基于16S rRNA基因擴增子測序多樣性分析的苦蕎種子攜帶細菌的檢測

2.2.1OTU分析

對選取的13份苦蕎種子攜帶的細菌進行高通量測序,基于16S rRNA基因擴增子測序獲得的細菌被劃分為19個門(phylum)、40個綱(class)、81個目(order)、151個科(family)、279個屬(genus)、430個種(species),共624個OTUs。

圖1 來自于苦蕎種子的細菌分離物在LBA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of bacterial isolates from tartary buckwheat seeds on LBA medium

圖2 基于分離培養(yǎng)法對供試苦蕎種子攜帶細菌的優(yōu)勢菌群分析結(jié)果Fig.2 Analysis of dominant microflora from tartary buckwheat seeds based on agar plating

2.2.2Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析結(jié)果表明(表2),13份苦蕎種子樣品文庫的覆蓋率(coverage)均在99%以上,說明測序深度高,樣本中序列均能被測出,能反映種子真實的帶菌情況。Alpha多樣性分析中,ACE、Chao、Sobs的數(shù)值越大,表明菌群中所含有的OTU數(shù)目越多,菌群的豐富度(community richness)越大;另外,Shannon的值越大、Simpson的值越小,說明菌群的多樣性(community diversity)越高。表2的結(jié)果說明,來自冕寧縣的樣品MNCQ-4的ACE(497.85)、Chao(501.70)、Sobs(483)、Shannon(4.304 8)的數(shù)值最大,Simpson(0.043 6)的值最小,說明MNCQ-4菌群的豐富度與多樣性在13份種子樣品中最大。而來自昭覺縣的樣品ZJ-5的ACE(162.22)、Chao(130.40)、Sobs(107)的數(shù)值最小,Simpson(0.272 7)的值最大,表明ZJ-5的豐富度與多樣性最小。其余11份樣品的細菌菌群豐富度與多樣性介于MNCQ-4和 ZJ-5之間。

對苦蕎種子攜帶細菌的物種組成進行分析(圖3),結(jié)果表明,種帶細菌主要有泛菌屬、甲基桿菌屬Methylobacterium、鞘氨醇單胞菌、馬賽菌屬Massilia、薄層菌屬Hymenobacter、假單胞菌屬、藍細菌屬Cyanobacteria、短小桿菌屬、伯克氏菌屬-副伯克氏菌屬Burkholderia-Paraburkholderia、葡萄球菌屬Staphylococcus、腸桿菌屬Enterobacter、貪噬菌屬Variovorax,其中泛菌屬、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、馬賽菌屬、薄層菌屬、假單胞菌屬在13份苦蕎種子樣品中均能被大量檢測到。泛菌屬所占比率最高,為最主要的優(yōu)勢菌群。

表2 基于16S rRNA基因擴增子測序?qū)┰嚨?3份苦蕎種子攜帶細菌的Alpha多樣性的評估結(jié)果統(tǒng)計

圖3 基于16S rRNA擴增子測序?qū)┰嚨?3份苦蕎種子攜帶細菌的物種組成分析結(jié)果Fig.3 Community analysis of 13 tartary buckwheat seeds carrying bacteria by 16S rRNA amplicon sequencing

2.2.3Beta多樣性分析

2.2.3.1樣本層級聚類分析

13份苦蕎種子攜帶的細菌聚類分析結(jié)果如圖4所示,來自同一個縣的樣品有的能聚在一支, 有的卻相距很遠。例如,來自昭覺縣的樣品ZJ-10與ZJ-5聚在一起,而另一個采自昭覺縣的樣品ZJ-1卻與來自冕寧縣樣品MNCQ-1聚在一支;來自美姑縣的樣品MGXQ-2與MGYQ-2聚在一支,而采自美姑縣的樣品MGCQ-2卻與來自鹽源縣的YYQK-6聚在一支。其中菌群多樣性最相近的兩個樣品為來自鹽源縣的YYCQ-3與來自普格縣的PGEL-1,來自冕寧縣的MNCQ-4與其他樣品的差異性最大,且與同是冕寧縣的MNCQ-1差異性也很大。

圖4 基于16S rRNA擴增子測序?qū)┰嚨?3份苦蕎種子攜帶細菌的樣本層級聚類樹分析結(jié)果Fig.4 Sample hierarchy clustering tree analysis of 13 tartary buckwheat seeds carrying bacteria by 16S rRNA amplicon sequencing

2.2.3.2PCA分析

對苦蕎種子攜帶細菌進行PCA分析,結(jié)果表明(圖5),來自同一個地區(qū)的種子樣品菌群多樣性的差異性小,來自不同地區(qū)的種子樣品差異性大,但其中來自冕寧縣(MN)的種子與來自喜德縣(XD)的種子攜帶細菌多樣性相似,且冕寧縣(MN)和喜德縣(XD)種子與普格縣(PG)種子、鹽源縣(YY)種子相似性大。在13份種子樣品中,來自越西縣(YX)種子樣品與來自普格縣(PG)種子樣品的菌群多樣性的差異性最大。

圖5 基于16S rRNA擴增子測序?qū)┰嚨?3份苦蕎種子攜帶細菌的PCA分析結(jié)果Fig.5 PCA analysis of 13 tartary buckwheat seeds carrying bacteria by 16S rRNA amplicon sequencing

3 結(jié)論與討論

本研究通過分離培養(yǎng)法從46份供試苦蕎種子中共鑒定到10個屬的細菌,其中泛菌屬為苦蕎種子攜帶的優(yōu)勢細菌菌群。泛菌屬部分種是重要的病原細菌,其寄主范圍廣,廣泛分布在土壤、植物、動物上,其中成團泛菌Pantoeaagglomerans能夠引起稻谷內(nèi)穎褐變[16],是藜麥葉斑病[17]和煙草細菌性葉枯病的病原菌[18],并能影響紫花苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗生長[19]等,因此本研究分離得到的泛菌屬細菌是否能引起苦蕎病害,還需進一步鑒定到種,并進行致病性試驗后確認。

基于16S rRNA基因擴增子測序法僅從13份種子樣品中就檢測得到了279個屬的細菌,表明其檢測效率遠高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,其中泛菌屬為優(yōu)勢菌群,與分離培養(yǎng)法的結(jié)果一致,說明泛菌屬在苦蕎種子中的豐度最高,推測苦蕎所在的環(huán)境有利于泛菌屬細菌生存。然而,兩種方法都有彼此未檢測和鑒定到的菌群,如分離培養(yǎng)法未鑒定到高通量測序中菌群豐度高的甲基桿菌屬,16S rRNA基因擴增子測序未鑒定到分離培養(yǎng)法中分離頻率較高的微桿菌屬,可能由于專性厭氧的甲烷細菌屬生長極其緩慢，分離培養(yǎng)比較困難,而16S rRNA基因擴增子測序法在擴增時豐度極高的泛菌屬等其他優(yōu)勢菌群可能掩蓋了豐度極低的菌群(如微桿菌屬)。因此,想要準(zhǔn)確了解種子攜帶細菌的多樣性,還需要分離培養(yǎng)法與高通量測序相結(jié)合。

在PCA分析中,來自冕寧縣(MN)的種子和來自喜德縣(XD)、鹽源縣(YY)的種子所攜帶細菌多樣性相近,推測是因為地理上冕寧縣與喜德縣、鹽源縣相鄰,苦蕎品種有交叉使得菌群豐度相似。昭覺縣雖然與喜德縣、普格縣相鄰,但菌群多樣性卻相差很大,可能由于其獨特的地形、環(huán)境溫濕度、海拔或品種的原因等引起,不同地點樣品攜帶細菌的多樣性結(jié)果還需要通過對更多樣本的檢測進行深入分析。

本研究從苦蕎種子中鑒定到大量菌群,雖然大部分細菌目前還不確定是否是蕎麥的致病菌,但仍有侵染蕎麥或其他作物的可能,因此在蕎麥播種前,要加強種子檢疫和種子處理、選用抗病品種,以提高蕎麥的品質(zhì)與產(chǎn)量。