健脾清腸通絡(luò)方對三硝基苯磺酸鈉誘導(dǎo)重癥炎癥性腸病腸纖維化小鼠作用機(jī)制研究*

鄭 烈 聞新麗 段盛蕾

（陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003）

重癥炎癥性腸?。↖BD）是一種發(fā)生在胃腸道且原因不明、反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性疾病，病變累及黏膜和黏膜下層，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病2種亞型，是一種致死性腸道疾病，病情纏綿，病程日久，最終繼發(fā)腸纖維化。內(nèi)科治療療效差，預(yù)后不良。腸纖維化被認(rèn)為是重癥IBD不可避免的并發(fā)癥，可導(dǎo)致腸腔狹窄和梗阻，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-2］。由于目前臨床缺乏有效的抗纖維化藥物，所以大多數(shù)患者需要手術(shù)治療。然而目前眾多學(xué)者對重癥IBD的研究主要以炎癥、黏膜損傷等研究為主，很少有學(xué)者從腸道最終病理結(jié)局腸纖維化入手解決臨床實(shí)際問題。因此，從腸纖維化入手解決臨床問題對改變患者病情進(jìn)展和自然病程具有重要意義。研究腸纖維化的發(fā)病機(jī)制已成為臨床醫(yī)生的重要挑戰(zhàn)，亟須解決。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腸纖維化主要與濕熱瘀毒等因素有關(guān)，當(dāng)腸道受到上述致病因素后會導(dǎo)致腸腑氣機(jī)不暢，脈絡(luò)閉塞，絡(luò)息成積，久病必有瘀，故導(dǎo)致腸纖維化［3］。故本研究以三硝基苯磺酸鈉（TNBS）灌腸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎腸纖維化為模型，在前期研究的基礎(chǔ)上采用健脾清腸通絡(luò)方進(jìn)行干預(yù)，該方由地榆散、香連丸、三棱丸方化裁而來，旨在探討該方對腸纖維化是否具有抑制作用，從而為臨床干預(yù)腸纖維化提供客觀依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57/BL6雄性小鼠40只，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，室溫（23±3）℃，12 h光照和黑暗循環(huán)，空氣濕度35%～45%。

1.2 藥物與試劑

1）健脾清腸通絡(luò)方混懸液。組方如下：黃芪30 g，黃連3 g，黨參15 g，生地榆15 g，馬齒莧30 g，白及3 g，木香6 g，三七6 g，三棱12 g，莪術(shù)12 g，生甘草6 g。將上述中藥濃煎至138 mL，使含生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL，低溫冰箱保存。2）美沙拉嗪混懸液。藥物購于佳木斯鹿伶制藥有限責(zé)任公司（國藥準(zhǔn)字H19980148），采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置。3）TNBS購于Sigma公司（批號P2297），根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用50%的乙醇溶液配置。

1.3 分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照體質(zhì)量編號，隨機(jī)分為4組：空白對照組（10只）、模型組（10只）、健脾清腸通絡(luò)方組（10只）和美沙拉嗪組（10只）。除正常組小鼠外，其余3組小鼠均建立TNBS誘導(dǎo)炎癥性腸病腸纖維化模型［3］。小鼠禁食24 h不禁水后采用7%水合氯醛（5 mL/kg）腹腔注射麻醉，模型組用直徑2 mm的醫(yī)用聚乙烯乳膠管經(jīng)肛門輕輕插入腸道內(nèi)約8 cm，第1日給予5%的TNBS 10 mg，第8日給予5%的TNBS 15 mg，第15日給予5%的TNBS 20 mg，第22日給予5%的TNBS 25 mg，第29日給予5%的TNBS 25 mg，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用50%的乙醇溶液配置成0.8 mL的溶液全部灌入肛內(nèi)，然后將小鼠尾部提起，倒置60 s，使藥液均勻到達(dá)全結(jié)腸。正常組采用同樣的方法注入等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4 藥物干預(yù)

參照《中藥藥理研究方法學(xué)》［4］，從第22日開始，空白對照組和模型組給予等體積（0.3 mL/d）生理鹽水，健脾清腸通絡(luò)方組給予健脾清腸通絡(luò)方混懸液15 g/（kg·d）灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液100 mg/（kg·d）灌胃，給藥2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 小鼠體質(zhì)量變化 給藥結(jié)束時，稱取小鼠體質(zhì)量，并詳細(xì)記錄。

1.5.2 小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）［5］主要通過動物體質(zhì)量、大便性狀及隱血情況進(jìn)行評估。

1.5.3 小鼠結(jié)腸長度及質(zhì)量 剪取小鼠全結(jié)腸后輕輕平展于濾紙上，測量結(jié)腸長度。濾紙上吸干水分后稱重。

1.5.4 各組小鼠結(jié)腸組織大體評分、病理評分變化比較 剪取小鼠全部結(jié)腸，從肛門直腸部開始至回盲部，剪取后小心清除結(jié)腸表面的脂肪組織，肉眼觀察各組小鼠結(jié)腸的大體形態(tài)，并參考文獻(xiàn)［6］評分。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行評分。

1.5.5 小鼠血清結(jié)締組織生長因子（CTGF）和Ⅲ型前膠原（PCⅢ）表達(dá)的檢測 分離各組小鼠血清后，低溫保存，然后按照ELISA試劑盒說明書（美國Cell Signaling Technology公司，產(chǎn)品貨號：3709S，11888S）操作檢測。具體方法：收集小鼠靜脈血清，12 000 r/min、5 min低溫離心，吸取上清液于1.5 mL EP管中，置于-80℃冰箱凍存，以供檢測。

1.5.6 小鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）蛋白、CTGF、PCⅢ蛋白水平表達(dá) 采用Western blotting法檢測其表達(dá)情況，收集小鼠結(jié)腸組織，組織蛋白抽提，測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移、顯像、免疫檢測（封閉1 h，加入稀釋好的TGF-β抗體，4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，然后TBST洗膜3次），化學(xué)發(fā)光檢測蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，對所有符合正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況分析

見表1。經(jīng)過4個周期干預(yù)后，模型組死亡小鼠4只，健脾清腸通絡(luò)方組和美沙拉嗪組均死亡2只。與空白對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯減輕（P＜0.05）、DAI評分明顯增加（P＜0.05），結(jié)腸長度明顯縮短（P＜0.05），結(jié)腸質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；經(jīng)健脾清腸通絡(luò)方和美沙拉嗪干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量、DAI評分、結(jié)腸長度和結(jié)腸質(zhì)量均有不同程度的改善（P＜0.05），且美沙拉嗪組略優(yōu)于健脾清腸通絡(luò)方組（P＞0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評分、結(jié)腸長度及質(zhì)量比較（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評分、結(jié)腸長度及質(zhì)量比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡(luò)方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8體質(zhì)量（g）23.45±0.21 16.53±0.32*20.95±0.24△21.87±0.19△DAI評分（分）0 6.12±0.78*1.87±0.46△1.26±0.38△結(jié)腸長度（cm）8.12±0.09 5.67±0.06*6.82±0.05△7.01±0.03△結(jié)腸質(zhì)量（g）0.65±0.03 1.12±0.06*0.72±0.05△0.69±0.03△

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化

見圖1。光學(xué)顯微鏡下，空白對照組腺體排列規(guī)則，間質(zhì)內(nèi)未見炎性細(xì)胞。模型組可見潰瘍形成，部分區(qū)域腺體缺失，間質(zhì)水腫，嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤肌層，并可見纖維細(xì)胞增生，間質(zhì)纖維化。健脾清腸通絡(luò)方組間質(zhì)水腫減輕，肌層可見少量炎性細(xì)胞，纖維細(xì)胞增生和纖維化程度減輕。美沙拉嗪組間質(zhì)水腫明顯減輕，肌層炎性細(xì)胞明顯減少，可見少量纖維細(xì)胞增生和纖維化改變。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織變化（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織和病理組織評分比較

見表2。結(jié)果表明，模型組結(jié)腸組織大體評分、病理評分均增加（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸通絡(luò)方組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織大體評分、病理評分均減少（P＜0.05）。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織大體評分、病理評分比較（分，±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸組織大體評分、病理評分比較（分，±s）

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡(luò)方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8結(jié)腸大體評分2.12±0.53 6.25±0.71*4.35±0.54△4.21±0.52△結(jié)腸病理評分0 8.45±0.63*5.29±0.47△4.31±0.58△

2.4 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達(dá)比較

見表3。與空白對照組相比，模型組CTGF和PCⅢ表達(dá)均增加（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸通絡(luò)方組和美沙拉嗪組CTGF和PCⅢ表達(dá)均減少（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達(dá)比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清CTGF和PCⅢ表達(dá)比較（pg/mL，±s）

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡(luò)方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8 CTGF 186.93±22.46 892.04±35.29*306.27±26.78△285.93±22.45△PCⅢ272.56±8.75 365.28±10.42*302.85±7.32△297.36±5.24△

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)比較 見圖2，表4。與空白對照組比較，模型組結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；經(jīng)健脾清腸通絡(luò)方和美沙拉嗪干預(yù)后小鼠結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。

圖2 小鼠結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)條帶

表4 各組小鼠結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與健脾清腸通絡(luò)方組比較，#P＜0.05。

組別空白對照組模型組健脾清腸通絡(luò)方組美沙拉嗪組n 10 6 8 8 TGF-β1/β-actin 0.42±0.05 0.91±0.04*0.84±0.03△0.65±0.04#△CTGF/β-actin 0.43±0.05 0.92±0.06*0.75±0.04△0.56±0.12#△PCⅢ/β-actin 0.34±0.06 0.82±0.05*0.54±0.04△0.43±0.07#△

3 討論

近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，IBD發(fā)病率逐漸呈上升趨勢，在我國患病人群沿海發(fā)達(dá)城市為主，由于久病難愈，嚴(yán)重影響患者日常生活和工作。腸纖維化是其并發(fā)癥之一。多研究表明，反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥通過激活間充質(zhì)細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）引發(fā)纖維化。在過去的十多年IBD患者腸纖維化并發(fā)癥并沒有得到有效改善，說明腸纖維化的發(fā)生發(fā)展是非常復(fù)雜的，包括炎癥和非炎癥過程。且目前影響IBD腸纖維化慢性炎癥的影響因素尚不清楚，因此，從抗纖維化治療聯(lián)合抗炎治療研究非炎癥作用機(jī)制是非常有必要的科研課題。然而，利用生物制劑等新藥物的抗炎治療在預(yù)防纖維化方面取得進(jìn)展甚微。一旦ECM開始過度沉積，非炎癥機(jī)制在纖維化的進(jìn)展中是不可或缺的，盡管炎癥在纖維化過程中僅僅起了很小一部分作用。

腸纖維化表現(xiàn)為過度的、異常的ECM沉積，其中膠原蛋白在ECM表達(dá)最豐富［8］。有研究表明［9］，在腸纖維化部位可見大量成纖維細(xì)胞，Ⅲ型膠原的合成能力明顯增加。TGF-β與纖維化發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系。有研究表明［10］，TGF-β過度表達(dá)會促進(jìn)ECM大量累積，是腸纖維化重要致病因素。CTGF是多種氨基酸組成多肽物質(zhì)，對纖維化發(fā)生起重要作用。CTGF主要由TGF-β誘導(dǎo)表達(dá)，主要介導(dǎo)TGF-β發(fā)生纖維化［11］。研究表明［12-13］，在多種纖維化疾病中，TGF-β與CTGF表達(dá)協(xié)同增加，當(dāng)CTGF表達(dá)減少時，TGF-β促進(jìn)纖維化作用明顯減弱。由此可見，CTGF與纖維化呈相關(guān)性。所以通過干預(yù)結(jié)腸組織TGF-β與CTGF表達(dá)研究腸纖維化具有重要意義。

根據(jù)葉天士“久病入絡(luò)”“久痛入血”理進(jìn)行辨證論治，絡(luò)脈是氣血津液輸布、環(huán)流的樞紐和通路，主要參與營血的生成、輸布和貫通營衛(wèi)、溝通表里經(jīng)脈的生理功能?！锻饪普凇つc癰論》曰“腸癰，皆濕熱瘀血流入小腸而成……如積襲日久……以致毒攻內(nèi)臟，腸胃受傷”。可見濕、熱、瘀、毒是腸炎腸纖維化病理因素，蘊(yùn)結(jié)腸腑，損傷血絡(luò)，氣血運(yùn)化失司，組織滲灌不足，血敗肉腐。吳以嶺《絡(luò)病論》認(rèn)為絡(luò)病有“易滯易瘀、易入難出、易積成形”的特點(diǎn)?！鹅`樞·癰疽》云“榮衛(wèi)稽留于經(jīng)脈之中，則血泣而不行，不行則衛(wèi)氣從之而不通，壅遏而不得行，故熱，大熱不止，熱勝則肉腐，肉腐則為膿”。痰濕熱毒灼傷絡(luò)脈導(dǎo)致營衛(wèi)之行受阻，氣機(jī)阻滯，引起血液運(yùn)行澀滯、津血互換異常，使津凝成痰，血滯為瘀，代謝廢物蓄積為毒；痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物聚積又引起絡(luò)脈瘀阻、閉塞，絡(luò)息成積，進(jìn)一步損傷絡(luò)脈，加重絡(luò)脈自身營衛(wèi)不通，形成絡(luò)脈病變的惡性循環(huán)，故補(bǔ)氣健脾藥常與清腸祛風(fēng)、活血通絡(luò)藥同用。前期課題組認(rèn)為脾氣虛弱是發(fā)病基礎(chǔ)［14-15］，熱和瘀是主要病理因素，而且制定了健脾清腸方治療，療效確切［16-17］。方中以黃芪和黃連共為君藥；黨參助黃芪健脾益氣，馬齒莧助黃連清解腸熱止痢為臣藥；佐以生地榆清熱涼血止血，三七化瘀止血，白及護(hù)膜止血，木香理氣消脹；生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。諸藥共奏健脾益氣、理氣止痛、散瘀止血的功效。

由于該病病情遷延難愈，中醫(yī)認(rèn)為病邪內(nèi)蘊(yùn)與正氣消伐并存，屬本虛標(biāo)實(shí)?；谝陨险J(rèn)識，提出腸纖維化以健脾清腸，活血通絡(luò)，扶正祛邪為主，創(chuàng)制健脾清腸通絡(luò)方。該方是在前期健脾清腸方基礎(chǔ)上加三棱、莪術(shù)，此2味藥是三棱丸的重要組成，具有活血化瘀作用，記載于清朝著名醫(yī)家姚俊的醫(yī)作《經(jīng)驗(yàn)良方》。方中三棱苦平辛散，為血中氣藥，長于破血中之氣，具有破血通經(jīng)之效。現(xiàn)代藥理研究［18-20］發(fā)現(xiàn)，三棱提取物通過減少纖維組織增生、阻止纖維化發(fā)展，促進(jìn)纖維組織降解起到抗纖維化作用；莪術(shù)苦辛溫香，入肝脾氣分，為氣中血藥，善破氣中之血，具有破氣消積之效，且其有效成分姜黃素可通過多種機(jī)制和途徑介導(dǎo)發(fā)揮其抗纖維化作用［21-22］；二藥配伍使用，氣血雙施，活血化瘀、行氣止痛、化積消塊力彰。三棱與莪術(shù)配伍能促進(jìn)過氧化物酶增殖物激活受體γ生成，降低腸道纖維化因子的生成水平，從而抑制腸纖維化發(fā)揮治療作用。

本研究結(jié)果表明，模型組小鼠TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白表達(dá)增加，經(jīng)過健脾清腸通絡(luò)方和美沙拉嗪干預(yù)后，結(jié)腸組織TGF-β1、CTGF、PCⅢ蛋白的表達(dá)降低。由此可見，健脾清腸通絡(luò)方可能通過降低TGF-β 1、CTG、PCⅢ蛋白F表達(dá)來抑制腸纖維化。