天麻軟腐病相關(guān)細(xì)菌的分離鑒定*

于鶯曼，張 鵬，劉建偉，楊石美**

（1.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631；2.中國科學(xué)院昆明植物研究所，中國西南野生生物種質(zhì)資源庫，云南省真菌多樣性與綠色發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204）

天麻（Gastrodia elata）是一種異養(yǎng)蘭科植物，依靠蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）分解木材并利用其釋放出的營養(yǎng)而生存。天麻入藥已有2 000多年歷史，是一種重要的傳統(tǒng)中藥材。然而在天麻主產(chǎn)區(qū)存在連作障礙嚴(yán)重、藥材減產(chǎn)和有效成分降低等問題，很大程度上影響天麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。病害是影響中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，天麻最常見的病害有腐爛病、黑心病、白絹病、軟腐病等侵染性病害，以及天麻生存環(huán)境不適或天麻與蜜環(huán)菌之間營養(yǎng)失衡導(dǎo)致的生理性病害[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)侵染性病害主要由真菌、細(xì)菌、病毒等引起[3]，微生物群落結(jié)構(gòu)變化也被認(rèn)為是天麻發(fā)病的重要原因[4]。有研究認(rèn)為細(xì)菌是引起天麻軟腐病的主要病原菌，通過傷口或自然裂口侵入組織，并借助雨水飛濺或昆蟲傳播蔓延[1]；也有研究認(rèn)為天麻軟腐病由多種病菌引起，以孢囊孢子和菌絲體附著于塊莖或菌材，隨風(fēng)傳播侵害[5]。分離獲得天麻軟腐病相關(guān)細(xì)菌，是進(jìn)一步防控研究的前提和基礎(chǔ)。因此通過分離培養(yǎng)天麻健康塊莖與患軟腐病組織內(nèi)的細(xì)菌，比較并研究二者之間細(xì)菌的種群和數(shù)量，為進(jìn)一步確認(rèn)和防控天麻軟腐病原菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣品為人工種植天麻，采集自云南省昆明市祿勸縣。選取不同軟腐程度的塊莖，以健康塊莖為對照，樣品性狀及取材部位見表1。

表1 天麻樣品性狀Tab.1 Characteristics of Gastrodia elata samples

1.2 分離純化

1.2.1 培養(yǎng)基

TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g、大豆胨3.0 g、葡萄糖2.5 g、NaCl 5.0 g、K2HPO42.5 g、瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0~7.4。

1.2.2 分離、培養(yǎng)與純化

于超凈工作臺內(nèi)用75%酒精對天麻進(jìn)行表面消毒，用滅菌手術(shù)刀橫切，按表1各組樣品隨機(jī)取材3塊~5塊，共5 g；放于裝有無菌玻璃珠的45 mL 0.85%NaCl溶液中，28℃搖床震蕩培養(yǎng)30 min；在超凈工作臺進(jìn)行稀釋，使質(zhì)量濃度梯度為10-2g·mL-1~10-6g·mL-1；分別吸取質(zhì)量濃度為10-4g·mL-1、10-5g·mL-1、10-6g·mL-1菌液100μL，均勻涂布于TSA培養(yǎng)基（每種質(zhì)量濃度3個重復(fù)），于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；對上述平板進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，同時挑取平板上不同形態(tài)的菌落劃線純化；挑取純化得到的單菌落接種至裝有TSA液體培養(yǎng)基的離心管中進(jìn)行培養(yǎng)，用于DNA的提取。

1.3 分子鑒定

1.3.1 DNA提取

培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；加入TES buffer（20 mmol·L-1Tris，50 mmol·L-1EDTA，150 mmol·L-1NaCl，pH 7.9），再于離心機(jī)中以13 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；加入1.2 mL TES buffer重懸；加入300μL溶菌酶（5 mg·mL-1），37℃裂解細(xì)胞60 min。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增正向引物為63f：5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′；反向引物為1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR體系共25μL：DNA 1μL，正向、反向引物（5μmol·L-1）各1μL，10×buffer（Mg2+free）2μL，dNTPs（10μmol·L-1）1μL，BSA（1%）0.5μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5μL，5 U·μL-1Taq酶0.3μL，ddH2O 16.7μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.4 測序分析

PCR反應(yīng)試劑，F(xiàn)ermentas公司；Taq聚合酶，Takara公司；引物63f、1495r，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；16S rDNA測序，由昆明碩擎生物科技有限公司完成。

使用BLAST對獲得的序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對，相似度大于98%的作為一個運(yùn)算分類單元OTU（operational taxonomic unit）。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌定量分析

對不同天麻塊莖內(nèi)分離得到的細(xì)菌菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2。

由表2可知，天麻塊莖組織內(nèi)細(xì)菌菌落數(shù)量為2.0×104個/g～2.2×107個/g。樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)由高到低為：GE5＞GE4=GE1＞GE3＞GE2＞CK。對照樣品（CK）內(nèi)的細(xì)菌菌落數(shù)量遠(yuǎn)低于其他病變樣品（GE2～GE5）內(nèi)的細(xì)菌菌落數(shù)量；GE3和GE5分別取材于同一患病塊莖中的未腐爛部分和腐爛部分，但二者菌落數(shù)目差異較大，腐爛部分的菌落總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未腐爛部分；說明細(xì)菌數(shù)量的增加與軟腐病存在著較高的相關(guān)性。外表受損但內(nèi)部完好的樣品（GE1）組織內(nèi)菌落數(shù)量遠(yuǎn)高于外表、內(nèi)部均完好無損的樣品（CK）組織內(nèi)菌落數(shù)量，且僅次于外表破損、腐爛程度最高的樣品（GE5）組織內(nèi)菌落數(shù)量，說明外表破損導(dǎo)致了組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量大量增加。

2.2 細(xì)菌多樣性、組成及其分布

從天麻塊莖組織中共分離出可培養(yǎng)細(xì)菌182株，經(jīng)測序隸屬于變形菌門（Proteobacteria）γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）的8屬11種，包括淺黃色假單胞菌（Pseudomonas lurida）和帕勒隆尼氏假單胞菌（Ps.palleroniana）、拉恩氏菌（Rahnellasp.）、戴氏西地西菌（Cedecea davisae）、解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella omithinolytica）、變棲克雷伯菌（Klebsiella variicola）和同屬的克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）、路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）和同屬的Enterobactersp.、泛菌（Pantoeasp.）和塔斯曼尼亞歐文氏菌（Erwinia tasmaniensis）。對182個菌株在8個屬中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果詳見圖1。

圖1 天麻組織內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌屬的組成Fig.1 Genus of cultural bacteria in tissue of Gastrodia elata

由圖1可知，8個屬中假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢屬，占細(xì)菌總數(shù)的60%；其中淺黃色假單胞菌為該屬中的主要種類，占該屬細(xì)菌總數(shù)的71%。歐文氏桿菌屬（Erwinia）、西地西菌屬（Cedecea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、拉烏爾菌屬（Raoultella）分別占細(xì)菌總數(shù)的13.82%、7.42%、5.73%、4.93%、4.11%、2.6%、1.39%。

對分離出的可培養(yǎng)細(xì)菌在不同樣品中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性由高到低為：GE5=GE4＞GE3＞GE1＞GE2＞CK。天麻的軟腐組織（GE4、GE5）內(nèi)具有最高的細(xì)菌多樣性和一致的類群組成，均分離到8屬11種細(xì)菌，與患病早期（GE2）及僅有破損（GE1）的天麻樣品組織相比，增加了歐文氏桿菌屬、腸桿菌屬和拉恩氏菌屬3個類群。完好塊莖（CK）組織內(nèi)分離到的細(xì)菌種類最少，只有淺黃色假單胞菌。假單胞菌屬是所有樣品中的主要細(xì)菌類群，可能在天麻發(fā)育和內(nèi)源性細(xì)菌軟腐病中發(fā)揮著重要作用。與完好的樣品（CK）相比，外部受損但內(nèi)部完好的樣品（GE1）組織中增加了西地西菌屬、克雷白氏桿菌屬、泛菌屬和拉烏爾菌屬4個類群，這表明外表破損導(dǎo)致了組織內(nèi)細(xì)菌多樣性的顯著增加；而與外表無破損的發(fā)病初期樣品（GE2）相比，二者共同的類群包括假單胞菌屬、西地西菌屬、克雷白氏桿菌屬和泛菌屬，表明這些類群應(yīng)該為內(nèi)源性細(xì)菌，與天麻軟腐病直接相關(guān)。拉烏爾菌屬出現(xiàn)在僅外部受損的完好組織（GE1）、無破損的軟腐組織（GE4）和外部受損的軟腐組織（GE5）中，該類群為外源細(xì)菌的概率更高，極可能也與天麻細(xì)菌軟腐病有關(guān)。

圖2 不同天麻組織中可培養(yǎng)細(xì)菌的分布Fig.2 Distribution of cultural bacteria in different tissues of Gastrodia elata

2.3 天麻軟腐病相關(guān)細(xì)菌分析

以上結(jié)果與統(tǒng)計(jì)分析顯示，與健康天麻組織相比，患軟腐病天麻組織內(nèi)具有較高的細(xì)菌多樣性和菌落數(shù)量，且隨著腐爛程度的加重呈上升趨勢，這表明細(xì)菌種類和數(shù)量的增加與軟腐病存在著較高的相關(guān)性；假單胞菌屬、西地西菌屬、克雷白氏桿菌屬和泛菌屬應(yīng)該為天麻內(nèi)源性細(xì)菌，可能與其軟腐病直接相關(guān)。綜合分離得到的歐文氏桿菌屬細(xì)菌分布情況（占細(xì)菌總數(shù)的13.82%）以及與其相關(guān)的大量植物軟腐致病研究報道[6-9]，推測天麻軟腐病的發(fā)生也與其密切相關(guān)。與外表完好的健康天麻組織相比，外表有破損的組織（包括內(nèi)部健康和內(nèi)部軟腐的樣品）內(nèi)細(xì)菌多樣性和數(shù)量均顯著增加；可知外表破損是軟腐病的誘因之一，拉烏爾菌屬可能是外源性病原菌之一。

3 討論

隸屬于假單胞菌屬的許多種類為根際促生菌[10]，也有部分種類是導(dǎo)致植物發(fā)生軟腐病的病原菌，通過操控蛋白和植物毒素對寄主的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行破壞；如青枯假單胞桿菌（Ps.solanacarum）可導(dǎo)致姜軟腐病[11]，邊緣假單胞菌（Ps.marginalis）可導(dǎo)致馬蹄蓮軟腐病[12]，Ps.grimontii為蝴蝶蘭軟腐病病原菌[13]。有的種類會因?yàn)樗拗髦参锘颦h(huán)境的不同，由促生菌變?yōu)椴≡蝗鐭晒饧賳伟≒s.fluorescens）是蠶豆的促生菌[14]，但會導(dǎo)致大蒜心腐病[15]。此次研究結(jié)果表明，假單胞菌屬可能在天麻發(fā)育和內(nèi)源性細(xì)菌軟腐病中發(fā)揮著重要作用。

歐文氏菌屬一般被認(rèn)為是植物軟腐病的重要病原菌，通過產(chǎn)生果膠酶使組織的薄壁細(xì)胞浸離降解，進(jìn)而導(dǎo)致軟腐[16]。海芋歐文氏菌（Er.aroideae）和胡蘿卜歐文氏菌（Er.carotovora）被認(rèn)為是天麻軟腐病的病原菌[17-18]。成團(tuán)泛菌（Pa.agglomerans）被報道可引起稻谷內(nèi)穎發(fā)生褐變、洋蔥腐爛病、棉花細(xì)菌性爛鈴病、日本雞血藤和錐花霞草腫瘤病及香蕉葉鞘腐敗病等[19]。Jain等[20]對全球蘭科植物病害地理分布、致病因子等因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)泛菌屬和歐文菌屬細(xì)菌會導(dǎo)致蘭科植物軟腐病。而烏氨酸拉烏爾菌（R.ornithinolytica）能夠降解木質(zhì)纖維素，可致煙苗軟腐[21]。綜上分析，歐文氏菌屬、泛菌屬、拉烏爾菌屬都可能是天麻軟腐病的病原菌類群。

拉恩氏菌（Rahnellasp.）被報道與蜜環(huán)菌共同培養(yǎng)可以產(chǎn)生吲哚乙酸，促進(jìn)天麻生長，增加天麻產(chǎn)量和提升塊莖尺寸[22]。腸桿菌（En.ludwigii）和Enterobactersp.則被認(rèn)為是根際促生菌，可以提高小麥的抗旱能力以及鹽脅迫下小麥幼苗的生長[23-24]。此外，克雷白氏桿菌（Klebsiellsp.）可被制成生防劑，用于促進(jìn)植物的生長[23，25-26]。綜上分析，拉恩氏菌、腸桿菌和克雷白氏桿菌是否為天麻軟腐病的病原菌需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

此外，多種真菌比如鉤狀木霉菌（Trichoderma hamatum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（F.solani）、強(qiáng)壯土赤殼（Ilyonectria robusta）也會導(dǎo)致天麻軟腐病，且真菌侵染可能與栽培環(huán)境高溫、高濕、透氣不良有關(guān)[1,27-29]。實(shí)際生產(chǎn)中因?yàn)榄h(huán)境不適、連作障礙、蟲害和采挖破損等因素，某些細(xì)菌和真菌類群分別或聯(lián)合導(dǎo)致了軟腐病的發(fā)生，其中細(xì)菌可能是內(nèi)源性軟腐病的主要致病類群。此次研究僅對可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行了初步分析，未涉及真菌和其他不可培養(yǎng)的微生物，而發(fā)病過程中核心微生物組、微生物群落演替及其與天麻的相互作用等研究需要進(jìn)一步開展。