貴州八角葉枯病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

張曉勇, 鄒東霞, 張 鳳, 黃乃秀, 廖旺姣, 嚴(yán) 凱*

(1. 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530022; 2. 六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 六盤水 553004)

八角IlliciumverumHook.f是重要的調(diào)料和藥用植物,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。在八角栽培中,炭疽病(anthracnose)[1-2]、白粉病(powdery mildew)、煤污病(sooty blotch)和藻斑病(algal leaf spot)[3]等常給八角產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響。2020年8月,我們?cè)趯?duì)貴州省六盤水市盤州市八角林間調(diào)查發(fā)現(xiàn),八角植株普遍發(fā)生葉枯病,發(fā)病初期在葉尖端、葉緣形成圓形、橢圓形或不規(guī)則形的灰褐色病斑,病健交界明顯,后期隨著病斑擴(kuò)展，整個(gè)葉片干枯死亡,整體呈灰白色,枯死部分正面有密集的小黑點(diǎn),故將該病命名為葉枯病(圖1a～b)。目前,引起該病害的病原菌尚不明確。

為明確引起貴州八角葉枯病病原菌種類,本文采用形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因分子生物學(xué)的方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定,并對(duì)病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究,旨在為八角葉枯病的田間識(shí)別及防治提供理論及實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集與病原菌分離純化

供試的八角葉枯病典型病害材料于2020年8月采自貴州省六盤水市盤州市大山鎮(zhèn)嘎拉河村(104°41′E, 25°33′N,海拔2 118 m)。采集新鮮感病樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后采用單孢分離法對(duì)患病葉片病原菌進(jìn)行分離和純化。菌株在PDA斜面上培養(yǎng)7～10 d后置于4℃保藏備用。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

1)菌株生長(zhǎng)速率測(cè)定。將4℃保藏的菌株接種到PDA平板上,于25℃的黑暗條件下培養(yǎng)5 d后用直徑6.0 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌塊接入另一PDA平板中央,在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,觀察菌落特征。設(shè)置5次重復(fù)。

2)產(chǎn)孢誘導(dǎo)。將干松針剪成2～3 cm的小段,在121℃下滅菌15 min,3 d 后再進(jìn)行第2次滅菌制得雙重滅菌松針。取5～6根滅菌松針均勻撒在合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(synthetic nutrient poor agar,SNA)(KH2PO40.2 g,KCl 0.2 g,KNO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,自然pH)平板表面作為產(chǎn)孢誘導(dǎo)培養(yǎng)基[4]。待菌株活化后用直徑6.0 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌塊以3點(diǎn)法接入上述培養(yǎng)基平板上,在25℃的自然光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。待松針上有滴狀、黑褐色子實(shí)體形成后,挑取子實(shí)體以無(wú)菌水制作臨時(shí)裝片,用Olympus BX51顯微攝像系統(tǒng)拍攝產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的顯微結(jié)構(gòu),并用SPOTCam 32繪制標(biāo)尺和測(cè)量顯微尺寸。

1.2.2分子生物學(xué)鑒定

1)病原菌DNA提取。將供試菌株分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上,置于25℃、黑暗條件下培養(yǎng)7 d后刮取菌絲,用改良的CTAB法提取DNA[5]。

2)目的基因的擴(kuò)增與序列測(cè)定。擴(kuò)增的目的基因序列分別為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、β-微管蛋白基因(TUB)和翻譯延伸因子1-α基因(tef1)。ITS基因選用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS4和ITS5[6];TUB基因選用引物BT2A和BT2B[7];tef1基因選用引物EF1-526F和EF1-1567R[8],反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參考Maharachchikumbura等的方法[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。將所得序列輸入GenBank的BLAST中進(jìn)行同源序列檢索,查找相似性較高的菌株(表1)。3個(gè)基因序列用Sequence Matrix 1.7.8進(jìn)行拼接,用MEGA 11 軟件以極大似然法(maximum likelihood method, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。

表1 參與多基因系統(tǒng)發(fā)育分析的菌株及序列登錄號(hào)信息1)

1.3 致病性測(cè)定

選取健康無(wú)損傷的離體成熟八角葉片,先用75%乙醇擦拭葉片表面,無(wú)菌水清洗5次,再用滅菌吸水紙擦干表面水珠。葉柄切口處用無(wú)菌濕棉球包住后平置于培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行保濕培養(yǎng)。用滅菌大頭針在直徑5 mm的葉片區(qū)域內(nèi)刺傷5點(diǎn)形成微創(chuàng)傷口。吸取50 μL的106個(gè)/mL病原菌孢子懸浮液滴于微創(chuàng)傷口上,另一組在微傷口處接種等體積無(wú)菌水,以在未進(jìn)行損傷處理葉片的相同部位接種50 μL病原菌孢子懸浮液為對(duì)照。接種后蓋好皿蓋放置于20℃、光照條件下培養(yǎng)7 d觀察發(fā)病情況,試驗(yàn)設(shè)置5次重復(fù)。

1.4 病原菌適宜生長(zhǎng)溫度及pH測(cè)定

在活化菌株菌落邊緣打取6 mm菌餅接種于PDA平板,分別置于0、5、10、15、20、25、30℃和35℃等8個(gè)溫度環(huán)境中,黑暗條件下培養(yǎng)5 d后測(cè)量各溫度下的菌落直徑(mm)。用1.00 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的 pH,配制成初始pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11和12等9個(gè)梯度的培養(yǎng)基,滅菌后倒平板,從菌落邊緣打取6 mm菌餅接種于不同pH值的PDA平板中央, 25℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d后測(cè)量各個(gè)處理菌落直徑(mm)。用移液槍吸取100 μL 106個(gè)/mL孢子懸浮液加入PDA平板,均勻涂布后分別置于上述幾個(gè)溫度和pH環(huán)境中。24 h后將平板置于光學(xué)顯微鏡的10×10低倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)情況。每處理設(shè)置5次重復(fù)。孢子萌發(fā)率=視野中孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100%。

1.5 病原菌菌絲和孢子致死溫度測(cè)定

用滅菌打孔器在菌株菌落邊緣打取4 mm的菌餅裝入1.5 mL無(wú)菌離心管中,加入1.0 mL無(wú)菌水后蓋上離心管,分別放入35、40、45、50、55、60、65℃和70℃水浴中,精確計(jì)時(shí)10 min后取出菌餅,用無(wú)菌濾紙吸干水珠后以單點(diǎn)法接于PDA平板中央,25℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑。取1.0 mL 的106個(gè)/mL孢子懸浮液加入1.5 mL無(wú)菌離心管中,蓋好蓋子后分別投入上述7個(gè)溫度的水浴中精確計(jì)時(shí)處理10 min,取各溫度處理的100 μL孢子懸浮液均勻涂布于水瓊脂(WA)平板上,25℃、黑暗條件下培養(yǎng)24 h后將平板置于光學(xué)顯微鏡的10×10低倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)分生孢子萌發(fā)情況。每個(gè)溫度設(shè)置5次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角葉枯病癥狀觀察

在八角葉片上,病害初期在葉片尖端、葉緣或葉上形成圓形、橢圓形或不規(guī)則形的灰褐色病斑,病健交界明顯,后期隨著病斑擴(kuò)展導(dǎo)致整個(gè)葉片干枯死亡,整體呈灰褐色。葉片干枯壞死部分向上卷曲,幾乎不形成穿孔(圖1a～b)。發(fā)病后期在病斑處可見密集的小黑點(diǎn)狀分生孢子盤,單生或連成片(圖1c)。

圖1 八角葉枯病癥狀及菌株致病性測(cè)試Fig.1 Symptoms of Illicium verum leaf blight and pathogenicity test

2.2 病原菌分離與致病性鑒定

通過單孢分離法從典型病斑部位共分離獲得3個(gè)純化菌株(編號(hào)為IP202082702、IP202082705和IP202082706)。將菌株IP202082702孢子懸浮液接種于健康八角葉片上,20℃下培養(yǎng)7 d 后,與刺傷不接種處理相比,接種處形成6～7 mm的灰褐色壞死病斑,與田間早期癥狀一致(圖1d～e)。繼續(xù)培養(yǎng)待病斑上產(chǎn)生子實(shí)體后,再次挑取分生孢子進(jìn)行單孢分離,所得菌株形態(tài)特征與原菌株一致。無(wú)傷接種處理則未出現(xiàn)病斑(圖1f),說明該病原菌主要靠傷口或葉片邊緣結(jié)構(gòu)侵入葉片而致病。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株在PDA上于25℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d后,菌落平均直徑為(61.67±0.58)mm(n=3)。菌落表面平整,白色至淡黃色,絨毛狀,有明顯的輪狀花紋,質(zhì)地相對(duì)緊密,背面中央呈淺橙色,至邊緣逐漸減淡為白色(圖2a～b);培養(yǎng)12 d以后,菌株在SNA培養(yǎng)基中的松針上形成黑色子實(shí)體,球形,淚滴狀,200～500 μm(圖2c)。

分生孢子梗透明,表面光滑,亞圓柱狀,長(zhǎng)為17.22～37.09 μm,產(chǎn)孢細(xì)胞安瓿瓶狀、透明,長(zhǎng)12～23.2 μm(圖2d～e)。分生孢子紡錘狀,直或略微彎曲,4個(gè)隔5個(gè)細(xì)胞,分生孢子長(zhǎng)19.21～29.65 μm,平均(22.95±2.56)μm (n=30),寬6.47～9.77 μm,平均(8.73±0.51)μm (n=30)?；考?xì)胞倒圓錐形,長(zhǎng)3.27～6.61 μm,無(wú)色、透明;中間3個(gè)細(xì)胞甕形,表面具有密集的小疣點(diǎn),同色,淺棕色到棕褐色,長(zhǎng)12.79～17.18 μm,平均(14.87±2.21)μm (n=30),隔比孢子外側(cè)壁厚,黑褐色。頂部細(xì)胞無(wú)色、透明、倒圓錐形,長(zhǎng)2.16～4.08 μm;頂端附屬絲1～4根,多為3根,從孢子頂端不共點(diǎn)分出,長(zhǎng)14.56～31.97 μm,平均(21.13±3.48)μm (n=30),透明絲狀,不分支;中生式基部附屬絲1根,長(zhǎng)4.26～7.33 μm,平均(5.53±1.26)μm (n=30)(圖2f～k)。通過與該屬已知種進(jìn)行比較,初步將3株菌株鑒定為廬山擬盤多毛孢PestalotiopsislushanensisF.Liu & L. Cai[8]。

圖2 八角葉枯病病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Pestalotiopsis lushanensis

2.3.2病原菌分子生物學(xué)鑒定

將3個(gè)病原菌菌株的ITS、TUB和tef1序列與GenBank中下載的20個(gè)菌株相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),以SequenceMatrix1.7.8進(jìn)行拼接,用MEGA 11以SeiridiumcamelliaeSD096為外群構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。本研究分離的3株菌株IP202082702、IP202082705和IP202082706與廬山擬盤多毛孢P.lushanensis以99%的高支持率聚為一支,支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,故基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征將3個(gè)菌株鑒定為廬山擬盤多毛孢P.lushanensisF. Liu & L. Cai。

圖3 基于ITS、TUB和tef1構(gòu)建的廬山擬盤多毛孢及其相關(guān)菌株的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 ML phylogenetic tree based on combined sequences of ITS, TUB, and tef1 genes of Pestalotiopsis lushanensis and relative strains

2.4 不同培養(yǎng)溫度和 pH 對(duì)病原菌生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)溫度和 pH 對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)影響如圖 4所示。在10～35℃范圍內(nèi)該菌菌絲均可生長(zhǎng),孢子可萌發(fā),適合菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的溫度范圍為20～30℃,最適為25℃,當(dāng)溫度超過 35℃后菌絲基本停止生長(zhǎng)(圖4)。該菌對(duì)培養(yǎng)基 pH的要求不嚴(yán)格,在 pH 4～12 范圍內(nèi)孢子可部分萌發(fā),菌絲可生長(zhǎng),但在pH 6～7時(shí)菌落直徑最大;分生孢子在 pH 6～10萌發(fā)率均較高(圖4)。說明該菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)最佳溫度為25℃,最適pH為6～7。

圖4 不同溫度和 pH 對(duì)廬山擬盤多毛孢菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of different temperatures and pH values on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis

2.5 病原菌致死溫度

病原菌菌絲和孢子在不同溫度下處理10 min后其菌落直徑和孢子萌發(fā)率如圖5所示。隨著處理溫度的升高,菌落直徑和孢子萌發(fā)率均隨之急劇降低,當(dāng)處理溫度達(dá)到50℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng),達(dá)到55℃時(shí)孢子萌發(fā)率降為0。說明病原菌的菌絲致死溫度為50℃處理10 min,分生孢子致死溫度為55℃處理10 min。

圖5 廬山擬盤多毛孢菌絲和分生孢子在不同溫度下處理10 min的效果Fig.5 Effects of treatment for 10 min under different temperatures on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis

3 結(jié)論與討論

擬盤多毛孢屬中很多真菌是植物病原菌,常危害植物葉片、枝條、果實(shí)和根系,引起葉斑、葉枯、枝枯、果實(shí)黑斑病、軟腐病和根腐病等[10-14],對(duì)很多植物的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重影響。本文基于形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS、TUB和tef1多基因序列分析,將八角葉枯病病原菌鑒定為廬山擬盤多毛孢Pestalotiopsislushanensis。廬山擬盤多毛孢是Liu等[8]在2017年報(bào)道的新種,其模式標(biāo)本采自江西廬山國(guó)家公園的山茶屬植物。到目前為止,已報(bào)道廬山擬盤多毛孢引起茶Camelliasinensis的灰枯病[15]和草珊瑚Sarcandraglabra的褐斑病[16],這是廬山擬盤多毛孢在八角上的首次報(bào)道。

傳統(tǒng)上,擬盤多毛孢屬真菌的分類主要基于分生孢子形態(tài)特征,如分生孢子3個(gè)中間細(xì)胞顏色、分生孢子大小及頂端附屬絲、基部中生式柄的形態(tài)和數(shù)量等[17]。但隨著對(duì)該屬研究的深入,報(bào)道的種越來越多,以分生孢子顏色和大小來進(jìn)行分類是非常困難的,多基因序列分析也證明僅靠形態(tài)學(xué)分類很難鑒定到種,而且形態(tài)特征與菌株培養(yǎng)條件有關(guān)[4]。多基因分子鑒定是對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的有效補(bǔ)充。本文結(jié)合ITS、TUB和tef1多基因序列分析(圖3)發(fā)現(xiàn),廬山擬盤多毛孢P.lushanensis近緣種有杜鵑擬盤多毛孢P.rhododendri和P.clavata,3個(gè)種的分生孢子大小和顏色相近,但是杜鵑擬盤多毛孢頂端附屬絲(7.5～14.9 μm)和基部附屬絲(2.8～4.9 μm)都明顯短于廬山擬盤多毛孢(12.79～17.18 μm和4.26～7.33 μm)[18],P.clavata基部附屬絲(7～9 μm)明顯長(zhǎng)于廬山擬盤多毛孢[9]。前人在八角上報(bào)道的擬盤多毛孢屬真菌有八角擬盤多毛孢P.ilicis和金毛狗擬盤多毛孢P.cibotii,兩個(gè)種的分生孢子大小、顏色及基部附屬絲、頂端附屬絲長(zhǎng)度與廬山擬盤多毛孢也有顯著差異[17,19]。

本研究還對(duì)八角葉枯病新病原菌廬山擬盤多毛孢生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,該菌在10～35℃和pH 4～12范圍內(nèi)其菌絲均可生長(zhǎng),孢子均可萌發(fā),說明該菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng),但10℃以下的低溫和35℃以上的高溫對(duì)該菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)影響較大,說明溫度是影響該菌侵入、擴(kuò)展和發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。致死溫度測(cè)試表明,50℃處理10 min后菌絲停止生長(zhǎng),55℃處理 10 min 后孢子無(wú)法萌發(fā),說明孢子對(duì)高溫的耐受性高于菌絲,與李陽(yáng)的研究結(jié)果一致[20]。本文對(duì)八角葉枯病新病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,為該病害的田間流行監(jiān)測(cè)、發(fā)生規(guī)律和防治方法提供理論和實(shí)踐參考。