毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取工藝*

計(jì)瑋瑋，俞婷婷，李 穎**，朱 煒，沈曉利，王勇軍

（1.湖州市梁希森林公園管理處，浙江 湖州 313022；2.湖州市生態(tài)林業(yè)保護(hù)研究中心，浙江 湖州 313013；3.長(zhǎng)興縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 湖州313199）

竹蓀（Dictyophora indusiata）屬鬼筆科（Phauaceae）竹蓀屬（Dictyophora），別名竹笙、竹參，外形優(yōu)美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“菌中皇后”的美稱[1-2]。竹蓀具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤(rùn)肺止咳、清熱利濕的功效。其子實(shí)體中富含黃酮、多糖、多酚等生物活性物質(zhì)，并含有多種氨基酸及多種維生素，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等作用[3-4]。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性功能[5-6]。黃酮類化合物常采用乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，也可采用超聲波、微波等設(shè)備加以輔助提取[7]。

浙江省是全國(guó)重點(diǎn)毛竹（Phyllostachys edulis）主產(chǎn)區(qū)，近年來，隨著浙江省毛竹林高質(zhì)量發(fā)展提升工程的實(shí)施，毛竹林下栽培竹蓀等食用菌模式在浙江省毛竹林區(qū)推廣迅速。在毛竹林下人工栽培竹蓀，不與糧爭(zhēng)田，不與果爭(zhēng)地，是林下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的重要組成。在收獲竹蓀的同時(shí)，栽培后的廢料又可以作為林地的天然有機(jī)質(zhì)肥料，有效改善林中土壤結(jié)構(gòu)和肥力，實(shí)現(xiàn)林-菌生態(tài)循環(huán)技術(shù)模式，是集經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益于一體的短平快山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展項(xiàng)目。

以毛竹林下人工栽培的竹蓀子實(shí)體為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)毛竹林下栽培的竹蓀子實(shí)體總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。研究毛竹林下栽培竹蓀中總黃酮的高效提取方法，有益于提升竹蓀附加值，可為毛竹林下仿野生生態(tài)栽培竹蓀的精深加工和開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

竹蓀子實(shí)體，浙江省湖州市毛竹林下栽培；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），NaOH、Al（NO3）3、NaNO2等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

JDS-82A電熱恒溫振蕩水槽，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪有限公司；紫外分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定總黃酮含量[8]。精密稱取105℃真空干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用70%乙醇將其溶解并定容至50 mL，搖勻，得0.5 mg·g-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于50 mL容量瓶，加2 mL~4 mL蒸餾水，加5%的亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置6 min。加入10%的硝酸鋁0.4 mL，搖勻，放置6 min。加入4%的氫氧化鈉4.0 mL，再加蒸餾水至刻度、搖勻，放置15 min。以空白試劑作對(duì)比參照，在510 nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮的提取

將收集的毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體真空烘干后粉碎，過40目篩，得毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體粉末。準(zhǔn)確稱取2.0 g毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體粉末置于磨口錐形瓶中，按照要求加入一定量的乙醇溶液，在一定溫度下回流提取2 h。抽濾用80%乙醇定容至100 mL，取1.5 mL待測(cè)液于100 mL容量瓶中，按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的步驟測(cè)定吸光度A。毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體中總黃酮提取量（Q，mg·g-1）的計(jì)算公式為：

式中：ρ為待測(cè)液濃度（mg·mL-1）；n為提取液稀釋因子；V為提取液體積（mL）；W為原料質(zhì)量（g）。

1.3.3 提取條件的單因素試驗(yàn)

稱取適量干燥粉碎后的毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體2.0 g，選取提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比3個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以總黃酮提取量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，按照1.3.2中的方法進(jìn)行提取。固定提取溫度為60℃，液料比為30∶1，分別在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）條件下回流提取1 h，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響；將液料比設(shè)置為30∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為70%，并分別在以下溫度梯度下（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）進(jìn)行回流提取1 h，探究不同提取溫度對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響。將乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度分別設(shè)置為70%和60℃，分別在以下液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）下回流提取1 h，研究溶液中不同液料比對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3組重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

1.3.4 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)里的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，最適水平范圍選定提取溫度、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)因素綜合確定的范圍，并運(yùn)用Design Expert 8.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的分析，響應(yīng)面設(shè)計(jì)選取3因素3水平。自變量試驗(yàn)水平以-1，0，1分別進(jìn)行編碼，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子及其水平Tab.1 Factors and its levels of response surface experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮提取工藝

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同提取溫度對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由圖1可知，在其他因素不變的前提下，在溫度為40℃~70℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，總黃酮提取量逐漸增大，在70℃時(shí)總黃酮提取量達(dá)到最高；之后隨著提取溫度進(jìn)一步升高，總黃酮提取量開始下降。這可能是由于黃酮類物質(zhì)是一類對(duì)溫度敏感的化合物，溫度過高會(huì)引起部分總黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)分解、破壞，或溶液中的其他雜質(zhì)溶出量增大，從而導(dǎo)致總黃酮類物質(zhì)的提取量下降[9]。綜合考慮，工藝優(yōu)化試驗(yàn)中提取溫度參數(shù)采用60℃、70℃、80℃作為響應(yīng)面分析中該因素的3個(gè)水平。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在其他因素不變的前提下，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%~80%時(shí)，隨著體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，總黃酮提取量逐漸升高，總黃酮提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)達(dá)到峰值；而后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，總黃酮提取量開始呈下降趨勢(shì)。原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，極性減小，溶液中其他親脂性物質(zhì)等雜質(zhì)溶出率也隨之增大，黃酮類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合乙醇-水分，從而影響了總黃酮的溶出[10]。綜合考慮，工藝優(yōu)化試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)參數(shù)采用70%、80%、90%作為響應(yīng)面分析中該因素的3個(gè)水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

不同液料比對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由圖3可知，在其他因素不變的條件下，液料比在20∶1~30∶1，隨著比例的不斷升高，總黃酮提取量逐漸增大；當(dāng)液料比達(dá)到30∶1后，隨著液料比的進(jìn)一步升高，總黃酮提取量變化較小。綜合提取提取量、提取溶劑成本等因素考慮，為減少過濾時(shí)間及溶劑浪費(fèi)，工藝優(yōu)化試驗(yàn)中液料比參數(shù)采用25∶1、30∶1、35∶1作為響應(yīng)面分析中該因素的3個(gè)水平。

2.1.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

1）響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選擇提取溫度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、液料比（C）作為自變量，以毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of response surface methodology

對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Design Expert 8.05軟件得到總黃酮提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比各因子的多元二次回歸方程，進(jìn)而獲得以總黃酮提取量為指標(biāo)的二次多項(xiàng)回歸模型為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.959 8。

對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果分析可知，回歸方程中以總黃酮提取量為目標(biāo)函數(shù)，其回歸效果均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；模型決定系數(shù)R2的數(shù)值為0.959 8，結(jié)果可說明該模型能較好地與實(shí)際試驗(yàn)相擬合；校正決定系數(shù)R2adj的數(shù)值為0.936 5，結(jié)果證明該模型能說明93.65%響應(yīng)值的變化；失擬項(xiàng)中P值為0.888 6，P值大于0.050 0說明模型的失擬項(xiàng)不顯著；依照顯著性分析結(jié)果，提取溫度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），總黃酮提取量受AA、BB、CC以及AC的交互項(xiàng)影響顯著（P＜0.05）。影響總黃酮提取量因素的大小順序依次為：提取溫度（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞液料比（C）。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.3 Analysis of variance of experimental results

2）響應(yīng)曲面圖結(jié)果與分析

依據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，探討提取溫度、液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量的影響。將提取溫度、液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)分別以0水平固定在模型中，從而獲得另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果[11]。二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖4～圖6。

由圖4～圖6可知，提取溫度（A）是對(duì)毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮提取量影響最顯著的因素，極值條件在等高線的圓心處，體現(xiàn)在響應(yīng)面有較大的弧度變化，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）。液料比（C）響應(yīng)面變化弧度迂緩，說明其影響響應(yīng)值的效果不明顯。交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可利用等高線的形狀來反映，如二因素交互作用顯著，則呈橢圓形，反之則為圓形。因此，提取溫度（A）與液料比（C）之間對(duì)總黃酮提取量的交互作用影響比較明顯。

圖4 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的交互影響Fig.4 Interaction of extraction temperature and ethanol concentration on the yield of total flavonoids

圖6 提取溫度和液料比對(duì)總黃酮提取量的交互作用Fig.6 Interaction effect of extraction temperature and liquidsolid ratio on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)總黃酮提取量的交互作用Fig.5 Interaction effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行分析，利用Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，可獲得其最佳提取條件：提取溫度為74.5℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為76.1%，液料比為31.1∶1，理論上總黃酮提取量可達(dá)43.61 mg·g-1。

根據(jù)最佳提取條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得總黃 酮 提 取 量 分 別 為42.78 mg·g-1、42.83 mg·g-1、42.76 mg·g-1?？傸S酮提取量的實(shí)際平均值可達(dá)42.79 mg·g-1，是回歸模型預(yù)測(cè)理論值的98.12%，這一結(jié)果說明試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值擬合較好。

3 結(jié)論

通過毛竹林下仿野生生態(tài)栽培的竹蓀，其品質(zhì)與野生竹蓀相近。目前傳統(tǒng)的毛竹經(jīng)營(yíng)效益不佳，林農(nóng)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)毛竹的積極性不大。通過毛竹生產(chǎn)與林下竹蓀栽培相結(jié)合，可以最大程度提高毛竹林下的生產(chǎn)潛力，增加林農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，促進(jìn)鄉(xiāng)村振興。采用總黃酮提取量作為考察指標(biāo)，Box-Behnken響應(yīng)面法分析提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比3個(gè)因素的影響，擬合出二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，方差分析表明，提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取結(jié)果影響顯著。對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化和預(yù)測(cè)，在優(yōu)化的工藝條件下，平行重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值基本吻合。通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化得出毛竹林下栽培竹蓀子實(shí)體總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取溫度74.5℃，液料比31.1∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)76.1%，該條件下總黃酮提取量為42.79 mg·g-1。該工藝為毛竹林下栽培的竹蓀中活性物質(zhì)的提取及精深加工提供依據(jù)。