淫羊藿、女貞子含藥血清聯(lián)合糖皮質(zhì)激素影響雷帕霉素誘導(dǎo)ASMCs自噬激活的機(jī)制研究*

王 瀚 龍玉婷 馬紫童 李玉曼 馬再娜 于 萍 劉仁慧（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

近年來，哮喘的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，如何干預(yù)哮喘發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為廣大學(xué)者的研究重點(diǎn)?；跉獾姥装Y及氣道重塑是哮喘的重要病理改變的認(rèn)識(shí)，抗炎及改善氣道重塑是防治哮喘的重要治療策略［1］。糖皮質(zhì)激素因具有強(qiáng)大的抗炎作用，是目前治療哮喘的首選藥物，但對(duì)氣道重塑的改變并不理想，且應(yīng)用劑量過大或時(shí)間過長會(huì)出現(xiàn)多種不良反應(yīng)［2］。氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）增殖是氣道重塑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，亦是氣道阻塞的主要原因，調(diào)控ASMCs功能可有效改善哮喘氣道重塑，并成為治療難治性哮喘的重要思路。

自噬是真核細(xì)胞對(duì)受損蛋白質(zhì)或細(xì)胞器包裹進(jìn)行溶酶體降解和再循環(huán)，維持細(xì)胞核機(jī)體穩(wěn)態(tài)的一個(gè)過程。適度的自噬可重建細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存；但過度自噬加重細(xì)胞損傷而致細(xì)胞自噬性死亡，或引發(fā)凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，人哮喘肺中支氣管平滑肌厚度的增加與自噬標(biāo)記物的高表達(dá)密切相關(guān)［3］，且哮喘小鼠ASMCs自噬水平顯著上調(diào)［4］。平補(bǔ)腎中陰陽立法的淫羊藿-女貞子藥對(duì)出自上海市名老中醫(yī)徐輝光教授數(shù)十年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)［5］。前期研究表明，淫羊藿、女貞子配伍可協(xié)同激素抑制卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘大鼠膠原纖維沉積及杯狀細(xì)胞增生，減少氣道平滑肌增厚，對(duì)氣道重塑具有良好的改善作用［6-8］，機(jī)制與上調(diào)肺組織凋亡水平，下調(diào)自噬水平有關(guān)，但對(duì)于ASMCs的影響未明。本研究通過體外培養(yǎng)的ASMCs，比較激素地塞米松、淫羊藿-女貞子藥對(duì)及中西藥合用對(duì)自噬激活劑雷帕霉素（Rap）誘導(dǎo)的ASMCs自噬、凋亡及增殖活性的調(diào)節(jié)作用的差異，為中西藥合用治療哮喘研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，1月齡，體質(zhì)量（120±10）g，用于氣道平滑肌原代細(xì)胞株提?。籗PF級(jí)健康雄性SD大鼠，2月齡，體質(zhì)量（280±20）g，用于含藥血清和正常血清制備。大鼠均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，動(dòng)物倫理號(hào)：AEEI-2019-136。

1.2 藥物與試劑

炙淫羊藿飲片40 g（北京人衛(wèi)中藥飲片廠）；酒女貞子飲片30 g（北京盛世龍藥業(yè)有限公司），制成生藥濃度0.7 g/mL的水煎液備用。地塞米松（MedChemExpress公司，批號(hào)：38633）。Rap（MedChemExpress公司，批號(hào)：38921）；噻唑藍(lán)（MTT，索萊寶生物科技有限公司；批號(hào)：715F0521）；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（明輝生物，批號(hào)：A91125）；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體（MEDICAL&BIOLOGICAL LABORATORIES，cat.no.M186-3）；小鼠抗P53多克隆抗體（cat.no.sc-98）、小鼠抗Bcl-2多克隆抗體（cat.no.sc-7382）均由Santa Cruz Biotechnology公司提供；兔抗Bax多克隆抗體（cat.no.50599-2-Ig）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（cat.no.19677-1-AP）、小鼠抗mTOR單克隆抗體（cat.no.66888-1-Ig）、抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒均由Proteintech公司；兔抗Ki-67單克隆抗體（cat.no.ab16667）、兔抗Beclin-1多克隆抗體（cat.no.ab62557），均來自Abcam；兔抗磷酸化mTOR（phosphomTOR，p-mTOR）單克隆抗體（cat.no.5536）、小鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（cat.no.19245）、兔抗GAPDH單克隆抗體（cat.no.2118），購于Cell Signaling Technology公司。

1.3 含藥血清制備

2月齡SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常組（等體積的蒸餾水）、中藥組（淫羊藿-女貞子水煎液5 mL/kg體質(zhì)量）。各組大鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，每日2次。末次給藥1 h后，腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃儲(chǔ)存。

1.4 原代ASMCs培養(yǎng)及給藥

參考文獻(xiàn)［9］分離大鼠ASMCs，并進(jìn)行純化、α-SMA免疫組化染色鑒定，培養(yǎng)至P3～P7代用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為5組：正常組（正常大鼠血清）、Rap組（Rap+正常大鼠血清）、激素組（Rap+正常大鼠血清+地塞米松）、中藥組（Rap+中藥含藥血清）、合用組（Rap+中藥含藥血清+地塞米松）。在孔板或培養(yǎng)皿中以適宜密度接種細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)12 h后，按照分組加入大鼠血清，并加入適量10 μmol/L Rap使培養(yǎng)基含有Rap終濃度為100 nmol/L，48 h后進(jìn)行檢測。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 10 mL培養(yǎng)皿收集細(xì)胞，2.5%戊二醛固定細(xì)胞，制備超薄切片，透射電子顯微鏡（TEM）不同視野下觀察細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形態(tài)、膜內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等細(xì)胞器成分以及凋亡的細(xì)胞影像學(xué)特征。

1.5.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 96孔板中加入MTT溶液（5 mg/mL）15 μL，培養(yǎng)4 h。棄上清液，加150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩15 min后于490 nm處測OD值，計(jì)算細(xì)胞活力（%）。

1.5.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測增殖蛋白Ki-67蛋白表達(dá) 在含有爬片的24孔板中進(jìn)行細(xì)胞接種、干預(yù)，爬片樣本分別進(jìn)行固定、透膜、內(nèi)源性過氧化物酶失活、封閉處理，滴加50 μL Ki-67抗體（1∶250稀釋），4℃過夜孵育；次日進(jìn)行二抗孵育、DAB染色、蘇木素復(fù)染、封片，200倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照分析，計(jì)算陽性率（%）=（陽性染色細(xì)胞核平均area值/全部細(xì)胞核平均area值）×100%。

1.5.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率 6 cm培養(yǎng)皿收集細(xì)胞按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.5.5 Western blotting檢測 在10 cm培養(yǎng)皿中收集ASMCs，BCA法蛋白定量；SDS-PAGE電泳分離蛋白（IC3采用12.5%SDS-PAGE凝膠；P53、Caspase-3采用10%SDS-PAGE凝膠），轉(zhuǎn)移至PVDF膜后封閉2 h；加入一抗（兔抗LC3B、兔抗Caspase-3、鼠抗β-actin、兔抗GAPDH，均1∶1 000；鼠抗P53，1∶500），4℃孵育過夜；加入二抗（山羊抗兔或山羊抗小鼠，均1∶10 000）孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶灰度。見圖1。

圖1 各組大鼠LC3蛋白表達(dá)

1.5.6 細(xì)胞免疫熒光法檢測 24孔細(xì)胞爬片經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定，PBS洗；0.5%TritonX-100室溫透膜10 min，PBS洗；5%BSA封閉1 h，吸棄液體；滴加10 μL一抗（兔抗Bax，1∶250；鼠抗Bcl-2，1∶50；兔抗Beclin-1、鼠抗mTOR、兔抗p-mTOR，均1∶100），4 ℃過夜孵育；37℃復(fù)溫15 min，PBS洗，滴加100 μL熒光二抗稀釋液1 h，PBS沖洗；抗熒光猝滅封片劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下（200倍）計(jì)算平均光密度值（MOD）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件，分析數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布：符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（）表示，對(duì)于多組獨(dú)立樣本比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane'T2（方差不齊）；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)方法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ASMCs超微結(jié)構(gòu)比較

見圖2。正常組細(xì)胞形態(tài)較為完整，胞內(nèi)含細(xì)胞器豐富，分布均勻且形態(tài)規(guī)則，少見自噬小體與凋亡發(fā)生現(xiàn)象。Rap組可明顯觀察到細(xì)胞邊緣不規(guī)則式改變，胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)目大量增加，自噬體形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增多。激素組多見凋亡小泡分布于細(xì)胞膜邊緣，細(xì)胞器排列雜亂，可見不同程度的結(jié)構(gòu)破壞；胞內(nèi)可見不同階段的自噬體，同時(shí)伴隨溶酶體髓鞘樣折疊。中藥組與合用組可見細(xì)胞膜較為完整，相比于Rap組細(xì)胞凋亡減少；胞內(nèi)自噬體數(shù)目下降、線粒體數(shù)目增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列則較為規(guī)則。

圖2 各組大鼠ASMCs透射電鏡圖

2.2 各組ASMCs自噬調(diào)節(jié)情況比較

見表1。ASMCs在自噬誘導(dǎo)劑Rap刺激下，LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01），Beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），自噬抑制因子mTOR及p-mTOR顯著下調(diào)（P＜0.01）。與Rap組比較，激素組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值進(jìn)一步升高（P＜0.05），且p-mTOR進(jìn)一步降低（P＜0.01）；中藥組與合用組LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低（均P＜0.05），并見Beclin-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；合用組p-mTOR蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。合用組較激素組LC3Ⅱ/Ⅰ、mTOR蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組ASMCs自噬調(diào)節(jié)情況比較（±s）

表1 各組ASMCs自噬調(diào)節(jié)情況比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與Rap組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與激素組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n 3 3 3 3 3 LC3Ⅱ/Ⅰ1.13±0.16 2.20±0.18**2.57±0.28#1.75±0.15#△△1.76±0.23#△△Beclin-1 37.53±5.30 66.82±7.81**61.07±6.99 48.82±4.18##△53.71±5.19#mTOR 83.47±8.93 45.79±6.45**36.54±5.07 46.64±6.28 49.05±5.50△p-mTOR 93.02±11.01 63.26±7.86**40.10±9.80##69.11±7.28△△48.44±9.08#

2.3 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較

見表2。正常ASMCs經(jīng)Rap誘導(dǎo)自噬后，細(xì)胞活力及Ki-67蛋白表達(dá)均顯著下降且凋亡率增加（均P＜0.01）。與Rap組比較，激素組細(xì)胞活力、Ki-67蛋白表達(dá)均進(jìn)一步顯著降低（均P＜0.01），且凋亡率進(jìn)一步升高（均P＜0.01）；中藥組與合用組細(xì)胞活力及Ki-67蛋白表達(dá)升高（均P＜0.01）；中藥組凋亡率降低（P＜0.01）。與激素組比較，合用組對(duì)細(xì)胞活力、增殖活性及凋亡活性的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表2 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較（±s）

表2 各組ASMCs增殖及凋亡活性的比較（±s）

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n3 3 3 3 3細(xì)胞活力（%）100.00±1.85 56.49±1.99**50.34±1.47##66.37±1.48##△△64.75±1.72##△△Ki-67 Area（%）27.60±1.66 20.23±1.06**17.23±1.50##26.29±1.09##△△23.44±1.71##△△凋亡率（%）10.63±1.16 19.21±2.21**23.48±1.76##13.36±1.72##△△19.56±1.13△△

2.4 各組ASMCs凋亡調(diào)節(jié)因子表達(dá)的比較

見表3。Rap刺激ASMCs出現(xiàn)凋亡活性增強(qiáng)時(shí)，Bax、Caspase-3及P53蛋白上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），但Bcl-2蛋白下調(diào)（P＜0.01），且Bax/Bcl-2增加（P＜0.01）。與Rap組比較，激素組與合用組Bax蛋白進(jìn)一步升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白顯著降低（P＜0.01），且Bax/Bcl-2比值顯著增加（P＜0.01）；激素組Caspase-3及P53蛋白上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；中藥組P53蛋白降低。與激素組比較，合用組對(duì)Bax/Bcl-2、Caspase-3、P53的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組ASMCs凋亡調(diào)節(jié)因子表達(dá)的比較（±s）

表3 各組ASMCs凋亡調(diào)節(jié)因子表達(dá)的比較（±s）

組別正常組Rap組激素組中藥組合用組n 3 3 3 3 3 Bax 65.01±7.93 88.85±7.29*116.48±15.38#93.95±13.67△115.12±14.88#Bcl-2 79.42±7.85 60.26±5.72**38.63±5.45##63.70±5.45△△45.71±5.01##Bax/Bcl-2 0.83±0.18 1.48±0.19**3.02±0.20##1.49±0.35△△2.52±0.20##△Caspase-3 96.07±10.07 165.58±17.35**217.19±21.62##148.81±15.77△△169.68±17.82△△P53 28.85±4.87 52.45±6.13**67.13±7.26#41.15±4.50#△△47.85±7.41△△

3 討論

哮喘是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，伴有自發(fā)性支氣管收縮和氣流阻塞。ASMCs增生和中央氣道增厚是哮喘嚴(yán)重程度的指標(biāo)和特征［10-11］。自噬是發(fā)生在所有真核細(xì)胞中的基本生理過程，可調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。經(jīng)過遺傳多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白ATG5的rs12212740基因位點(diǎn)參與哮喘的發(fā)病機(jī)制，其等位基因Grs12212740被確定為哮喘的危險(xiǎn)因素［12］。哮喘患者大小氣道壁的上皮和ASMCs自噬標(biāo)志物表達(dá)均上調(diào)。在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，TGF-β1可通過刺激人ASMCs自噬和促纖維化信號(hào)傳導(dǎo)誘發(fā)氣道重塑，而自噬抑制劑氯喹可抑制該作用，改善哮喘氣道重塑［10，13］。

mTOR是進(jìn)化保守的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與細(xì)胞增殖、自噬、蛋白質(zhì)內(nèi)源合成與代謝等多種生物過程，在自噬途徑中主要通過啟動(dòng)ULK1與PI3K-Ⅲ復(fù)合物分解程序而阻斷自噬體形成［14］。Rap是吸水鏈霉菌的大環(huán)內(nèi)酯類產(chǎn)物，是mTOR的原型抑制劑，通過抑制mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮免疫抑制和細(xì)胞增殖抑制作用，是自噬的強(qiáng)誘導(dǎo)劑［15］。然而，Rap在哮喘中的作用尚未完全闡明。Rap可通過抑制mTORC1信號(hào)通路，促進(jìn)哮喘模型小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，改善哮喘氣道炎癥［16］。Rap可改善香煙煙霧誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性［17］，但加重屋塵螨誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性［18］。本研究證實(shí)，Rap可顯著刺激誘導(dǎo)正常ASMCs自噬活性，且增加ASMCs LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值、Beclin-1表達(dá)，顯著抑制mTOR及p-mTOR表達(dá)；同時(shí)伴有ASMCs細(xì)胞活力及增殖活性抑制，而凋亡水平增加，同時(shí)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及P53表達(dá)上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值增加。

激素可協(xié)同Rap誘導(dǎo)ASMCs自噬活性增加，使LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值進(jìn)一步增加，并抑制p-mTOR表達(dá)，但對(duì)Beclin-1及mTOR表達(dá)無影響；激素可使Rap刺激的ASMCs細(xì)胞活力及增殖活性降低，而凋亡水平增加，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及P53上調(diào)，但抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，且Bax/Bcl-2增加。提示激素可加重Rap誘導(dǎo)的ASMCs自噬與凋亡水平，并進(jìn)一步抑制ASMCs細(xì)胞活力與增殖活性。

中藥淫羊藿、女貞子配伍后可抑制Rap誘導(dǎo)ASMCs自噬活性，使LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1蛋白降低，但對(duì)mTOR及p-mTOR表達(dá)無影響；改善Rap對(duì)ASMCs細(xì)胞活力及增殖活性的抑制作用，并降低凋亡水平，抑制P53蛋白表達(dá)。而中藥合用激素后，可抑制Rap誘導(dǎo)的ASMCs自噬，下調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值及Beclin-1、p-mTOR蛋白表達(dá)；上調(diào)Rap誘導(dǎo)的ASMCs細(xì)胞活力及增殖活性，但對(duì)凋亡活性無顯著影響；與激素單用比較，合用組下調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，調(diào)節(jié)ASMCs細(xì)胞活力、增殖活性及凋亡活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示中西藥合用后可抑制激素協(xié)同Rap誘導(dǎo)的ASMCs過度自噬狀態(tài)，并改善激素導(dǎo)致的ASMCs活性抑制，使ASMCs趨于正常。

綜上所述，對(duì)于Rap誘導(dǎo)的ASMCs自噬及凋亡增強(qiáng)且增殖抑制狀態(tài)，激素可進(jìn)一步加重Rap誘導(dǎo)的ASMCs自噬及凋亡水平，并抑制ASMCs增殖；中藥淫羊藿、女貞子配伍可改善Rap誘導(dǎo)的ASMCs自噬及凋亡水平，促進(jìn)ASMCs增殖；激素合用中藥可一定程度地抑制Rap協(xié)同激素誘導(dǎo)的ASMCs自噬，恢復(fù)細(xì)胞活性，使細(xì)胞趨于正常。