川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合抑菌活性研究

趙 晴, 張智蕊, 徐鳳波, 李慶山, 李 嬌

(南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 元素有機(jī)化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300071)

中草藥提取物都具有一定的抑菌功效,且利用中草藥提取物殺菌不易使植物病菌產(chǎn)生抗藥性,對(duì)農(nóng)作物安全,可有效避免化學(xué)合成農(nóng)藥造成的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題[1-2]。植物本身會(huì)產(chǎn)生豐富的抑菌物質(zhì),例如,萜類、生物堿類、黃酮類、苷類、皂甙、醌類、香豆素、木質(zhì)素、芪類、酯類、酚類、醇類、甾類、有機(jī)酸及精油類等化合物。植物提取物對(duì)于土壤生態(tài)環(huán)境的影響較小,具有很大的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力[3-4]。川芎中含有有機(jī)酚酸類成分,其中阿魏酸、咖啡酸、綠原酸等具有廣泛的抑菌活性;穿心蓮中含有的黃酮類和二萜內(nèi)酯類成分是穿心蓮主要的抑菌成分[5-6];干姜中含有的精油類成分具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲等多種生物活性[7-8]。唐杰等對(duì)川芎提取物體外抑菌活性和殺蟲活性研究表明,其乙醇提取物對(duì)7種常見致病菌具有明顯的抑制作用,對(duì)油菜蚜蟲有觸殺作用[9]。羅丹等研究發(fā)現(xiàn),姜精油對(duì)番茄早疫病菌Alternariasolani、番茄灰霉病菌BotrytiscinereaPers.、番茄瘡痂病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria均有一定的抑制作用[10]。劉志祥等采用杯碟法對(duì)穿心蓮提取物進(jìn)行體外抗菌研究,結(jié)果表明,穿心蓮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌StaphyloccocusaureusRosenbach、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、黑曲霉Aspergillusniger、青霉Penicillium有明顯的抑制效果[5]。之前的研究主要集中于單一中藥提取物的抑菌活性,對(duì)于多種中藥提取物組合的抑菌活性研究較少。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研和中藥篩選,得出川芎、干姜、穿心蓮均為常用中藥,對(duì)于人體有較好的醫(yī)用功效,且3種中藥價(jià)格低廉,均具有一定的抑菌功效,故對(duì)川芎、干姜和穿心蓮分別進(jìn)行提取,并進(jìn)行抑菌活性測試,探究3種中藥提取物及其復(fù)配組合的抑菌功效,并對(duì)提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析和含量測定,結(jié)合文獻(xiàn)分析抑菌機(jī)理,篩選出效果好的中藥提取物殺菌組合用于防治植物病害。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試中藥

本試驗(yàn)所用中藥如表1所示,其中川芎、干姜、穿心蓮均來自北京同仁堂,為中藥飲片,采購后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試菌種

本試驗(yàn)所用菌種如表2所示,5種植物真菌均由南開大學(xué)生測室提供。

1.2 方法

1.2.1中藥提取

1.2.1.1川芎提取

中藥川芎飲片用破壁機(jī)粉碎,細(xì)度約100目,在不銹鋼釜中按料液比1∶8加入90%乙醇溶液,超聲波輔助,加熱回流2 h,冷卻后離心過濾。濾渣按料液比1∶8加入90%乙醇溶液重復(fù)提取1次,合并兩次提取濾液,減壓濃縮脫除溶劑,得到醇提浸膏。

醇提浸膏加入5倍質(zhì)量的水將其分散，然后加入15倍質(zhì)量的乙酸乙酯萃取兩次,合并兩次萃取液,減壓脫除溶劑,干燥,得到川芎提取物。產(chǎn)物回收率為10.33%。

表1 供試中草藥

表2 供試真菌

1.2.1.2干姜提取

中藥干姜飲片用破壁機(jī)粉碎,細(xì)度約100目。在索氏提取器中加入料液比1∶15的石油醚,90℃索氏提取6 h,冷卻后抽濾,收集濾液,減壓脫除溶劑,得到干姜提取物。產(chǎn)物回收率為3.89%。

1.2.1.3穿心蓮提取

中藥穿心蓮飲片用破壁機(jī)粉碎,細(xì)度約100目。在圓底燒瓶中加入料液比1∶20的60%乙醇溶液,50℃加熱4 h,冷卻后抽濾,收集濾液,減壓脫除溶劑,得到穿心蓮提取物[11]。產(chǎn)物回收率為28.42%。

1.2.2抑菌效果測定

本文抑菌試驗(yàn)以水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌為測試對(duì)象,采用生長速率法測定川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合的抑菌效果。具體試驗(yàn)步驟如下:

將凍存菌種于室溫下復(fù)蘇,用接種針挑取少量菌落至PDA平板中心區(qū)域,封口,無光照倒置培養(yǎng)于溫度25℃、濕度73%的培養(yǎng)箱中。將川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合先分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解,再用1‰的吐溫水分別稀釋成5 000、1 000、500 mg/L的藥液。用移液槍分別吸取1 mL藥液加入到9 mL的PDA培養(yǎng)基中,制成最終濃度為500、100、50 mg/L的含藥平板。水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌活化后用打孔器打取直徑4 mm菌餅,置于含藥平板內(nèi),每皿3塊呈等邊三角形擺放,每處理重復(fù)3次,以不加藥劑做空白對(duì)照。將各處理于(24±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后測量各處理菌落擴(kuò)展直徑,計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(空白對(duì)照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/空白對(duì)照菌落增長直徑×100%。

1.2.3提取物組合增效作用評(píng)價(jià)方法

采用Gowing方法[12]對(duì)殺菌劑混劑的協(xié)同增效作用進(jìn)行判斷。按Gowing方程進(jìn)行評(píng)價(jià)。

Cexp=C1+C2(1-C1)。

Cobs=Cexp,混劑中各組分表現(xiàn)獨(dú)立作用;

Cobs>Cexp,混劑中各組分表現(xiàn)增效作用;

Cobs

其中,Cexp為混劑對(duì)病菌抑制作用的預(yù)期水平(理論抑制率);C1和C2為單劑單獨(dú)使用時(shí)對(duì)病菌實(shí)際抑制率;Cobs為試驗(yàn)測定的混劑對(duì)病菌的實(shí)際抑制率。

1.2.4色譜條件

1.2.4.1川芎提取物GC-MS條件

1) 氣相條件[13]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣溫度:270℃;分流比:30∶1;載氣∶He(99.999%),流量:1 mL/min;程序升溫:初始溫度50℃,以4℃/min升至260℃,保持2 min,以20℃/min升至300℃,保持5 min。

2) 質(zhì)譜條件[13]。電離方式為電子電離(EI),電子能量70 eV;離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;掃描方式:全掃描;質(zhì)量范圍:33～500 amu;溶劑延遲:3 min。

1.2.4.2干姜提取物GC-MS條件

1) 氣相條件[14]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm),柱溫45℃(保留2 min),以5℃/min升溫至280℃,保持2 min;氣化室溫度250℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓7.62 psi,載氣流量1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流比20∶1,溶劑延遲3 min。

2) 質(zhì)譜條件[14]。離子源為EI源;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;電子能量70 eV;發(fā)射電流34.6 μA;倍增器電壓1 120 V;接口溫度280℃;質(zhì)量范圍20～450 amu。

1.2.4.3穿心蓮提取物HPLC條件

色譜柱:ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-水(18∶82,V/V)為流動(dòng)相梯度洗脫。乙腈起始濃度18%，60 min時(shí)濃度為40%,流速1 mL/min。檢測波長226 nm;進(jìn)樣量20 μL[15]。

1.2.5紫外(UV)條件

1.2.5.1川芎總酚酸UV條件[16]

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。準(zhǔn)確稱取5.00 mg阿魏酸,置于100 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解,制得0.05 mg/mL對(duì)照品溶液。精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分別置25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL,0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL搖勻,在暗處放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,搖勻,暗處放置30 min,以不加阿魏酸的上述處理為空白對(duì)照,724 nm波長處測吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為:A=0.299 29C+0.242 91,R2=0.961 91。

2)樣品測定。準(zhǔn)確稱取川芎提取樣品0.067 82 g,置100 mL容量瓶,加甲醇超聲溶解,制得0.678 2 mg/mL樣品溶液。精密吸取樣品溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL,0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL搖勻,在暗處放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,搖勻,暗處放置30 min,724 nm波長處測吸光度,并用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算總酚酸含量。

1.2.5.2穿心蓮總黃酮UV條件[11]

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑0.101 86 g,用甲醇溶解定容至100 mL,得到對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中,用甲醇補(bǔ)充至5 mL,各加入5%的NaNO20.5 mL,室溫放置6 min后,加入10%的Al(NO3)30.5 mL,室溫放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室溫放置15 min,以不加對(duì)照品溶液作為空白, 于 500 nm 處測定吸光度(A),以蘆丁濃度(C)為縱坐標(biāo),吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程:C=9.053 6A-0.089 5,R2=0.983 38,線性范圍50.0～250 μg/mL。

2)樣品溶液制備及總黃酮含量測定。準(zhǔn)確稱取穿心蓮提取物0.201 99 g,用甲醇溶解定容至50 mL,得樣品溶液。精密吸取供試品溶液5 mL于10 mL容量瓶中,加入5%的NaNO20.5 mL,室溫放置6 min,加入10%的 Al(NO3)30.5 mL,室溫放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室溫放置15 min,于500 nm處測定吸光度,并用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

所獲抑菌率原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后,使用SPSS 26軟件計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤,并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。本試驗(yàn)有兩個(gè)自變量,即提取物和提取物的濃度,本研究側(cè)重于提取物及其組合對(duì)5種植物病原真菌抑制率的影響。所以將相同濃度下不同提取物對(duì)相同病原真菌的抑制率數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SPSS軟件中,采用LSD多重比較不同處理間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物及其組合對(duì)5種植物病原真菌抑制作用

川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合對(duì)5種植物真菌的抑菌結(jié)果(表3)顯示,相同濃度下不同提取物對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌的抑制率均存在顯著差異。通過比較不同抑菌濃度,發(fā)現(xiàn)在 500 mg/L 時(shí),3種提取物及其組合對(duì)5種真菌的抑制率效果顯著,部分抑制率最高達(dá)100%;比較單一提取物和提取物復(fù)配組合的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)提取物組合對(duì)病原菌抑制率更高,抑菌譜更廣,其中,在1∶1(m∶m)配比下,濃度為500 mg/L時(shí),川芎+干姜提取物對(duì)5種植物病原真菌抑制率達(dá)83%以上,川芎+穿心蓮提取物對(duì)5種植物病原真菌的抑制率達(dá)75%以上,干姜+穿心蓮提取物對(duì)除黃瓜枯萎病菌以外的4種病原菌的抑制率達(dá)88%以上。

表3 川芎、干姜、穿心蓮提取物及其組合對(duì)5種植物病原真菌的抑制作用1)

2.2 提取物組合增效作用評(píng)價(jià)結(jié)果

3種中藥提取物組合對(duì)5種植物病原真菌的增效作用評(píng)價(jià)結(jié)果見表4。在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L時(shí)增效作用明顯,且對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌4種植物病原真菌的抑制作用較強(qiáng);川芎+穿心蓮提取物在100 mg/L時(shí),對(duì)水稻稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的抑制作用較強(qiáng)且表現(xiàn)為增效作用;干姜+穿心蓮提取物在500 mg/L時(shí),對(duì)5種植物病原真菌均表現(xiàn)為增效作用，其中對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、花生褐斑病菌的抑制作用較強(qiáng)。

表4 川芎、干姜、穿心蓮提取物組合對(duì)5種植物病原真菌的增效作用評(píng)價(jià)

2.3 提取物成分檢測與鑒定

2.3.1川芎提取物

2.3.1.1揮發(fā)性成分鑒定

川芎提取物經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析,共鑒定出5種主要的揮發(fā)性化合物(表5)。以色譜峰面積歸一法計(jì)算化學(xué)成分含量,其總離子流圖見圖1,其主要化學(xué)成分及其峰面積相對(duì)百分含量見表5。從表中可以看出川芎提取物中的化學(xué)成分主要為內(nèi)酯類,其中含量最高的為藁本內(nèi)酯,含量為57.21%,其次為(3s)-3-丁基-4,s-二氫-1(3H)-異苯并呋喃酮、新蛇床內(nèi)酯、正丁基苯酞、3-正丁烯基苯酞,含量依次為30.50%、3.14%、2.27%、1.86%,總含量達(dá)90%以上,為川芎提取物中揮發(fā)性成分的主要組成部分。

2.3.1.2酚酸類成分含量測定

川芎提取物中含有的酚酸類如阿魏酸、咖啡酸、綠原酸均具有較好的抑菌功效,經(jīng)UV分析,測得總酚酸含量為9.15%。

圖1 川芎提取物GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of Chuanxiong Rhizoma extracts

表5 川芎提取物主要化學(xué)成分

2.3.2干姜提取物成分分析鑒定

干姜提取物經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析,共鑒定出15種化合物(表6)。以色譜峰面積歸一法計(jì)算化學(xué)成分含量,其總離子流圖見圖2,其主要化學(xué)成分及其峰面積相對(duì)百分含量見表6。從表中可以看出干姜提取物中的化學(xué)成分主要為萜烯類、酮類、醛類、酚類,其中含量最高的4種為α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯,均為倍半萜類化合物,含量分別為37.90%、13.27%、12.23%、10.03%,總含量達(dá)70%以上,為干姜提取物的主要化學(xué)成分。

圖2 干姜提取物GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of Zingiberis Rhizoma extracts

表6 干姜提取物主要化學(xué)成分

2.3.3穿心蓮提取物

2.3.3.1穿心蓮內(nèi)酯含量測定

穿心蓮主要抑菌成分為穿心蓮內(nèi)酯和黃酮。圖3為對(duì)照品穿心蓮內(nèi)酯液相色譜圖。穿心蓮提取物經(jīng)HPLC分析得到的色譜圖如圖4所示,1為穿心蓮內(nèi)酯峰。經(jīng)計(jì)算,穿心蓮提取物中穿心蓮內(nèi)酯含量為2.67%。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品色譜分析Fig.3 Chromatographic analysis of andrographolide standard

2.3.3.2穿心蓮黃酮含量測定

經(jīng)UV分析,測得穿心蓮提取物中總黃酮含量為4.85%。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著提取物濃度的增大,在500 mg/L時(shí),3種中藥提取物及其組合對(duì)5種真菌的抑制效果顯著,抑菌譜更廣,對(duì)部分病原菌的抑制率最高達(dá)100%;提取物組合與單一提取物相比,抑制率更高,抑菌譜更廣,其中,在1∶1(m∶m)配比下,濃度為500 mg/L時(shí),川芎+干姜、川芎+穿心蓮提取物對(duì)5種植物病原真菌抑制率分別達(dá)83%和75%以上,干姜+穿心蓮提取物對(duì)除黃瓜枯萎病菌以外的4種植物病原真菌的抑制率達(dá)88%以上。

圖4 穿心蓮提取物色譜分析Fig.4 Chromatographic analysis of Andrographis Herba extracts

利用Growing法對(duì)3種中藥提取物復(fù)配組合進(jìn)行增效拮抗作用評(píng)價(jià),結(jié)果表明,2種中藥提取物復(fù)配具有較好的協(xié)同增效作用,其中,在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L時(shí)對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌和花生褐斑病菌表現(xiàn)為增效作用;川芎+穿心蓮提取物在100 mg/L時(shí)對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌和花生褐斑病菌表現(xiàn)為增效作用;干姜+穿心蓮提取物在500 mg/L時(shí)對(duì)水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌表現(xiàn)為增效作用。

利用GC-MS、HPLC和UV對(duì)川芎、干姜和穿心蓮提取物進(jìn)行成分分析和含量測定，結(jié)果表明，川芎提取物中的揮發(fā)性成分主要為內(nèi)酯類,總含量達(dá)90%以上,其中含量最高的為藁本內(nèi)酯,含量為57.21%,非揮發(fā)性抑菌成分酚酸類的含量為9.15%。干姜提取物中的化學(xué)成分主要為倍半萜類化合物,總含量達(dá)70%以上,其中含量最高的為α-姜烯，含量為37.90%。穿心蓮提取物中主要的抑菌成分穿心蓮內(nèi)酯的含量為2.67%,黃酮的含量為4.85%。

真菌細(xì)胞壁位于細(xì)胞膜外層,具有保持營養(yǎng)物質(zhì)、氣體和酶自由通透及避免細(xì)胞受外界高滲透壓的作用。細(xì)胞壁周圍覆蓋有脂多糖和外膜蛋白,限制疏水性化合物通過脂多糖層向胞內(nèi)擴(kuò)散，以減弱其對(duì)細(xì)胞膜的損害[17]。川芎酚酸類、穿心蓮黃酮苷和二氫黃酮類親水性強(qiáng),親脂性差,川芎內(nèi)酯類、干姜倍半萜類、穿心蓮二萜內(nèi)酯類和部分黃酮類親脂性強(qiáng)。川芎提取物與干姜提取物或穿心蓮提取物復(fù)配組合,川芎提取物中親水性的酚酸類成分可破壞由多糖構(gòu)成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),增大細(xì)胞壁的通透性,使親脂性的川芎內(nèi)酯類、干姜倍半萜類或穿心蓮二萜內(nèi)酯類和部分黃酮類成分順利通過細(xì)胞壁,利用親脂性破壞細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)容物滲出,導(dǎo)致菌體死亡,從而達(dá)到協(xié)同增效的作用。試驗(yàn)結(jié)果證明,川芎提取物同干姜提取物或穿心蓮提取物等親脂性提取物進(jìn)行復(fù)配時(shí)在100 μg/mL時(shí)就能夠起到很好的增效作用。

而當(dāng)穿心蓮提取物同干姜提取物進(jìn)行復(fù)配時(shí),濃度在500 μg/mL時(shí)才能達(dá)到較好的增效作用,抑菌機(jī)理可能是親脂性的主要為干姜倍半萜類和穿心蓮二萜內(nèi)酯類,而穿心蓮黃酮類化合物中的黃酮苷、二氫黃酮類具有一定親水性,但是含量較低,需要較高的濃度才能對(duì)菌體產(chǎn)生作用。

川芎、干姜和穿心蓮提取物兩兩復(fù)配,抑菌率和抑菌廣譜性均優(yōu)于單一提取物,并表現(xiàn)出優(yōu)越的協(xié)同增效作用,為植物源殺菌劑的開發(fā)提供了較好的理論依據(jù)。