西番蓮花粉活力研究初報(bào)

陳 媚，馮紅玉，徐 麗，劉迪發(fā)，姚碧嬌，符小琴，高 玲

[中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測(cè)試(儋州)分中心，海南儋州，571737]

全球西番蓮屬植物約有520個(gè)種，它們?cè)谛螒B(tài)、農(nóng)藝性狀等方面都存在較為豐富的差異，其遺傳多樣性研究與應(yīng)用起步較晚[1]。1988年，我國(guó)開(kāi)始廣泛引進(jìn)并種植西番蓮，但品種較為單一，遺傳基礎(chǔ)狹窄[2]，育種與規(guī)?；N植受到限制。實(shí)際生產(chǎn)中，西番蓮種質(zhì)資源保護(hù)和新品種培育尤為重要。

西番蓮屬植物大多數(shù)屬于二倍體(Passifloraedulis，2n=2x=18))，是典型兩性花植物，但雌蕊和雄蕊發(fā)育時(shí)間不一致，自花授粉結(jié)果率較低，異花授粉為提高其遺傳多樣性和雜交育種提供了條件。

國(guó)外西番蓮的雜交育種較為活躍，尤其是觀賞西番蓮的種間雜交，而我國(guó)西番蓮資源評(píng)價(jià)與育種起步較晚。芽變是一種簡(jiǎn)易而又有效的選育新品種的方法，但因芽變常源于芽端體細(xì)胞的突變，變異常限于個(gè)別基因的表型效應(yīng)，故芽變育種在變異范圍和幅度上存在一定局限性[3]，僅適于現(xiàn)有品種的修繕和改良，原始創(chuàng)新的突破則需開(kāi)展雜交育種。

近年，我國(guó)西番蓮種內(nèi)雜交、種間雜交工作取得一定進(jìn)展?；ǚ凼侵参锏男叟渥芋w，是開(kāi)花植物遺傳信息的載體和交流工具，是植物有性繁殖過(guò)程所必需的材料[4]。父本具有良好的花粉活力是成功進(jìn)行雜交育種的重要條件[5]。不同品種或不同種的花粉特性不同，熟悉其花粉特性可以提高種質(zhì)創(chuàng)制與雜交育種的效率。因而，檢測(cè)西番蓮屬花粉活力可以提前預(yù)知花粉發(fā)芽可靠程度，對(duì)提高繁殖效率和實(shí)施雜交育種具有非常重要的意義。

阻抗流式細(xì)胞儀法(IFC)是一種利用阻抗流式細(xì)胞儀，無(wú)需染色，實(shí)時(shí)不間斷檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞在電場(chǎng)中的阻抗，以點(diǎn)圖顯示活性花粉百分比率的方法，具有可靠、快速、無(wú)破壞性等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，目前榛子、小麥、玉米等作物上均有應(yīng)用[8-10]。本文使用IFC測(cè)定比較部分西番蓮品種花粉活力，為授粉和花粉收集保存提供參考，從而為西番蓮雜交育種和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年12月16—19日和2021年3月24—26日分別開(kāi)展試驗(yàn)，小黃金1號(hào)Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、大黃金1號(hào)Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、臺(tái)農(nóng)P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、滿天星P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、紅花西番蓮P.miniataVanderplank和紫花西番蓮Passiflora×violaceaVell.等6個(gè)西番蓮品種，來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所十隊(duì)基地西番蓮種質(zhì)資源保存圃。

1.2 儀器

花粉活力分析儀Ampha Z30-Pollen Analyzer，瑞士Amphasys公司產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集 選取發(fā)育正常，當(dāng)天即將開(kāi)花的花朵，從開(kāi)放前開(kāi)始取樣，約2 h取樣1次，每次用鑷子取同朵花上花藥1粒放入1.5 mL離心管中備用。

1.3.2 花粉活力測(cè)定 用移液槍移取緩沖Buffer 0.75 mL至裝有花藥的離心管中，通過(guò)震蕩、輕彈或放入試管架快速撥動(dòng)離心管使花粉分散懸浮于緩沖液中；使用孔徑100 μm過(guò)濾塞將花粉懸浮液過(guò)濾到5 mL樣品管中，再次移取Buffer 0.75 mL沖洗離心管，并將沖洗液過(guò)濾到樣品管中，得到待測(cè)花粉懸浮液；花粉懸浮液靜止平衡2～3 min，重新翻轉(zhuǎn)混勻后立即上樣測(cè)試；測(cè)試得到象限散點(diǎn)圖，通常散點(diǎn)圖分為兩個(gè)明顯類群，當(dāng)出現(xiàn)1個(gè)類群時(shí)，需要同規(guī)格失活對(duì)照確定類群的狀態(tài)，通過(guò)失活對(duì)照準(zhǔn)確區(qū)分測(cè)試樣品的活性類群及失活類群。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)定義坐標(biāo)軸“Phase”(花粉相對(duì)活性)及“Ampl”(花粉相對(duì)大小)范圍調(diào)整象限散點(diǎn)圖到最佳效果；統(tǒng)一測(cè)試樣品坐標(biāo)軸，并根據(jù)散點(diǎn)圖分布情況設(shè)置門(mén)控，門(mén)控左側(cè)為失活花粉粒比例，右側(cè)為活性花粉粒比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力動(dòng)態(tài)變化分析

小黃金1號(hào)大致開(kāi)花時(shí)間為11：00—13：00，閉合時(shí)間為18：00以后。由圖1可知，小黃金1號(hào)在開(kāi)花散粉前至花朵閉合前花粉活力均較強(qiáng)，活性花粉比例均達(dá)到了80%以上，測(cè)試時(shí)間活性花粉比例分別為86.88%、88.30%、94.19%、94.96%和87.13%，其中花粉活力12：00—15：00最強(qiáng)。

圖1 不同時(shí)間小黃金1號(hào)西番蓮失活和活性花粉比較

大黃金1號(hào)開(kāi)花時(shí)間為14：00左右，為取樣方便，從第一次取樣開(kāi)始，將待采花粉花蕾枝條帶回實(shí)驗(yàn)室用自來(lái)水浸泡防止其缺水。由圖2可知，從08：47起至次日15：11，大黃金1號(hào)活性花粉比例分別為51.40%、83.59%、8.18%、39.23%、14.44%?；ǚ刍盍?2：54起驟降，為驗(yàn)證其原因，于次日14：16起，每隔15 min按原取樣方法再?gòu)氖彝馊×?朵花的花粉進(jìn)行測(cè)定，活性花粉比例分別為88.5%、91.75%、91.72%、95.51%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前1天同期測(cè)定的花粉活力，初步推測(cè)大黃金1號(hào)花粉活力對(duì)環(huán)境較為敏感，置于室內(nèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致花粉活力嚴(yán)重下降。同時(shí)也不排除同朵花個(gè)別花藥發(fā)育成熟度低或發(fā)育缺陷(如活性花藥比例8.18%所采用的花藥)。

圖2 不同時(shí)間大黃金1號(hào)西番蓮失活和活性花粉比較

臺(tái)農(nóng)花朵上午未開(kāi)放前便開(kāi)始散粉，并且花粉活力一直保持80%以上高活性，直到18：00后，花朵將閉合前花粉活力迅速降低。經(jīng)觀察，臺(tái)農(nóng)花朵集中開(kāi)放時(shí)間為11：30左右。由圖3可知，不同時(shí)間活性花粉比例分別為86.67%、86.44%、87.85%、86.49%、86.95%、40.5%。

圖3 不同時(shí)間臺(tái)農(nóng)西番蓮失活和活性花粉比較

由圖4可知，滿天星一天的花粉活力明顯呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，13：00花朵開(kāi)放前后達(dá)到最大值。08：24花藥未散粉，此時(shí)花粉活力最低，活性花粉比例為59.56%；10：25活性花粉比例為70.66%；12：21和13：17這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的活性花粉比例較高，分別為87.86%、85.25%；14：28活性花粉比例為82.36%；15：23花粉活力開(kāi)始明顯下降，此時(shí)活性花粉比例為62.76%。

圖4 不同時(shí)間滿天星西番蓮失活和活性花粉比較

紅花西番蓮?fù)ǔＡ璩块_(kāi)花夜晚閉合。取樣時(shí)，第二天將開(kāi)放的花蕾于前一天17：40取花粉進(jìn)行測(cè)定，后面采樣為次日08：00后進(jìn)行，此時(shí)花已完全開(kāi)放。由圖5可知，紅花西番蓮花粉活力呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，10：19活性花粉比例最小，只有38.26%；13：15活性花粉比例最大，為81.77%；其他時(shí)間的活性花粉比例在50%～70%之間。

圖5 不同時(shí)間紅花西番蓮失活和活性花粉比較

紫花西番蓮開(kāi)花時(shí)間在14：00左右，花朵完全開(kāi)放1 h后開(kāi)始散粉，花粉活力在開(kāi)花當(dāng)天始終極低，由圖6可知，各時(shí)間點(diǎn)的活性花粉比例分別為2.7%、4.54%、5.14%、5.97%、6.01%。

圖6 不同時(shí)間紫花西番蓮失活和活性花粉比較

2.2 不同品種花粉活力比較

由表1可知，不同品種西番蓮花粉活力不同。小黃金1號(hào)和臺(tái)農(nóng)活性花粉比例大于80%的時(shí)間最長(zhǎng)，均為08：00—17：00，持續(xù)9 h；而滿天星持續(xù)3 h，大黃金1號(hào)持續(xù)6 h；紅花持續(xù)時(shí)間最短，僅1 h。整體上看，5個(gè)品種花粉活力峰值均在中午至下午出現(xiàn)，臺(tái)農(nóng)和滿天星花粉活力最早達(dá)到峰值，時(shí)間均為12：00—13：00，其次為紅花，再次為小黃金1號(hào)，大黃金1號(hào)最晚。黃果類西番蓮活性花粉比例較高，小黃金1號(hào)為94.96%，大黃金1號(hào)比小黃金1號(hào)稍高，為95.51%，均達(dá)到了90%以上。紫果類西番蓮花粉活性較黃果類稍低，臺(tái)農(nóng)和滿天星的活性花粉最高比例分別為87.85%和87.86%，兩者極為相近。紅花作為觀賞品種，花粉活力較低，活性花粉最高比例為81.77%。供試品種花粉活力衰減的速度也不一樣，紅花的花粉活力衰減速度最快，15：00以后活性花粉比例就已下降至53.20%；滿天星在15：00以后活力花粉也衰減到了63.76%；小黃金1號(hào)花粉活力從16：00以后開(kāi)始衰減，但此時(shí)的活性花粉比例仍高達(dá)87.13%；臺(tái)農(nóng)在18：00以后花粉活力出現(xiàn)明顯衰減，低至40.50%。

表1 不同品種西番蓮花粉活力比較

2.3 不同季節(jié)和不同環(huán)境的影響

分別于2020年12月16—19日和2021年3月24—26日測(cè)定了紅花、小黃金、臺(tái)農(nóng)3個(gè)品種花粉活力，兩個(gè)時(shí)段均為盛花期。從表2可知，2021年3月平均最高溫度31.6 ℃，較2020年12月的平均最高溫度22.2 ℃高9.4 ℃，而2021年3月平均最低溫度也較2020年12月高4.7 ℃，兩個(gè)月份的氣溫相差較大。紅花西番蓮2021年3月的花粉活性與2020年12月差異明顯，2020年12月10：00至16：00左右活性花粉比例一直保持在85%以上，比2021年3月測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的活性花粉比例都高。2021年3月，紅花活性花粉比例在15：17便出現(xiàn)了急劇下降，而2020年12月的活性花粉比例在16：13仍保持87.02%。說(shuō)明2020年12月紅花西番蓮花粉活力較2021年3月高。小黃金1號(hào)花粉活力在2021年春季和2020年冬季相鄰時(shí)間段差異不明顯；2021年春季的臺(tái)農(nóng)花粉活力稍高于2020年冬季，這反映了不同品種西番蓮的花粉活力對(duì)溫度變化的敏感性不同。

表2 不同季節(jié)不同品種西番蓮花粉活力比較

2020年12月19日分別取簡(jiǎn)易網(wǎng)室和露地種植的紅花西番蓮測(cè)定花粉活力，由圖7可知，露地種植的各時(shí)間點(diǎn)活性花粉比例均比網(wǎng)室種植高；露地種植的活性花粉比例80%左右，而網(wǎng)室種植的活性花粉比例70%及以下。網(wǎng)室種植的活性花粉比例呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，9：00活性花粉比例最低，為62.28%，10：30達(dá)到最大，為70.01%；露地種植的活性花粉比例變化趨勢(shì)一致，與網(wǎng)室不同的是出現(xiàn)了第二次下降的拐點(diǎn)，9：30活性花粉比列最低，為78.89%，8：30和10：00較高，分別為85.03%和85.01%。

圖7 不同種植環(huán)境下紅花西番蓮活性花粉變化

3 結(jié)論與討論

自然條件下，西番蓮花粉壽命極短，常在花后第二天便失去活力，因而花粉采集與貯藏顯得尤為重要。確定花粉最佳采集時(shí)期，保證花粉最佳成熟度，是決定貯藏花粉活力保持較高水平以及后續(xù)雜交育種成功的關(guān)鍵[11]。供試6個(gè)品種中，除紫花西番蓮?fù)猓渌贩N花粉活力均在花朵完全開(kāi)放前后達(dá)到峰值，這就是花粉采集最佳時(shí)間。小黃金1號(hào)和大黃金1號(hào)活性花粉比例最高可達(dá)90%以上，分別為94.96%和95.51%。不同品種西番蓮花粉發(fā)育進(jìn)程不同，其活力的持續(xù)時(shí)間也不同。小黃金1號(hào)和臺(tái)農(nóng)花粉活力持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，08：00—17：00之間均保持80%以上的高活力，活性花粉比例80%以上的其他品種持續(xù)時(shí)間分別是大黃金1號(hào)6 h，滿天星3 h，紅花僅1 h。對(duì)于紅花西番蓮而言，適當(dāng)?shù)蜏赜欣谄浔３州^高的花粉活力；另外，露地種植環(huán)境下其花粉活力明顯高于網(wǎng)室種植。

花粉活力主要受遺傳因素影響，環(huán)境溫度和相對(duì)濕度也是影響花粉活力的重要因子[12-13]。李鳳榮[14]等指出，植物花粉在低溫條件下可以保持較高的活力。本研究中，紅花西番蓮花粉活力2020年冬季明顯比2021年春季高，而且活力持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，這與前人的研究結(jié)果一致；小黃金1號(hào)在這兩個(gè)季節(jié)花粉活力未出現(xiàn)明顯差異；臺(tái)農(nóng)2021年春季的花粉活力比2020年冬季略高，但差異不明顯。這說(shuō)明不同溫度對(duì)不同品種西番蓮花粉活力影響不同。此外，露地種植與網(wǎng)室種植的紅花西番蓮花粉活力差異明顯，露地種植溫度低、濕度高，網(wǎng)室種植溫度高、濕度低，光照強(qiáng)度也不相同，這些可能是影響花粉活力不同的主要因素；也可能由于長(zhǎng)期的露地種植使紅花西番蓮產(chǎn)生較強(qiáng)的抗逆能力，使其具有保持較高花粉活力的能力，有待于進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)當(dāng)前西番蓮主栽品種和觀賞品種花粉收集時(shí)間和田間授粉實(shí)踐有一定的參考價(jià)值；對(duì)不同季節(jié)花粉活力進(jìn)行了比較，但花粉取自同朵花單個(gè)花藥，同朵花中不同花藥的花粉發(fā)育程度理論上最為相似，但每一批次開(kāi)放的花朵個(gè)體間存在差異，營(yíng)養(yǎng)條件也會(huì)影響花藥發(fā)育質(zhì)量，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。下一步研究中，將采集相同生育時(shí)期不同花朵花粉混合后測(cè)定，一方面增強(qiáng)花粉的代表性，另一方面增加測(cè)定時(shí)間點(diǎn)，增加至8～10個(gè)時(shí)間點(diǎn)，更好地探索部分材料出現(xiàn)二次拐點(diǎn)的原因。對(duì)于一些品種，如紫花西番蓮在花朵開(kāi)放當(dāng)天花粉活力極低，花朵開(kāi)放前后1 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間會(huì)出現(xiàn)活力峰值可作為今后研究方向。