龍牡湯對急性濕疹大鼠Th1/Th2平衡、肥大細胞及皮膚屏障蛋白表達的影響研究*

遲慧彥 楊 斌 孫洮玉 王晶晶 王清瀅 徐春英 陶以成△

（1.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

濕疹是具有多形性皮損及明顯滲出傾向的炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)為劇烈瘙癢［1］。急性期濕疹皮損炎癥反應(yīng)及瘙癢發(fā)生，不但影響日間學習工作，還可致失眠、睡眠障礙等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。我國濕疹患病率約為7.5%，兒童可達到18.71%［2］。濕疹的發(fā)病機制復雜多樣，目前多認為是在機體內(nèi)部因素如免疫功能異常、皮膚屏障功能障礙等基礎(chǔ)上，夾雜外部因素綜合作用的結(jié)果。根據(jù)病程將濕疹分為急性、亞急性及慢性3期，急性期表現(xiàn)為紅斑、水腫乃至水皰，常有糜爛及滲出［3］。龍牡湯是黃堯洲教授治療濕疹的經(jīng)驗方，臨床療效確切［4-6］，無明顯副作用且復發(fā)率低，但作用機制尚不清楚。本研究擬通過觀察龍牡湯對急性濕疹大鼠皮膚組織病理改變，Th1/Th2免疫平衡，肥大細胞數(shù)量及皮膚屏障相關(guān)蛋白表達的影響，探討中藥對急性濕疹的防治機理及作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0001。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由進食標準大鼠飼料，自由飲水和攝食，室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%。

1.2 試藥與儀器

龍牡湯（組成：生龍骨30 g，煅牡蠣30 g，骨碎補10 g，地膚子30 g，連翹15 g），飲片購自中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，煎制濃縮制成含生藥量3.0 g/mL。白芍總苷膠囊（寧波立華制藥，國藥準字H20055058，規(guī)格0.3 g/片）。2，4-二硝基氯苯（DNCB）（天津光復精細化工，批號051001）。大鼠IgE、白細胞介素-2（IL-2）及白細胞介素-4（IL-4）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號分別為E-EL-RO348c、E-ELRO683c及E-EL-RO595c）；E-caderin抗體（英國abcam公司，貨號ab86005，批號GR174855-3）；ZO-1抗體（英國abcam公司，貨號ab221547，批號GR2437802-5）；Claudin3抗體（英國abcam公司，貨號ab15102，批號GR3637525-3）；酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金橋，貨號PV6000，批號2010D1217）；Olympus BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 分組及造模

將32只SD大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、龍牡湯組、白芍總苷組，每組8只。除正常組外，其余組采用DNCB法造模。第1日至第3日為致敏階段，在大鼠背部涂抹50 μL的5%DNCB，每日1次，第4日至第9日為激發(fā)階段，在大鼠背部涂抹50 μL的0.2%DNCB，每3日1次，共3次，正常組背部涂抹等體積基質(zhì)溶液。模型建立約10 d，以大鼠皮膚出現(xiàn)紅腫、紅斑、滲出，撓抓現(xiàn)象，結(jié)合血清中嗜酸粒細胞百分比及IgE增高，證實模型成功。

1.4 給藥方法

中藥組從第10天開始給予龍牡湯灌胃，按大鼠體表面積換算，劑量為30 g/（kg·d），白芍總苷組給予白芍總苷藥液灌胃，取藥片溶于蒸餾水中，劑量為70 mg/（kg·d）。正常組和模型組以等量生理鹽水灌胃。第24天取血后頸部脫臼法處死大鼠，切取相應(yīng)背部皮膚組織，放入10%中性甲醛液中固定。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 大鼠背部皮膚皮損狀況評分 于造模完成當日（第10天）開始，以紅斑、丘疹、表皮剝脫、鱗屑等項皮損表現(xiàn)作為皮炎損傷肉眼觀察，記錄第10天、第14天、第18天、第22天共4個時間點，按照表1標準進行皮損評分。

表1 皮損評分標準

1.5.2 血清IgE、IL-2及IL-4水平 麻醉大鼠，分離一側(cè)頸總動脈，動脈取血5 mL，靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-80℃冰箱備用。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠IgE、IL-2及IL-4的水平。

1.5.3 大鼠背部皮膚組織學觀察 中性甲醛液固定皮膚組織48 h，制作成大小為2 cm×1 cm，厚0.3 cm的組織塊，脫水、石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察皮膚組織形態(tài)學變化。

1.5.4 皮損組織肥大細胞數(shù)目 石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇，蒸餾水洗，甲苯胺藍染液滴染30 min，自來水流水沖洗2 min，濾紙吸干水分，95%～100%乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察皮膚組織內(nèi)肥大細胞數(shù)量。

1.5.5 免疫組化法染色測定E-cadherin、ZO-1及Claudin3的蛋白表達 石蠟包埋切片，厚度4 μm，烘箱70℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，100%-95%-90%-80%梯度乙醇脫水，3%雙氧水避光10 min以滅活內(nèi)源性酶，pH6.0枸櫞酸鹽修復液高壓熱修復3 min，分別滴加E-cadherin、ZO-1及Claudin3抗體（濃度分別為1∶200，1∶100，1∶50），4℃孵育過夜；滴加二抗（酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物），常溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，染色完成后自來水沖洗，蘇木素復染，80%-90%-95%-100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察，陽性為表皮細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒，陰性對照用PBS代替一抗，每張切片隨機取5個高倍視野（400），Image-Pro Plus 6.0軟件測定陽性信號的平均光密度（IOD）值。

1.6 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時間點背部皮膚皮損狀況評分

見表2。與正常組相比，模型組大鼠皮膚皮損評分增加（P＜0.05）；與模型組相比，龍牡湯組及白芍總苷組皮損評分呈下降趨勢，各時間點部分結(jié)果差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明龍牡湯有改善炎癥和修復皮膚損傷的作用。

表2 各組大鼠各時間點背部皮損評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠各時間點背部皮損評分比較（分，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別正常組模型組龍牡湯組白芍總苷組n 8 8 8 8 10 d 2.07±0.54 9.46±1.73**9.59±1.62 9.80±1.96 14 d 2.14±0.56 10.01±1.79*8.39±1.98 8.74±2.14 18 d 2.17±0.49 10.66±1.83*7.48±1.45△7.68±1.50△22 d 2.01±0.68 10.82±2.03*7.03±1.39△7.43±1.43△

2.2 各組大鼠血清IgE、IL-2及IL-4水平比較

見表3。與正常組比較，模型組大鼠血清中IgE、IL-4明顯上升，IL-2水平下降，差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，龍牡湯組及白芍總苷組血清IgE、IL-4水平減低，IL-2增高，IL-4差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清IgE、IL-2及IL-4表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清IgE、IL-2及IL-4表達水平比較（±s）

組別正常組模型組龍牡湯組白芍總苷組n8 8 8 8 IgE（U/mL）3.27±0.54 5.88±0.79**4.12±0.62**4.39±0.73**IL-2（ng/mL）78.44±9.35 57.01±11.08*62.32±9.85 64.04±10.32 IL-4（ng/mL）49.47±6.63 88.62±10.33*65.21±9.39△73.34±10.21△

2.3 各組大鼠皮膚組織形態(tài)學變化

光鏡下觀察可見：正常組大鼠皮膚組織如常，上皮層數(shù)未見增加，細胞未見變性，真皮層為疏松的纖維結(jié)締組織，見少量血管及散在少量炎細胞；模型組大鼠表皮呈乳頭狀增生，棘層肥厚，上皮細胞水腫變性，間質(zhì)血管增生，擴張、充血，炎細胞浸潤明顯。龍牡湯組和白芍總苷組皮膚組織損傷均有明顯減輕，特別是龍牡湯組表現(xiàn)為上皮細胞水腫減少，間質(zhì)炎癥程度減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理形態(tài)（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠皮膚組織肥大細胞數(shù)量

甲苯胺藍染色法示肥大細胞位于皮膚組織真皮淺層，形狀不規(guī)則，散在排列，胞質(zhì)呈深藍色空泡狀。在100倍數(shù)視野下，統(tǒng)計各組肥大細胞數(shù)目。結(jié)果顯示：與正常組（3.81±0.97）個比較，模型組肥大細胞為（11.02±2.23）個，較為密集，數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。龍牡湯組為（7.21±1.42）個，白芍總苷組為（7.64±1.83）個，兩組均較模型組顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠皮膚組織肥大細胞數(shù)量改變（甲苯胺藍染色，100倍）

2.5 各組大鼠表皮組織E-cadherin、ZO-1及Claudin3的蛋白表達

上皮屏障蛋白E-cadherin、ZO-1及Claudin3在各組大鼠皮膚組織均有表達，主要定位在表皮角化形成細胞的胞漿及胞膜。結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組E-cadherin、ZO-1及Claudin3表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。龍牡湯組E-cadherin、ZO-1表達水平較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3，表4。

圖3 各組大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3免疫組化蛋白表達（IHC，200倍）

表4 各組大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3蛋白表達比較（IOD值，±s）

表4 各組大鼠表皮E-cadherin、ZO-1及Claudin3蛋白表達比較（IOD值，±s）

組別正常組模型組龍牡湯組白芍總苷組n8 8 8 8 E-cadherin 1 035±124 755±143*873±109△820±129 ZO-1 1 123±145 668±151*807±122△798±144△Claudin3 863±97 635±137*707±101 694±108

3 討論

濕疹為常見的免疫炎癥性皮膚病，據(jù)統(tǒng)計，發(fā)達國家約有15%～20%的人口患有濕疹［7］。急性濕疹是濕疹常見臨床類型之一，屬于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，在變應(yīng)原誘導下，血管擴張，通透性增高，滲出增加導致組織水腫，同時肥大細胞數(shù)目增多、活化，嗜酸粒細胞浸潤增加［8］。臨床癥狀為紅斑、丘疹和水皰，乃至滲出及糜爛，組織病理表現(xiàn)為皮膚的表皮、真皮結(jié)構(gòu)有不同程度的破壞、損傷，表皮為角化過度，棘層肥厚，嚴重時表皮變性、壞死、脫落，糜爛及潰瘍形成，真皮層組織水腫及嗜酸粒細胞、肥大細胞大量浸潤等［9］。本次實驗從組織病理結(jié)構(gòu)層面觀察發(fā)現(xiàn)，濕疹模型組大鼠表現(xiàn)為皮膚表皮組織增生，棘層肥厚，局部上皮細胞排列松散，角質(zhì)層可見灶性糜爛，間質(zhì)血管擴張充血，炎癥浸潤明顯；同時免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，真皮淺層肥大細胞數(shù)量增多。而在給予龍牡湯干預后，結(jié)果顯示表皮層數(shù)減少，糜爛及炎癥減輕，肥大細胞數(shù)目減少。

急性濕疹發(fā)生機制復雜，目前研究熱點主要集中于機體內(nèi)部因素，認為免疫功能異常和皮膚屏障功能障礙是急性濕疹發(fā)病的關(guān)鍵因素［10］。Th2細胞因子在IgE介導的免疫炎癥中起中心作用，Th2細胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13可誘導B淋巴細胞產(chǎn)生IgE，間接活化肥大細胞。細胞角質(zhì)層細胞結(jié)構(gòu)蛋白異?？蓪е缕つw屏障功能障礙，臨床表現(xiàn)為皮膚干燥，對外界刺激敏感，使得變應(yīng)原更容易透過皮膚，誘發(fā)級聯(lián)免疫炎癥反應(yīng)，加重病情。E-cadherin屬于鈣離子依賴黏附素家族，ZO-1及Claudin3為緊密連接蛋白家族分子，均起封閉屏障作用，可防止溶液中分子沿細胞間隙滲入體內(nèi)，保證內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定［11］。Owsiak等［12］揭示了細胞因子對細胞黏附分子、緊密連接蛋白等功能性皮膚屏障的影響。實驗給予白細胞介素-17誘導角質(zhì)形成細胞，發(fā)現(xiàn)絲聚蛋白mRNA水平顯著降低，此外，參與細胞黏附的基因包括E-cadherin、ZO-1表達也降低。本次實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，急性濕疹大鼠血清中IgE、IL-4水平增加，IL-2下調(diào)，龍牡湯則對于IgE、IL-4水平有明顯的提升作用。此外，作為表皮屏障的客觀標志，E-cadherin、ZO-1及Claudin3在濕疹大鼠皮膚組織上的蛋白表達均受到抑制，而龍牡湯能夠有效改善此狀況，顯著升高E-cadherin、ZO-1的表達。

中醫(yī)歸濕疹為“濕瘡”“浸淫瘡”“繡球風”范疇，認為［13］濕疹發(fā)病主因先天稟賦不耐，皮膚腠理不固，外界風、濕、熱邪侵襲而發(fā)病。后天飲食不節(jié)，過食辛辣魚腥動風之品，傷及脾胃，脾失健運，致濕熱內(nèi)生。內(nèi)外合邪，兩相搏結(jié)，蘊結(jié)肌膚。其病因病機大多歸于風濕蘊熱、脾虛濕盛、血虛風燥等，治療上多以清熱祛風、健脾利濕、養(yǎng)血潤燥等為主。而黃堯州主任醫(yī)師在40多年的臨證治療濕疹中發(fā)現(xiàn)，濕疹患者的主要特征是頑固性瘙癢，但癢易擾心神，因此患者多伴有失眠、煩躁、情緒加重等證候，因此根據(jù)《素問·至真要大論》中病機十九條所言“諸痛癢瘡，皆屬于心”，創(chuàng)新性地提出了“從心論治”濕疹的治療方法，創(chuàng)立了以龍牡湯為主方的鎮(zhèn)心安神法治療濕疹方案［14］，取得了良好的臨床療效。該方以3味藥為主，為生龍骨、煅牡蠣、骨碎補。方中重用生龍骨為君、煅牡蠣為臣，共奏重鎮(zhèn)心安神、益陰潛陽之功；骨碎補能補先天稟賦之不足，佐助君臣。諸藥合用，藥少力專，心神寧、瘙癢止。以3味藥為基礎(chǔ)方，臨床可以加減運用。現(xiàn)代醫(yī)學認為龍牡湯中所含主藥生龍骨、煅牡蠣含有大量鈣鹽，骨碎補能夠促進機體對鈣吸收，3藥合用能提高血鈣濃度［15］，有利于降低毛細血管通透性，減少血漿滲出，從而抑制炎癥反應(yīng)；同時鈣質(zhì)還可降低神經(jīng)興奮性和機體敏感性，提高機體的耐受能力。

《靈樞·本神》云“心藏神”，《素問·至真要大論》所云“諸痛癢瘡，皆屬于心”。唐王冰曰“心寂則痛癢微，心躁則痛癢甚，百端之起，皆自心生，痛癢瘡瘍生于心也”。說明了心神不安、心燥可以導致痛癢更甚，也明確指出了心神和和濕疹嚴重程度的密切關(guān)系。隋代巢元方在《諸病源候論》中也明確提出“浸淫瘡，是心家有風熱，發(fā)于肌膚”，說明了心火旺盛、心家有風熱可以導致浸淫瘡。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認為“心主神志、心主血脈”?！端貑枴れ`蘭秘典論》有云“心者，君主之官，神明出焉”。從心論治法采用鎮(zhèn)心安神以去心火、安神明，使血脈通順，氣血暢行，心神安定，邪風得除，癢亦可止。從現(xiàn)代醫(yī)學的角度來看，鎮(zhèn)心安神方可以改善患者睡眠以及躁動不安、注意力不集中等癥狀，并且減輕皮膚炎癥，提高患者的生活質(zhì)量。本方不拘泥于傳統(tǒng)健脾、清熱利濕、養(yǎng)血潤燥等治療方法，而重視心神的調(diào)養(yǎng)，立法以鎮(zhèn)心安神為主，又不乏清心祛火、止癢補腎之義，藥少力專。

綜上所述，本實驗說明龍牡湯能夠顯著調(diào)節(jié)濕疹急性期大鼠免疫炎癥狀態(tài)，糾正內(nèi)外免疫紊亂，改善上皮組織損傷，增強皮膚屏障功能，從而達到減輕瘙癢、預防復發(fā)的目的。