甲硝唑凝膠微生物限度檢查方法適用性研究

馮 璐，曹 敏，鈕曉淑，張姝麗，柏大為△

（1.江蘇省泰州市藥品檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

藥品微生物控制是保障藥品安全性的重要措施［1］，藥品的微生物限度檢查對(duì)于控制藥品質(zhì)量和制劑安全性至關(guān)重要。甲硝唑凝膠為局部外用類藥物，適用于炎性丘疹、膿皰瘡或酒糟鼻、紅斑等治療?？筛鶕?jù)2020年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105-1107項(xiàng)下要求，建立其微生物檢查方法。但進(jìn)行微生物限度檢查前，需消除樣品本身的抑菌性［2］。本品輔料中所含卡波姆是凝膠劑中應(yīng)用較廣的一種基質(zhì)［3］，具有對(duì)皮膚親和、易涂抹、不具油膩性、釋藥迅速等特點(diǎn)，被用作局部外用類藥品［4］的輔料，而其黏合度易受酸堿度、金屬離子等影響。薄膜濾過(guò)時(shí)，由于甲硝唑凝膠中卡波姆的存在，稀釋液中形成膠體溶液，堵塞薄膜，導(dǎo)致供試液不能經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，難以沖洗，從而影響該檢查。為消除這部分影響并選取最適宜的濾過(guò)方法，選取硫酸鎂與供試液中的卡波姆絡(luò)合，從而形成沉淀以方便過(guò)膜。為更好地體現(xiàn)不同方法對(duì)具有抑菌性類藥物微生物限度檢查的適用性，本研究中另采用常規(guī)平皿法和中和劑法進(jìn)行探討?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與菌株

儀器：SHP-250型生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，精度為0.1℃）；QUINTIX1102-1CN型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，精度為0.01 g）；HTY-APL01型集菌儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；1300 SERIES A2型生物安全柜（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

試藥：甲硝唑凝膠（江蘇知原藥業(yè)有限公司，批號(hào)為200350，規(guī)格為20 g∶0.15 g）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)為1091715）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1085674）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為1086275）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1086835）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1091355）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為2006045），均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，規(guī)格均為每瓶250 g。

菌株：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］、白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］、黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

菌液：按照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》［5］通則1105及1106要求，取上述試驗(yàn)菌經(jīng)培養(yǎng)后制成適宜濃度的菌液。

供試品溶液：稱取樣品10 g，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液Ⅰ；稱取樣品10 g，加入含3%吐溫80和0.3%卵磷脂［6-7］的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）供試品溶液Ⅱ；取樣品10 g，置裝有6～10顆玻璃珠的錐形瓶?jī)?nèi)，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉（含0.5%，1%，3%硫酸鎂）溶液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液，靜置沉淀，取上清液，即得供試品溶液Ⅲ。

2.2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 常規(guī)法（平皿法）及中和劑法

試驗(yàn)組：取2.1項(xiàng)下供試品溶液Ⅰ或Ⅱ各5份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入5種菌的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量均不大于100 cfu/mL。分別取適量，注入2個(gè)平皿，每皿1 mL。分別注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（其中前3種菌株僅以前一培養(yǎng)基培養(yǎng)），分別置30～35℃及20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

供試品對(duì)照組：取2.1項(xiàng)下供試品溶液適量，以稀釋液（0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，下同）代替菌液，同試驗(yàn)組操作。

菌液對(duì)照組：取不含中和劑（聚山梨酯80，下同）及滅活劑的相應(yīng)稀釋液適量代替供試品溶液，按試驗(yàn)組操作，加入菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

取上述3組溶液，分別檢測(cè)5種菌株含菌量，計(jì)算回收比。試驗(yàn)組的回收比=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1及表2（表中左列數(shù)據(jù)為使用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基得到，右列數(shù)據(jù)為使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基得到）。

表1 常規(guī)法試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the recovery test of test microorganisms by the conventional method

表2 中和劑法試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the recovery test of test microorganisms by the neutralization method

2.2.2 薄膜過(guò)濾法

試驗(yàn)組：取2.1項(xiàng)下供試品溶液Ⅲ（含0.5%，1.0%，3.0%硫酸鎂）各5份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入5種菌的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量不大于100 cfu/mL。取適量，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，以pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，取出濾膜，貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，分別置30～35℃及20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

稀釋液對(duì)照組：取等體積含中和劑或滅活劑的稀釋液代替供試品溶液Ⅲ，同試驗(yàn)組操作。

供試品對(duì)照組與菌液對(duì)照組：操作同2.2.1項(xiàng)下相應(yīng)組的要求。

取上述4組溶液，分別檢測(cè)5種菌株含菌量，計(jì)算回收比。試驗(yàn)組回收比的計(jì)算公式同2.2.1項(xiàng)，中和劑或滅活劑的回收比=中和劑或滅活劑對(duì)照組菌落數(shù)/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

2.2.3 改良薄膜過(guò)濾法

常規(guī)法中，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收比均為0，不達(dá)標(biāo)。加入中和劑后，金黃色葡萄球菌回收比為0.79，符合規(guī)定（0.5～2.0）；枯草芽孢桿菌回收比為0.70，需進(jìn)一步改進(jìn)。現(xiàn)在2.2.2項(xiàng)薄膜過(guò)濾法基礎(chǔ)上，選擇供試品溶液Ⅲ，沖洗液為pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（100 mL、300 mL、500 mL），稀釋劑對(duì)照組對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。據(jù)此選擇0.9%氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂），沖洗液為pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（300 mL），進(jìn)行5種試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 改良薄膜過(guò)濾法枯草芽孢桿菌回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the recovery test of Bacillus subtilis by the modified membrane filtration method

表4 改良薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)菌回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the recovery test of test microorganisms by the modified membrane filtration method

由表1可見(jiàn)，霉菌（黑曲霉）、酵母菌（白色念珠菌）總數(shù)采用常規(guī)法檢測(cè)時(shí)回收比符合規(guī)定，故無(wú)須使用薄膜過(guò)濾法。試驗(yàn)組取加0.9%無(wú)菌氯化鈉（含0.5%硫酸鎂）溶液制備的供試品溶液Ⅲ6份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入白色念珠菌和黑曲霉的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量不大于100 cfu/mL，其余各組操作同2.2.1項(xiàng)下常規(guī)法相應(yīng)組要求。取適量，各注入2個(gè)平皿，每皿1 mL。注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 平皿法白色念珠菌及黑曲霉回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the recovery test of of Candida albicans and Aspergillus niger by the plate-count method

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液制備

取樣品10 g，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂）至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液，靜置沉淀，取上清液，即得供試品溶液Ⅳ。

2.3.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗(yàn)證

常規(guī)法：取供試品溶液Ⅳ10 mL，置200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入含菌量不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液于培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后，取培養(yǎng)物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，依法檢查。結(jié)果前一培養(yǎng)基清澈，后一培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)。

薄膜過(guò)濾法：取供試品溶液Ⅳ10 mL，薄膜濾過(guò)，沖洗液為pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（300 mL），薄膜置200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入含菌量不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液，于培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后按常規(guī)法操作。結(jié)果前一培養(yǎng)基渾濁，后一培養(yǎng)基上有典型菌落生長(zhǎng)。

2.3.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗(yàn)證

采用常規(guī)法和薄膜過(guò)濾法（操作同2.3.2項(xiàng)，僅甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基換成溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基）。結(jié)果無(wú)論采用常規(guī)法還是薄膜過(guò)濾法，前一培養(yǎng)基均出現(xiàn)渾濁，后一培養(yǎng)基上均有典型菌落生長(zhǎng)。

2.4 最佳微生物限度檢查方法

供試品溶液：取樣品10 g，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂）至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液Ⅴ，靜置沉淀，取上清液，備用。

需氧菌總數(shù)檢測(cè)溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液1 mL，采用薄膜過(guò)濾法，以300 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，取出濾膜，貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

霉菌和酵母菌總數(shù)檢測(cè)溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液2 mL，注入2個(gè)平皿，每皿1 mL。注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

控制菌檢測(cè)溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液10 mL，采用薄膜過(guò)濾法，以300 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，取出濾膜，接種于200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置規(guī)定培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)。

3 討論

甲硝唑凝膠為凝膠類制劑，具有較強(qiáng)的抑菌活性，故在試驗(yàn)中需要優(yōu)先考慮消除藥品自身的抑菌性。本試驗(yàn)中采取加入中和劑和薄膜過(guò)濾的方法，為了更有效對(duì)比其中差異，另做常規(guī)法進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。結(jié)果顯示，常規(guī)法中均有試驗(yàn)組的回收比低于0.5，不符合藥典的要求，不能建立行之有效的需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法，且不同來(lái)源、不同濃度的中和劑聚山梨酯80對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用差異較大［8］，導(dǎo)致方法重復(fù)性較差，故采用薄膜過(guò)濾法。而在進(jìn)行薄膜過(guò)濾法時(shí)，由于藥品中存在卡波姆［9］，會(huì)堵塞濾膜，導(dǎo)致無(wú)法正常過(guò)濾。對(duì)此，可采用金屬離子絡(luò)合形成沉淀的方法解決。

在消除供試品溶液抑菌活性的同時(shí)，還可對(duì)相應(yīng)方法進(jìn)行改進(jìn)。1）需考慮供試品溶液制備步驟及方法對(duì)微生物的損耗程度［10］。加入0.5%硫酸鎂后，可適當(dāng)增加沉淀時(shí)間，取上清液更有效。選用靜置而非離心取上清，是為了避免對(duì)微生物造成損傷［11］。但靜置時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則可能導(dǎo)致微生物繁殖或死亡［12］。2）因pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液會(huì)與金屬離子產(chǎn)生沉淀，影響過(guò)膜，故選取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為稀釋劑制備供試品溶液［13］。3）聯(lián)用中和劑法與薄膜過(guò)濾法，加入硫酸鎂前，先加入中和劑充分混勻供試品溶液。4）沖洗濾膜的過(guò)程中，理論上沖洗量越大更能消除抑菌性，但考慮到實(shí)際操作的瑣碎，本著簡(jiǎn)易便捷、快速準(zhǔn)確的原則，選取300 mL為適宜沖洗量，可少量多次沖洗，每次沖洗50～100 mL，以達(dá)到最理想效果［14］。5）沖洗過(guò)程中，需要邊振搖邊沖洗，從而使藥物充分洗脫［15］。

本研究中開(kāi)展薄膜過(guò)濾法前，為探尋最合適的沖洗量及硫酸鎂的體積分?jǐn)?shù)，以枯草芽孢桿菌為敏感菌，加入3種濃度的硫酸鎂，再分別以3種沖洗量做對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸鎂體積分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%時(shí)，試驗(yàn)菌回收比大多符合標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)際操作過(guò)程中，由于考慮薄膜過(guò)濾法帶來(lái)的煩瑣操作，且對(duì)比發(fā)現(xiàn)0.5%硫酸鎂為破膠劑時(shí)濾過(guò)更容易。故擇優(yōu)選取以0.5%硫酸鎂作為破膠劑，300 mL為沖洗量，作為甲硝唑凝膠薄膜過(guò)濾法的條件。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)法時(shí)霉菌和酵母菌總數(shù)的回收比符合規(guī)定，在實(shí)際操作中，僅制備1次供試液進(jìn)行檢驗(yàn)最合理，故采用供試品溶液Ⅲ，再次進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)的回收試驗(yàn)，驗(yàn)證霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定亦可通過(guò)常規(guī)法進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，本研究中利用硫酸鎂與凝膠中的卡波姆（丙烯酸交鏈聚合物）結(jié)合形成沉淀，從而達(dá)到破膠的目的。取上清液，則可以順利通過(guò)微孔濾膜，經(jīng)沖洗后，可有效去除甲硝唑凝膠的抑菌作用。該種方法可為含抗感染藥物凝膠制劑的微生物限度檢查的研究提供參考。