榴蓮蜜實時熒光定量PCR內參基因的克隆與篩選

郭清云，胡福初，吳鳳芝，王祥和，范鴻雁，馮學杰，陳 哲

(海南省農業(yè)科學院熱帶果樹研究所/海南省熱帶果樹生物學重點實驗室/農業(yè)部?？跓釒Ч麡淇茖W觀測實驗站，?？?，571100)

實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是鑒定基因功能和分析分子機制的主要工具。然而，在基因轉錄水平研究中，模板cDNA 的質量和數(shù)量、RNA質量、cDNA合成效率、引物特異性和內參基因穩(wěn)定性等因素都會影響RT-qPCR分析結果的準確性[1]，其中以內參基因穩(wěn)定性的影響最大。利用內參基因對目的基因表達量進行校準，是確保定量結果準確可信必不可少環(huán)節(jié)[2]。值得注意的是，由于試驗品種、組織、發(fā)育時期及處理條件等因素不同，最佳的內參基因也會有所不同[3-5]。李露雙等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在屏邊空竹不同組織器官(根、稈和葉)以及筍芽發(fā)育成筍的變化過程中，表達最穩(wěn)定的基因均不相同。李永平等[7]在篩選黃秋葵內參基因時發(fā)現(xiàn)，6個候選內參基因在不同組織、各發(fā)育階段及不同脅迫(低溫、高溫和干旱)下均有表達，但表達穩(wěn)定性不盡相同。因此，有必要依據(jù)實驗要求選擇最適的內參基因。

榴蓮蜜Artocarpusinteger(Thunb.)Merr.，屬?？颇静ぬ}屬熱帶特色果樹，我國主要在南方種植[8]，目前海南省實現(xiàn)了規(guī)?；N植。榴蓮蜜果肉柔軟芬芳，營養(yǎng)豐富，素有“水果皇后”之美譽[9]。國內外關于榴蓮蜜的研究尚處于起步階段，主要集中于引種試種[8]、品種選育[10]、快繁技術[11]、栽培管理[9，12]、果實品質和風味[13]、以及功能性成分[14]等基礎性研究上，隨著國內外對榴蓮蜜研究的不斷關注，基因表達相關等分子生物學研究會逐漸成為重點內容。至今鮮見關于菠蘿蜜屬植物內參基因評價的研究。汪永保等[15]研究了5個內參基因在菠蘿蜜各個組織不同發(fā)育階段的表達情況，分別在果實、嫩葉和花序中找到表達最穩(wěn)定的內參組合。篩選榴蓮蜜內參基因對豐富其內參基因及解析相關基因功能研究具有重要意義。我們根據(jù)獲得的榴蓮蜜轉錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)，篩選并克隆獲得Actin1等5個傳統(tǒng)內參基因，以“多異1號”榴蓮蜜不同組織及不同發(fā)育時期果苞為材料，利用4種主流軟件(GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)評價5個內參基因穩(wěn)定性，并驗證內參基因的穩(wěn)定性，旨在篩選適用于榴蓮蜜不同組織和不同發(fā)育時期果苞穩(wěn)定表達的內參基因，為進一步研究榴蓮蜜基因表達調控分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

“多異1號”榴蓮蜜種植于海南省農業(yè)科學院永發(fā)果樹科研創(chuàng)新基地榴蓮蜜種質資源圃內，東經109°5′～110°15′，北緯19°23′～20°01′。選擇樹齡相同、長勢相當?shù)?株樹，每株樹分別采集花序、嫩葉和莖組織，以及3個發(fā)育階段果實，即幼果(花后40 d)、小果(花后80 d)和大果(花后120 d)果肉，樣品采集后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 采用植物RNA提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司產)提取樣品總RNA，用核酸蛋白儀檢測總RNA純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度。參照MonAmpTM2×Taq Mix(+Dye)試劑盒(莫納生物科技有限公司產)說明書，每個樣品取總RNA 600 ng進行逆轉錄試驗，合成cDNA第一鏈。

1.2.2 引物設計 選取擬南芥常用的5個內參基因，即Actin，AT3G46520；GAPDH，AT1G13440；α-TUB，AT5G19770；β-TUB，AT5G23860；UBQ，AT1G55060，利用本地BLAST在榴蓮蜜轉錄組數(shù)據(jù)中篩選比對出候選榴蓮蜜內參基因序列10個，分別命名為Actin1、Actin2、GAPDH1、GAPDH2、α-TUB1、α-TUB2、β-TUB1、β-TUB2、UBQ1和UBQ2。利用Oligo 7軟件分別設計各個內參基因的克隆引物(見表1)，以合成的cDNA第一鏈為模板，采用Phanta Max Supper-Fidelity DNA Polymerase高保真酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司產)進行常規(guī)PCR擴增，產物經純化、回收后連接至pTOPO-Blunt平末端克隆載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞(上海唯地生物技術有限公司產)，經篩選陽性克隆后送天一輝遠生物科技有限公司(廣州)測序。參照RT-qPCR 引物設計原則，根據(jù)克隆獲得內參基因序列，利用Oligo 7軟件設計qPCR反應引物(見表2)，并委托天一輝遠生物科技有限公司(廣州)合成。

表1 榴蓮蜜內參基因的克隆引物

1.2.3 半定量PCR 使用MonAmpTM2×Taq Mix(+Dye)，于PCR儀(型號BIO-RAD T100tm)進行反應。配制20 μL反應體系，其中，MonAmpTM2×Taq Mix(+Dye)10 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 8.5 μL。反應程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個循環(huán)；72 ℃ 5 min；保存于4 ℃。取PCR產物5 μL進行凝膠電泳檢查。

1.2.4 RT-qPCR分析及引物擴增效率 配制10 μL反應體系：2 ×Phanta Mix Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL(稀釋2倍)，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 3 μL，每個反應設置3次重復。在熒光定量PCR儀(型號LightCycler 480 Ⅱ)上設置反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，40個循環(huán)；之后進行65～97 ℃熔解曲線分析。每個樣品設置3個重復，取等量樣品的cDNA模板混合，然后按1∶10梯度稀釋為6個濃度后進行RT-qPCR反應。根據(jù)Ct值建立線性回歸方程，最后求得擴增效率E(E=10-1/K-1，K為斜率)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 利用geNorm[16]、NormFinder[17]和BestKeeper[18]評價5個內參基因的表達穩(wěn)定性，最后通過RefFinder[19]在線工具(https：//heartcure.com.au/reffinder/)綜合評價內參基因的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取

由圖1可知，提取的總RNA條帶清晰，28s RNA的亮度約為18s RNA亮度的2倍，所有待測樣品RNA濃度70～870 ng/μL，A260/A280值在1.8～2.0之間，A260/A230均大于2.0。說明提取的RNA無明顯降解，且純度較高。

注：M為DL2000 DNA Maker，1～3為花序，4～6為嫩葉，7～9為莖，10～12為幼果，13～15為小果，16～18為大果。

2.2 內參基因RT-qPCR引物評價

從10個內參同源基因(Actin1、Actin2、α-TUB1、α-TUB2、β-TUB1、β-TUB2、GAPDH1、GAPDH2、UBQ1和UBQ2)中成功克隆出5個內參基因，分別為Actin1、α-TUB1、β-TUB1、β-TUB2和GAPDH1。測序驗證表明，克隆的5個內參基因片段均與榴蓮蜜轉錄組序列高度同源，5對引物的擴增效率介于94.1%～119.0%，R2值介于0.993 0～0.998 9。以榴蓮蜜花序cDNA為模板，對克隆出的內參基因進行半定量PCR擴增。電泳結果顯示，產物只有單一的條帶，且條帶大小與目標片段一致，長度138～186 bp(見圖2和表2)。另外5個內參基因引物的RT-qPCR 熔解曲線均為單一信號峰(見圖3和圖4)。表明本研究所用的定量引物的特異性良好。

注：M為DL2000 DNA Maker，1～5分別為GAPDH1、α-TUB1、β-TUB2、Actin1、β-TUB1。

表2 榴蓮蜜定量引物信息、擴增效率及相關系數(shù)

圖3 榴蓮蜜4個內參基因的熔解曲線

圖4 榴蓮蜜1個內參基因的熔解曲線

2.3 內參基因轉錄水平分析

由表3可知，5個內參基因在不同組織中的平均Ct值在23.64～27.92之間，波動范圍較大。同一組織中5個內參基因的Ct值存在顯著性差異，說明所選擇的內參基因在不同組織中表達水平不同。Ct值與基因的表達豐度成反比，因此，GAPDH1的Ct值21.00～26.54，較低，表達量最高；而Actin1的Ct值26.16～29.8，較高，其表達量最低，顯著低于其他內參基因。5個內參基因的變異系數(shù)從低到高依次為β-TUB2<α-TUB1

表3 榴蓮蜜不同組織內參基因表達情況

2.4 內參基因穩(wěn)定性評價

由表4可知，運用geNorm分析，所有樣品中Actin1和α-TUB1的表達最穩(wěn)定，GAPDH1的穩(wěn)定性最差。不同組織(花序、莖和嫩葉)中，同樣也是Actin1和α-TUB1的表達最穩(wěn)定，而β-TUB1的穩(wěn)定性最差。由于Actin1在所有組織中的表達量均最低，說明Actin1作為內參基因不可行。在果苞發(fā)育的不同時期，α-TUB1和β-TUB1的表達最穩(wěn)定，GAPDH1的穩(wěn)定性最差。由圖5可看出，在不同組織、果苞發(fā)育不同時期中，V2/V3、V3/V4 和V4/V5值均低于默認值0.15，表明選用2個內參基因即可使試驗結果準確可靠，無需引入其他內參基因。

表4 不同軟件分析的榴蓮蜜內參基因表達穩(wěn)定性和RefFinder進行綜合比較

圖5 基于geNorm的內參基因穩(wěn)定性分析及配對差異分析

運用NormFinde軟件分析，所有樣品中，β-TUB1和β-TUB2的穩(wěn)定性較好，GAPDH1的穩(wěn)定性最差；不同組織中，β-TUB2的穩(wěn)定性最好，β-TUB1的穩(wěn)定最差；在果苞不同發(fā)育時期，α-TUB1和β-TUB1的穩(wěn)定性較好，GAPDH1的穩(wěn)定性最差。

運用BestKeeper軟件分析，α-TUB1和β-TUB2在所有樣品及不同組織中穩(wěn)定性均較好，GAPDH1的穩(wěn)定性最差。然而，果苞發(fā)育不同時期中GAPDH1穩(wěn)定性最好。

由于geNorm、NormFinde和BestKeeper分析得出的基因穩(wěn)定性不同，所以采用RefFinder對這3種軟件結果進行綜合排名看出，在不同組織中，β-TUB2和α-TUB1排前，穩(wěn)定性較好；在果苞不同發(fā)育時期，β-TUB1和α-TUB1的穩(wěn)定性較好；所有樣品中，β-TUB2和α-TUB1的穩(wěn)定性較好。

綜合來看，α-TUB1在榴蓮蜜不同組織中均較穩(wěn)定，在榴蓮蜜果苞發(fā)育過程中，可選擇β-TUB1和α-TUB1作共同內參基因。

2.5 內參基因穩(wěn)定性驗證

以穩(wěn)定性較好的α-TUB1、α-TUB1+β-TUB1及α-TUB1+β-TUB2分別作為內參基因，分析成花基因(TEM1和SPA1)以及蔗糖合成酶基因(SUS1、SUS2、SUS3和SUS4)分別在不同樣本中的表達情況。由圖5可知，2個成花基因和4個SUS基因各自在不同內參基因標定下的表達趨勢基本一致。以α-TUB1和α-TUB1+β-TUB2作內參基因，TEM1在嫩葉和莖中的相對表達量最低，在果苞發(fā)育階段最高，而SPA1的表達模式正好與之相反。這與TEM1及SPA1分別在開花時間調控位點的作用基本吻合。在α-TUB1+β-TUB1標定下，嫩葉中TEM1的相對表達量顯著上調，而果苞發(fā)育階段中TEM1的相對表達量變化規(guī)律與以α-TUB1以及α-TUB1+β-TUB2標定下的相似，這種差異與RifFinder綜合評價結果相符，說明α-TUB1+β-TUB1更適合在果苞階段作為內參基因。SUS1、SUS2和SUS3表達量均在嫩葉中顯著下調。與其余3個SUS不同，SUS4在嫩葉中的表達量較高。另外，隨著果苞發(fā)育成熟，SUS4的表達量逐漸降低，而SUS1、SUS2和SUS3呈先增加后降低的趨勢。這說明4個SUS基因的表達部位與表達時間存在差異。

注：A和D以α-TUB1為內參基因，B和E以α-TUB1+β-TUB1為內參基因，C和F以α-TUB1+β-TUB2為內參基因。不同小寫字母表示顯著差異(p<0.05)。

因此α-TUB1和α-TUB1+β-TUB2可作為榴蓮蜜不同組織中的內參基因進行功能基因表達研究；而僅對果苞功能基因進行表達研究時，可選擇α-TUB1、α-TUB1+β-TUB1或α-TUB1+β-TUB2作為內參基因。

3 結論與討論

本研究克隆獲得榴蓮蜜Actin1、α-TUB1、β-TUB1、β-TUB2和GAPDH1基因，分析了這5個候選內參基因在榴蓮蜜不同組織中的表達穩(wěn)定性，結合4個軟件的分析結果及內參基因穩(wěn)定性驗證，發(fā)現(xiàn)β-TUB2和α-TUB1是所有測試樣本中及不同組織中(花序、莖和嫩葉)表達最穩(wěn)定的基因，β-TUB1和α-TUB1在榴蓮蜜果苞發(fā)育過程中表達最穩(wěn)定。這為開展榴蓮蜜基因表達分析提供了參考和依據(jù)。

基因表達是鑒定基因功能和分析分子機制的重要手段。RT-qPCR是一種精確、穩(wěn)定、靈敏的基因表達檢測技術。合適的內參基因是RT-qPCR準確分析基因表達模式的重要前提。不同品種、同品種不同組織及不同脅迫作用下同組織，適合的內參基因會有所不同。3個不同類型桃品種中，ACTIN是“Hakuho”(果肉溶質型))品種最穩(wěn)定的內參基因，UBC是“Fantasia”和“NJC108”(果肉不溶質型)品種最穩(wěn)定的內參基因，而EF-1α是“霞脆”(硬肉型)品種最穩(wěn)定的內參基因[20]。Actin是火龍果不同組織和果實發(fā)育階段表達最穩(wěn)定的基因[21]。蓮霧果肉和果皮中表達穩(wěn)定的分別是ACT-7和α-TUB基因[22]。高溫和鹽脅迫處理的碭山酥梨葉片中表達穩(wěn)定的是UBQ，而低溫脅迫處理的葉片中表達穩(wěn)定的是TUB和WDP[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，榴蓮蜜組織類型及果苞發(fā)育階段顯著影響5個候選內參基因的轉錄水平。其中，α-TUB1在花序中的轉錄水平最高，β-TUB1在花序和幼果中的轉錄水平較高，GAPDH1則在果苞中的轉錄水平較高。因此需針對特定物種、試驗環(huán)境的需求開發(fā)并篩選出最適的內參基因[24-25]。多項研究表明，將轉錄組測序結果與定量分析相結合可以快速篩選到合適的內參基因[7，26-27]。楊丹等[19]發(fā)現(xiàn)，根據(jù)材料自身轉錄組基因序列設計的引物特異性更好。Santos等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥Arabidopsisthaliana中，大多數(shù)通過轉錄組數(shù)據(jù)篩選的自定義內參基因比傳統(tǒng)內參基因表達更穩(wěn)定。本研究通過榴蓮蜜轉錄組數(shù)據(jù)，克隆獲得榴蓮蜜5個候選內參基因Actin1、α-TUB1、β-TUB1、β-TUB2和GAPDH1，并對其表達穩(wěn)定性進行評價。

目前geNorm、NormFinder及BestKeeper軟件是評估內參基因穩(wěn)定性最常用的軟件[29-31]。由于這3種軟件的統(tǒng)計學原理和算法不同，最終的分析結果可能會存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，利用這3種軟件分析得到的內參基因穩(wěn)定性結果不完全一致，前人研究也有類似現(xiàn)象[22，32-33]。因此，為篩選最適的內參基因，提高結果可信度，利用RifFinder軟件進行綜合分析和排名。結果表明，在榴蓮蜜花序、莖和嫩葉中，最穩(wěn)定的內參基因為β-TUB2和α-TUB1，另外β-TUB1和α-TUB1在榴蓮蜜果苞發(fā)育過程中最穩(wěn)定。α-TUB和β-TUB作為細胞器骨架的基本組分，對維持生物體生命活動有重要作用[34]。有研究報道，β-TUB在琯溪蜜柚不同組織和果實發(fā)育不同時期表達最穩(wěn)定[35]，珙桐的根、莖、葉中穩(wěn)定表達的是β-TUB[33]。這與本研究結果相似。但并非所有同源基因表達模式相似。本研究中，β-TUB1和β-TUB2為榴蓮蜜的2個同源基因，在不同組織中β-TUB2的綜合排名首位，表達最穩(wěn)定，而β-TUB1的穩(wěn)定性最差；果苞發(fā)育過程中，β-TUB1和β-TUB2的綜合排名與之相反。這說明即使同一組織中，內參基因雖互為同源基因，但它們的表達穩(wěn)定性也會有顯著差異。

榴蓮蜜作為一種新興熱帶果樹，國內外相關研究剛剛起步。糖信號和成花相關基因一直是研究熱點，而榴蓮蜜這一方面的研究鮮見報道。因此本研究選擇了成花基因和蔗糖合成酶基因作為驗證基因，初步分析其在不同組織中的表達模式，也可為今后相關分子機理研究打下基礎。TEM1是開花抑制因子，能結合成花素FT啟動子抑制其表達，而且還可以抑制GA合成酶基因GA3OX1和GA3OX2的表達，從而抑制 GA依賴的開花路徑[36]。TEM1在花序和莖中的相對表達量最低，在果苞發(fā)育階段最高，推測源于莖中及花序自身積累的TEM1表達量減少，有助于榴蓮蜜開花。SPA1參與隱花色素對去黃化作用的調控，可激活下游成花起始轉錄調控子CO的表達，進而激活FT的表達，促進開花[37-38]。4個SUS在參與調控蔗糖分配過程中發(fā)揮不同功能，具有發(fā)育和組織特異性。SUS1、SUS2和SUS3在花序、莖、幼果及小果果苞中表達較高，SUS4在花序、嫩葉和莖中表達較高。由于蔗糖合成酶催化蔗糖轉化為果糖和尿苷二磷酸葡萄糖是一個可逆反應，因此明確不同SUS的作用還需將其與不同組織和果苞發(fā)育過程中糖分積累變化規(guī)律結合分析。