益木腦液灌腸對(duì)肝性腦病大鼠腦蛋白表達(dá)的影響*

周 爍 周振國(guó) 劉昕艷 李京濤 柏魯寧△

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

肝性腦?。℉E）是指由急性或慢性肝功能衰竭引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。HE的癥狀包括個(gè)性改變、注意力缺陷、睡眠節(jié)律改變、認(rèn)知障礙，嚴(yán)重時(shí)可致昏迷［1］。HE系多因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前暫無特效措施，因此，臨床急需探索治療HE臨床見效的新藥物。已有臨床觀察［2］表明，由國(guó)家級(jí)名中醫(yī)常占杰教授研制的益木腦液可有效改善HE，與西醫(yī)保守治療聯(lián)合應(yīng)用取得了良好的效果。基于前期課題組研究［3］，本實(shí)驗(yàn)采用50% 四氯化碳（CCl4）聯(lián)合硫代乙酰胺（TAA）建立大鼠肝硬化HE模型，探討益木腦液對(duì)HE腦蛋白的治療作用及機(jī)制，為進(jìn)一步探討HE的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年SD大鼠72只，質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2020（川）-030，溫度20～25℃，濕度60%，晝夜光照時(shí)間各12 h，自由飲食飲水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠操作程序均經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 益木腦液：生大黃30 g，蒲公英30 g，石菖蒲30 g，烏梅30 g，煅牡蠣20 g，芒硝20 g。中藥均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)買，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）要求，全方藥物分別按照比例稱重、混合，煎煮、濾過后，經(jīng)60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，每克含生藥8 g，凍干粉密封保存于4℃冰箱內(nèi)備用，使用時(shí)100℃水溶解。乳果糖（北京韓美藥業(yè)有限公司，2005005）

1.3 試劑與儀器 TAA（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司，YH21010802）；CCl4（阿拉丁，批號(hào)：C128126）；血氨試劑盒（A086-1-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（C009-2-1）、血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，C010-2-1）；5-羥色胺（5-HT）試劑盒、去甲腎上腺素（NE）試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程）；GABA抗體、GFAP抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-P5）；石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016）；酶標(biāo)儀（雷杜生命科技有限公司，型號(hào)：RT-6100）；顯微鏡（Nikon公司，型號(hào)：E100）。

1.4 分組及造模 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，在72只SD大鼠中隨機(jī)選取10只大鼠作為空白對(duì)照組，剩余62只大鼠為模型組。參考文獻(xiàn)［4］制備肝性昏迷大鼠模型。模型組大鼠按5 mL/kg給予50%CCl4溶劑（50 mL橄欖油+50 mL CCl4）腹腔注射，每周2次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整劑量，共12周。第13周按300 mg/kg給予3%TAA溶液隔日腹腔注射，隔天1次，連續(xù)2次，對(duì)照組大鼠給予等量橄欖油腹腔注射。若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主活動(dòng)減少、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等癥狀之一，即可判斷造模成功。造模過程中，模型組大鼠死亡17只，對(duì)照組未出現(xiàn)死亡。

1.5 給藥方法 將第13周造模成功的45只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、乳果糖組和益木腦液低、中、高劑量組，每組9只。乳果糖組以5.63 mL/kg的劑量給予乳果糖灌腸，益木腦液低、中、高劑量組分別以0.56、1.12、2.24 g/kg的劑量給予益木腦液灌腸，對(duì)照組及模型組給予等量蒸餾水灌腸，給藥體積均按5 mL/kg計(jì)，每日1次，連續(xù)給藥14 d。藥物干預(yù)過程中，模型組大鼠死亡3只，乳果糖組死亡1只，益木腦液低、中、高劑量組各死亡2、1、1只。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血氨、血清生化指標(biāo)檢測(cè)。大鼠末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，次日采用20%烏拉坦（1 g/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，一部分血液予以肝素鈉抗凝，并在0.5 h內(nèi)檢測(cè)血氨水平；剩余血液于4℃靜置3 h后，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清，凍存管分裝，-80℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒，按試劑盒說明書分別檢測(cè)ALT、AST、5-HT及NE。2）免疫組織化學(xué)。脫頸處死大鼠，冰上取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定。采用免疫組織化學(xué)法，通過脫蠟，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，封閉孵育，一抗、二抗、SABC孵育，顯色復(fù)染，封片，觀察GFAP、GABA的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，各組間方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較 見表1。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠ALT、AST及血氨水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，乳果糖組及益木腦液低、中、高劑量組都能顯著降低大鼠血清中ALT、AST及血氨水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與乳果糖組相比，益木腦液高劑量組中ALT、AST及血氨水平下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST、血氨水平比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與乳果糖組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白對(duì)照組模型組乳果糖組益木腦液低劑量組益木腦液中劑量組益木腦液高劑量組n 10 6 8 7 8 8 ALT（U/L）40.4±3.3 120.2±15.2*77.6±12.4*#83.0±10.4*#78.3±8.4*#65.4±14.7*#△AST（U/L）103.2±15.2 233.4±24.5*167.1±19.7*#176.9±20.6*#165.5±14.4*#147.9±22.7*#△血氨（μmol/L）72.5±7.0 166.1±10.0*145.5±9.6*147.3±10.7*#142.9±8.1*#124.9±15.6*#

2.2 各組大鼠神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平比較 見表2。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠5-HT、NE水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，乳果糖組及益木腦液中、高劑量組血漿中5-HT、NE水平降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組血漿中5-HT及NE水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血漿中神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平比較（μg/mL，±s）

表2 各組大鼠血漿中神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)水平比較（μg/mL，±s）

組別空白對(duì)照組模型組乳果糖組益木腦液低劑量組益木腦液中劑量組益木腦液高劑量組n 10 6 8 7 8 8 5-HT 10.9±1.8 16.9±5.6**12.1±11.6#14.3±8.4 10.6±5.1##7.2±4.7##△NE 1.4±0.5 5.4±1.9**4.6±1.7 5.3±1.8 4.1±1.9 2.8±1.3##△

2.3 各組大鼠腦組織GFAP、GABA蛋白表達(dá)比較 在空白對(duì)照組中，腦皮層中由GFAP著色所示的星形膠質(zhì)細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常；與空白對(duì)照組相比，模型組中GFAP著色所示的星形膠質(zhì)細(xì)胞顏色加深，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)顯著腫脹，說明肝性腦病后大鼠腦皮層組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖；與模型組相比，益木腦液給藥組GFAP著色數(shù)量減少，細(xì)胞腫脹程度降低，具有明顯改善細(xì)胞腫脹和增殖的作用。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮層GFAP星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)（200倍）

在空白對(duì)照組中，海馬內(nèi)GABA著色所示神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，排列整齊；與對(duì)照組相比，模型組陽(yáng)性表達(dá)增多，海馬內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞核固縮變形，染色加深，細(xì)胞排列紊亂；與模型組相比，益木腦液組的GABA著色數(shù)量下降，具有明顯改善神經(jīng)細(xì)胞的作用。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)GABA神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)（200倍）

3 討論

HE又稱肝昏迷，是肝病晚期常見的并發(fā)癥和死亡原因，發(fā)生在肝硬化患者中的概率達(dá)30%～80%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［5-6］，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚未完全闡明?，F(xiàn)如今，氨中毒學(xué)說、神經(jīng)遞質(zhì)改變等研究已較為成熟，外周炎癥反應(yīng)、腦血流量改變、半通道功能障礙等學(xué)說也日益受到重視［7］。

HE發(fā)生的確切機(jī)制尚不完全清楚，但氨作為一種神經(jīng)毒素是參與HE發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。正常情況下，氨主要由肝臟代謝，但在肝功能障礙時(shí)，血氨濃度上升，氨隨之彌散入腦，與星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的谷氨酰胺合成酶發(fā)生反應(yīng)，生成谷氨酰胺，谷氨酰胺進(jìn)入線粒體后又在谷氨酰胺脫氫酶的作用下分解為氨［8］，氨繼而促進(jìn)活性氧-氮簇釋放，觸發(fā)氧化/氮化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體通透性改變，引發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫，GFAP作為膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的胞漿內(nèi)絲蛋白，能夠起維持星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用，作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［9］，在星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹時(shí)可引發(fā)其表達(dá)上調(diào)。同時(shí)高氨可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白發(fā)生酪氨酸硝化反應(yīng)［10］，使GFAP表達(dá)上調(diào)，破壞星形膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫，并進(jìn)一步引發(fā)腦水腫，加重HE。研究表明，高氨血在導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的同時(shí)，亦導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上多種神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂，如GABA、Glu、5-HT、NE等［11］，引起興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡，干擾正常腦活動(dòng)。5-HT與NE均為真性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，5-HT具有平衡中樞神經(jīng)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)思維活動(dòng)等［12］廣泛生物學(xué)作用，研究表明NE對(duì)心理、行為及情緒都有調(diào)節(jié)作用［13-14］，實(shí)驗(yàn)證明［14］，在高血氨影響下，大鼠腦神經(jīng)核內(nèi)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)異常，使5-HT在細(xì)胞外液中累積并致使其異常增高，同時(shí)由于高血氨的刺激，大鼠腦皮質(zhì)前NE轉(zhuǎn)運(yùn)點(diǎn)位消耗增加，轉(zhuǎn)運(yùn)減少，導(dǎo)致細(xì)胞外液的NE濃度上升，引發(fā)腦水腫，并進(jìn)一步加劇HE。GABA為中樞神經(jīng)主要的抑制性神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)，主要由腸道菌群產(chǎn)生，正常情況下吸收后由肝臟進(jìn)行代謝，肝衰竭時(shí)則可以直接進(jìn)入體循環(huán)，GABA與其他神經(jīng)遞質(zhì)交互作用，影響運(yùn)動(dòng)、體溫調(diào)節(jié)、肌緊張、睡眠、應(yīng)激等行為［15］，HE時(shí)，肝功能異常，血GABA水平升高，GABA入腦增多，中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用增強(qiáng)，進(jìn)而影響神經(jīng)傳遞、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和學(xué)習(xí)能力［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益木腦液與乳果糖治療組均可以改善血氨濃度，使GFAP蛋白表達(dá)下調(diào)，NE濃度降低。與乳果糖組相比，益木腦液高劑量組的GFAP顯著下調(diào)，NE濃度明顯降低，說明益木腦液有較好的降低血氨、減少肝細(xì)胞損害，改善肝臟的功能。益木腦液和乳果糖組的GABA、5-HT表達(dá)水平較模型組均有所減少，以益木腦液治療組改善更為突出，且益木腦液高劑量組與乳果糖治療組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明益木腦液能夠醒腦開竅，有效緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善HE癥狀。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HE屬本虛標(biāo)實(shí)之證，是由肝疏泄失常，脾運(yùn)化功能減弱，氣血瘀阻凝滯導(dǎo)致的大腸傳導(dǎo)失司、腑氣不通，使瘀毒、痰濁、濕熱積結(jié)于內(nèi)，濁氣上逆，犯于腦竅，進(jìn)而神機(jī)失靈。益木腦液善攻邪泄毒，輕清通竅。方中生大黃活血通經(jīng)，與芒硝相合可攻邪瀉毒以開竅；蒲公英清熱解毒；石菖蒲寧神益智，有腦保護(hù)的作用，其性溫，可以起到防諸藥過于苦寒而傷正的作用；烏梅性平，歸肝、脾、大腸經(jīng)，與煅牡蠣同用可收澀固澀，防止泄下過多而傷正。6藥并用，溫中收斂，苦寒攻下，使?jié)嵊兴?；臟腑氣機(jī)宣通，則神明安寧。以上6藥合用具有抑菌消炎、減少內(nèi)毒素，改善肝功能及神經(jīng)功能的作用［2，17］。本實(shí)驗(yàn)也表明，益木腦液在降低血氨水平、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等方面具有較為顯著的效果，是具有顯著治病優(yōu)勢(shì)和良好推廣前景的有效臨床方案。

由于HE系多種致病因素共同作用所致，因此HE臨床上具有復(fù)雜性、多樣性的特點(diǎn)［18］，所以在治療過程中，應(yīng)采取多環(huán)節(jié)、全方面的綜合治療方案［19］。目前治療HE的臨床手段主要為剔除誘因、脫氨、人工肝及肝移植，但各有其局限性［20］，而中醫(yī)學(xué)對(duì)HE的治療有很大的優(yōu)勢(shì)，由于中藥具有成分復(fù)雜的特點(diǎn)，可能存在治療上的多靶點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中也證實(shí)中藥灌腸［21］對(duì)于HE治療效果明顯，因此探究中醫(yī)藥對(duì)于HE的治療是發(fā)展趨勢(shì)之所在。