白柿果實發(fā)育及落果生理

劉金養(yǎng)，吳雅倩，李 娟，涂攀峰，陳杰忠，姚 青

(1 華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院廣州，510642；2 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院園藝園林學院，廣州，510642)

白柿(CasimiroaedulisLlave & Lex)，別名冰淇淋果、墨西哥蘋果，屬蕓香科香肉屬，為常綠中型喬木。原產(chǎn)于墨西哥和中美洲等地，現(xiàn)世界各地都有引種栽培[1-2]。果實富含維生素C，具有較高的營養(yǎng)與藥用價值[3]。白柿果實可直接食用，冷凍后風味更佳，也可加工成果汁、果醬、果凍、餅干、調味料、冰淇淋、酸酪乳及蜜餞等食品[4]。果實具有安眠及減輕風濕痛功效，西班牙人喝由其葉做成的茶，可降低血壓[5]。白柿有一定的抗旱性及耐鹽堿性[6]，具有豐產(chǎn)、易栽培、病蟲害少等優(yōu)點[7]。白柿在我國作為新興水果進行商業(yè)栽培也是近幾年才開始的，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)主栽品種“W4”白柿存在花量大但著果少，成果率低的問題。初步的觀測研究表明：“W4”白柿落果嚴重，可能是由于其花藥發(fā)育不全而花粉含量少，造成無法授粉受精而大量落果，即使在一些配置了授粉樹或人工異花授粉的情況下，后期的生理落果也很嚴重。

果樹生理落果的原因有很多，其中果實發(fā)育過程中的碳水化合物及內源激素含量變化與其落果密切相關。有研究表明，柚早期落果是由于樹體養(yǎng)分不足進而造成供給果實發(fā)育的碳水化合物不足導致的，脫落果中的碳水化合物比留存果低[8]。在荔枝的果實生長發(fā)育過程中，糖饑餓會促進脫落酸和乙烯的合成，進而抑制生長素的合成以及生長素的極性運輸，從而導致幼果脫落[9]。蘋果果實脫落與ABA通過刺激氣孔關閉促進乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)傳遞到離區(qū)，進而在離區(qū)轉化為乙烯從而激活離區(qū)造成脫落有關[10]。碳水化合物及內源激素對果實脫落的作用在柑桔、荔枝、蘋果、棗樹、梨等多種果樹上都已有報道[8-12]。但是，還未見過白柿果實生長發(fā)育期間，碳水化合物和內源激素對其落果影響的研究報道。本文以主栽品種“W4”白柿為材料，觀測了其生長發(fā)育期間的落果規(guī)律和果實生長動態(tài)，并分析了落果與正常發(fā)育果實中碳素水平和內源激素的含量差異，為今后制定減少白柿生理落果和提高產(chǎn)量的技術措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在廣州市的華南農(nóng)業(yè)大學果園進行，試材為自臺灣引種的“W4”白柿。選取生長勢一致的兩年生本砧“W4”白柿(CasimiroaedulisLlave & Lex cv.W4)10株進行定點觀測，每株選擇不同方向的3個大枝條，定期觀察記錄果實與枝條的生長情況，并統(tǒng)計落果率。另選擇開花時間相近，生長狀況相似的5株白柿，將其中5個枝條的果實套上網(wǎng)袋，用于收集落果。果實生長發(fā)育期每隔20 d左右(2月26日、3月18日、4月7日、4月27日、5月17日)，收集網(wǎng)袋的落果，挑選出果皮完好、果柄青綠的近日脫落的落果，并在每株樹上采集2個無病害、處于相同生長發(fā)育期、大小相似的未脫落果實，樣品采集后立即放入干冰桶中帶回實驗室，保存于-80 ℃的冰箱備用。采集的樣品用于碳水化合物與內源激素含量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 開花結果物候期調查 2020年8月1日選取生長勢一致的白柿10株進行定點觀測，調查時間持續(xù)1年，調查現(xiàn)蕾期、花苞膨大期、初花期(全樹有5%花開放)、盛花期(25%～75%的花開放)、終花期(全部花已開放，并有部分花瓣開始脫落)、謝花期(大量落花至落花完畢)、著果期、果實膨大期、成熟期、抽梢、新梢停止生長等物候期。

1.2.2 落果率調查 選擇開花時間相近、生長狀況相似的5株白柿，從試驗樹的不同方位挑選3個枝條掛牌，進行白柿果實發(fā)育動態(tài)的觀察，在白柿謝花后統(tǒng)計并記錄初始著果數(shù)，之后每隔10 d統(tǒng)計一次剩余果數(shù)直至果實采收，觀察并記錄著果的動態(tài)變化，果實橫、縱徑以及單果質量。統(tǒng)計相對落果率(Relative abscission rate，RAR)與累積落果率(Accumulative abscission rate，AAR)。

其中，相對落果率(RAR)的計算按照如下公式：

RAR(%·d-1)=[(Xt-Xt-1)/Xt·d-1]×100

式中：Xt-1和Xt為相鄰兩個時期的存留果數(shù)，d為兩次觀測時間t和t-1的間隔天數(shù)。

累積落果率(AAR)的計算按照如下公式：

AAR=[(X0-Xt)/X0]×100%

式中：X0為初始著果數(shù)量，Xt為時間t時的著果數(shù)量。

1.2.3 果實發(fā)育動態(tài)調查 自謝花后，選取同一時期生長狀態(tài)一致的白柿果實10個進行標記，每隔10 d測量5個果實的縱、橫徑，直至果實采收。如果果實中途脫落，再從另5個果實中挑選發(fā)育相近的果實補充，繪制果實生長動態(tài)曲線圖。

1.2.4 碳水化合物的測定 可溶性總糖含量測定采用蒽酮比色法。提取待測液：稱取0.2 g果肉粉末置于10 mL離心管中，加入3 mL蒸餾水，90 ℃水浴鍋內水浴加熱30 min，冷卻后8 000 rpm下離心5 min，重復兩次，之后合并上清液，定容至25 mL。

制作標準曲線：配制標準葡萄糖液(100 mg·mL-1)，稀釋成6個梯度濃度的葡萄糖標準溶液(0、10、20、60、80和100 mg·mL-1)，各吸取1 mL標準溶液和2.5 mL蒽酮試劑，混勻后90 ℃水浴鍋內加熱15 min，冷卻后測量625 nm處OD值，繪制標準曲線。樣品的測定：吸取0.1 mL糖提取液，加入0.9 mL蒸餾水和2.5 mL蒽酮試劑于90 ℃水浴鍋內加熱15 min后，測量625 nm處OD值。計算：可溶性總糖含量=經(jīng)標準曲線查得的總糖濃度(μg·mL-1)×樣品稀釋后的體積(mL)/稱取的果肉質量(g)/106×100%。

1.2.5 果實內源激素含量的測定 采用Waters公司的超高效液相三重四級桿質譜聯(lián)用儀(Xevo UPLC-TQD-MS)作為定量檢測儀器。植物內源激素含量所需色譜和質譜條件參數(shù)設定如下：

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；錐孔氣流50 L·h-1；倍增器電壓650 V；碰撞氣(氬氣)0.17 L·h-1；掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM)模式；詳細質譜設置參數(shù)見表1。

表1 內源激素質譜參數(shù)

將GA3、IAA、tZ、ABA和ACC標準品用80%甲醇溶解，配成標準母液待用，再用80%甲醇稀釋7種標準母液，配成1 mg·L-1的混合標準品，上機進行質譜調諧，根據(jù)標準物調諧結果設定最優(yōu)參數(shù)(毛細管電壓、源溫、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流、錐孔電壓、碰撞電壓)。后期對流動相及配比、洗脫方式、洗脫時間、流速大小等參數(shù)進行優(yōu)化，以達到最優(yōu)液相條件。

色譜條件：使用Waters公司XBridgeTMBEH C18色譜柱(3.0 mm×75 mm，2.5 μm)；流動相A：0.1%(V/V)甲酸-水溶液；流動相B：0.1%(V/V)甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

液液萃取外標法依照鹿源生物公司植物內源激素試劑盒中的前處理方法。步驟如下：取凍干后樣品約0.05 g，加入500 μL提取液(異丙醇混合溶劑)；加入2顆鋼珠，研磨機研磨2 min；-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲30 min；加入1 mL氯仿，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲5 min，渦旋振蕩1 min，離心5 min(4 ℃，13 000 rpm)，取下層溶液0.9 mL于EP管，氮吹儀吹干后加入0.2 mL甲醇溶液復溶，過0.22 μm濾膜，上機。

外標法根據(jù)植物內源激素標準品的質譜定性離子片段和出峰保留時間對樣品中的內源激素進行定性，先根據(jù)外標準曲線計算檢測樣品植物激素的濃度，再根據(jù)以下公式計算單位鮮質量內源激素含量：

內源激素含量(ng·g-1FW)=目標物濃度(μg·mL-1)×最終上機體積(μL)/樣品鮮質量(g)

2 結果與分析

2.1 開花結果物侯期調查

觀測結果表明，兩年生本砧“W4”白柿在廣州市天河區(qū)現(xiàn)蕾期12月10—22日，花苞膨大期1月3—17日，初花期1月20—24日，盛花期1月25—31日，2月1—5日進入終花期，2月6—10日謝花期，謝花后果實開始發(fā)育，3月中旬出現(xiàn)第一次落果高峰，4月中旬出現(xiàn)第二次落果高峰，5月下旬出現(xiàn)采前落果，果實在5—6月成熟采收(見表3)。

表3 “W4”白柿開花結果物候期

2.2 白柿果實脫落規(guī)律

“W4”從謝花后至成熟采收前有3次明顯的落果高峰期，其中第一次生理落果期在謝花后40 d左右，第二次生理落果期在謝花后70 d左右，采前落果在謝花后110 d左右。第二次落果高峰期持續(xù)時間較短，且只有一個小增長高峰(見圖1)。在經(jīng)歷了3次落果高峰后，白柿果量約為每枝1～2個，顯著低于白柿記錄的正常產(chǎn)量。從落果量來看，單株果樹標記的5個果穗的總落果數(shù)量高達92個。第一次落果高峰期的大量落果是造成白柿產(chǎn)量低的重要因素。對這一時期落果的果實進行解剖，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)落果果實未形成種子，授粉受精失敗是形成第一次落果高峰期的主要原因。

圖1 白柿的相對落果率與累積落果率

2.3 果實生長發(fā)育動態(tài)

“W4”白柿果實縱徑與橫徑變化如圖2所示。“W4”白柿果實生長曲線符合單“S”型生長曲線，即生長初期果實緩慢增長，中期果實快速生長，生長末期果實生長趨于平緩直至果實成熟?！癢4”白柿自謝花后至謝花后50 d果實生長緩慢，生長初期果實平均每日增長量0.46 mm。謝花后50 d果實開始快速生長，至謝花后100 d，平均每日增長量0.66 mm。謝花后100～140 d進入生長末期，平均每日增長量0.12 mm。

圖2 白柿果實生長發(fā)育期縱、橫徑變化

2.4 落果與正常發(fā)育果實碳水化合物含量的差異

如圖3所示，正常果及脫落幼果的可溶性總糖含量總體上均表現(xiàn)為上升趨勢。正常果的可溶性總糖含量在整個試驗期間均高于脫落幼果。其中在謝花后的第40 d，差異最顯著，正常果的可溶性總糖含量為67.50 mg·g-1FW，比落果高14.26%。

注：*表示在0.05水平差異顯著；**表示在0.01水平差異顯著；***表示在0.001水平差異顯著(t-test，n=5)。圖4至圖9同。

2.5 落果與正常發(fā)育果實內源激素含量的變化差異

2.5.1 赤霉素(GA3) 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的GA3含量差異顯著。如圖4所示，正常發(fā)育與脫落幼果在果實發(fā)育期間，GA3含量變化趨勢大致相同，均呈先上升后下降再上升的趨勢。在此期間，正常發(fā)育果實GA3含量始終高于脫落果實，且均呈顯著差異，在謝花后第60 d正常發(fā)育果實中GA3含量達到最高值，兩者差異最顯著，此時正常發(fā)育果實GA3含量達251.19 ng·g-1FW，是脫落果實的26.17倍。正常果實的GA3含量在第20～60 d呈上升趨勢，第60～80 d急速下降，第80 d達到最低值，第80～100 d緩慢上升。脫落果實的GA3含量在第20～40 d呈上升趨勢，第40～80 d呈下降趨勢，第80 d達到最低值，隨后開始回升，并于第100 d達到最高值，此時脫落果實的GA3含量為38.50 ng·g-1FW。以上結果表明，落果期GA3含量對白柿保果起著重要作用，推測在落果前需補充一定量赤霉素，其中謝花后第60 d及第100 d前進行補充可能會起到較好的效果。

圖4 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的GA3含量

2.5.2 生長素(IAA) 如圖5所示，白柿正常發(fā)育與脫落幼果的IAA含量在不同時期呈先下降再上升的趨勢。在謝花后第20～60 d正常發(fā)育果實中IAA含量顯著高于脫落果實，在第20 d正常發(fā)育果實中IAA含量為最高值，兩者差異最顯著，此時正常發(fā)育果實IAA含量達65.88 ng·g-1FW，是脫落果實的3.59倍。第60～80 d正常發(fā)育果實中IAA含量急劇下降，此時正常發(fā)育果實的IAA含量顯著低于脫落果實。第80～100 d IAA含量開始回升，最終正常發(fā)育果實IAA含量高于脫落幼果，但兩者沒有顯著差異。脫落果實的IAA含量在第20～60 d呈下降趨勢，第60 d達到最低值，隨后開始回升，并于第100 d達到最高值，此時脫落果實的IAA含量為65.88 ng·g-1FW。以上結果表明，白柿第一次大量落果時期的正常果與落果IAA含量存在較大的差異，其中第一次落果高峰前差異最顯著。

圖5 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的IAA含量變化

2.5.3 玉米素(tZ)含量的變化差異 白柿正常發(fā)育與脫落幼果的tZ含量在不同時期呈先上升后下降再上升的趨勢。二者在謝花后第40 d達到各自的最高值，正常果實是脫落果實的3.79倍，二者差異顯著，隨后兩者tZ含量急速下降，正常果實tZ含量的下降幅度高于落果，第80 d達到最低值，第80～100 d小幅回升。試驗期間，正常發(fā)育果實的tZ含量始終高于落果(見圖6)。以上結果表明，第一次及第三次落果期的正常果與落果tZ含量存在較大差異，其中，第一次落果高峰后連續(xù)20 d里，落果的tZ含量均顯著低于正常果。

圖6 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的tZ含量變化

2.5.4 脫落酸(ABA)含量的變化差異 白柿脫落幼果ABA含量在不同時期呈總體上升趨勢，而正常發(fā)育果實總體呈下降趨勢。在謝花后第40～100 d，脫落果實ABA含量顯著高于正常發(fā)育果實。在第100 d時脫落果實ABA含量達到最高值，而正常發(fā)育果實ABA含量達到最低值，此時的脫落果實ABA含量為2 398.12 ng·g-1FW，是正常發(fā)育果實的27.56倍(見圖7)。上述結果表明，在果實發(fā)育的整個時期里，大部分時間脫落果的ABA含量高于正常果，高質量濃度的ABA可能是造成果實脫落的主要因素。

圖7 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的ABA含量變化

2.5.5 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)含量的變化差異 如圖8所示，白柿果實發(fā)育不同時期，脫落幼果的ACC含量始終高于正常發(fā)育果實。在謝花后第20～100 d脫落幼果的ACC含量呈現(xiàn)波浪形趨勢，在第60 d達到最高值(191.99 ng·g-1FW)，顯著高于正常發(fā)育果實，是正常發(fā)育果實的6.23倍。正常發(fā)育果實ACC含量呈先下降再上升趨勢，第20～40 d正常發(fā)育果實ACC含量急劇下降，第40～80 d下降速度變緩，第80～100 d呈上升趨勢。這表明，落果與正常果ACC含量的差異可能是造成果實脫落的因素。值得注意的是，ACC與GA3含量在一些時期呈現(xiàn)相反的趨勢，推測二者在果實脫落過程中起著相反的作用。

圖8 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的ACC含量變化

2.5.6 白柿正常果和脫落果的內源激素比值變化 果實生長發(fā)育期間白柿正常果和脫落果中(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值的變化曲線如圖9所示。從中可知，在整個果實發(fā)育期內脫落果中內源激素的比值顯著高于正常果，正常果中的激素比值曲線變化平穩(wěn)，而脫落果的內源激素比值曲線呈先短暫下降而后又急劇上升再下降的總趨勢。在謝花后的第20～60 d即第一次生理落果期間，脫落果中的內源激素的比值呈緩慢下降后又急劇上升的變化趨勢；謝花后的第60～100 d即第二次生理落果期間，落果中的內源激素的比值又開始呈下降趨勢。但第二次生理落果階段(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值遠高于第一次生理落果階段的比值，這一變化規(guī)律表明，生長促進物質(GA3、IAA、tZ)和生長抑制物質(ABA+ACC)的彼此消長對白柿不同發(fā)育階段的落果現(xiàn)象影響顯著。

圖9 不同時期白柿正常發(fā)育與脫落幼果的內源激素比值變化

3 討論

由于“W4”白柿花藥發(fā)育不全而花粉含量少，嚴重阻礙了其自然授粉，生產(chǎn)上多采用配置授粉樹或人工授粉的方法以保證其充分授粉，但其后期的生理落果仍對白柿產(chǎn)量造成重要影響。糖作為植物生長的能量和碳骨架來源，在調節(jié)植物器官脫落的過程中起著重要作用。有研究表明，荔枝落果中低水平的碳水化合物是誘導其脫落的第一信號，該信號傳遞至脫落部位，從而影響各類植物激素的平衡，進而誘導果實脫落[13]。在白柿果實發(fā)育期間，發(fā)現(xiàn)正常果的可溶性總糖含量顯著高于脫落幼果，說明正常果具有較強的營養(yǎng)富集能力，維持了果實正常發(fā)育所需的營養(yǎng)，保證了果實內部的激素穩(wěn)態(tài)平衡，防止了果實脫落。

植物內源激素的細微變化會影響果實生長發(fā)育，通常乙烯與脫落酸含量增加會促進果實脫落，而果實內的生長促進激素(IAA、GA3、ZT)則有利于著果和果實發(fā)育[14-15]。有關研究表明，荔枝果實中的內源ABA高峰值的出現(xiàn)時間與其落果高峰期對應[16]。蘋果的生理落果是由于其種子和果肉中的生長促進物質合成量少，在量上不足以拮抗由果旁葉在一定季節(jié)內向果肉中輸入與脫落相關的生長抑制物質所致[17]。本研究中，白柿正常果的赤霉素(GA3)和玉米素(tZ)高于脫落幼果，而脫落幼果中的抑制生長激素脫落酸(ABA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)顯著高于正常果。推測低水平的GA3和高水平的ABA可能是誘導白柿果實脫落的主要因素。而脫落果中的(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)之值顯著高于正常果，正常果的比值始終處于相對平穩(wěn)狀態(tài)，而脫落果的比值呈上下波動變化，表明果實中抑制生長與促進生長的兩類激素比值對白柿生理落果有著重要的調控作用。

4 結論

“W4”白柿在廣州地區(qū)種植表現(xiàn)出的開花物候期是從1月下旬至2月初，整個花期約為16 d。果實生長發(fā)育過程中存在3次落果高峰，分別在3月中旬、4月中旬及5—6月，果實的生長符合單“S”型生長曲線。白柿果實發(fā)育期間的生理落果嚴重程度是影響其產(chǎn)量的關鍵因素。在這一時期正常果的可溶性總糖含量顯著高于脫落幼果，而正常果的赤霉素(GA3)和玉米素(tZ)高于脫落幼果，其脫落幼果中的抑制生長激素脫落酸(ABA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)顯著高于正常果，同時脫落果中的(ABA+ACC)/(GA3+IAA+tZ)的比值顯著高于正常果。依據(jù)其內源植物激素缺乏狀況，進而補充相關外源植物激素可能對減少白柿生理落果具有一定效果。