基于UPLC-Q-Orbitrap-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的覆盆子治療2型糖尿病作用機(jī)制研究

崔琳琳 袁曉梅 高艷紅 姜佳峰 關(guān)永霞

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實(shí)，含有黃酮類、酚酸類、三萜類、生物堿等多種活性成分，具有降血糖、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。隨著社會(huì)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥的有效活性成分鑒定研究中，其具有高選擇性、高靈敏度和高精準(zhǔn)度等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢互補(bǔ)，對未知化合物的鑒定和識(shí)別展現(xiàn)出全面、精準(zhǔn)的具大優(yōu)勢[2-3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物信息學(xué)研究的重要工具，利用網(wǎng)絡(luò)可視化方法分析疾病與藥物及靶點(diǎn)間復(fù)雜的相互作用關(guān)系，具有整體性和系統(tǒng)性特點(diǎn)，目前已廣泛用于預(yù)測中藥調(diào)控機(jī)體生物網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制研究中[4]。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術(shù)對覆盆子中化學(xué)成分進(jìn)行全面快速的鑒定，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索其治療糖尿病的作用機(jī)制，以期為覆盆子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

覆盆子(批號(hào)：200910)，購于安徽中藥飲片有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為薔薇科植物華東覆盆子的干燥果實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

山奈酚3-O-云香糖苷(批號(hào)：112007-201602)、鞣花酸(批號(hào)：111959-201903)、椴樹苷(批號(hào)：112000-201802)、槲皮素(批號(hào)：100081-201610)、金絲桃苷(批號(hào)：111521-201809)、山奈酚(批號(hào)：110861-201812)、蘆丁(批號(hào)：100080-201811)，均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷(批號(hào)：ps01137p-0025MG)，購自成都普菲德生物醫(yī)藥科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，其余為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

UPLC-Q-Orbitrap-MS四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)，XS105DU型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，DRHH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，KS-5200DE型數(shù)顯恒溫超聲波清洗機(jī)(昆山潔力美超聲儀器有限公司)。

1.4 色譜條件

Waters CORTECS C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)梯度洗脫：0-5分鐘，10%～20%B；5-20分鐘，20%～30%B；20-50分鐘，30%～35%B；50-65分鐘，35%～40%B；65-95分鐘，40%～50%B；95-100分鐘，50%～60%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱溫30℃。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源采用HESI源，霧化電壓3.5 kV，鞘氣流速：35 μL/min；輔助氣流速：10 μL/min；毛細(xì)管溫度350℃；輔助氣加熱溫度：310℃；掃描模式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、負(fù)離子模式采集，掃描m/z范圍：100～1 500。

1.6 覆盆子活性成分和作用靶點(diǎn)收集

基于液質(zhì)聯(lián)用獲得的化學(xué)成分，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)對成分進(jìn)行篩選和補(bǔ)充，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.15為篩選條件，獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，篩選結(jié)束后，為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.7 2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)收集

以“Type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞，應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)得到2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.8 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為明晰覆盆子成分相關(guān)靶點(diǎn)與2型糖尿病靶點(diǎn)間的相互作用，將二者靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。進(jìn)一步將交集靶點(diǎn)提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，利用Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.9 活性成分—疾病靶點(diǎn)生物功能與通路富集分析

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，物種選擇為“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體論(Gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，建立數(shù)據(jù)文件，利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.10 分子對接驗(yàn)證

對覆盆子核心成分和PPI網(wǎng)絡(luò)得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫下載核心成分對應(yīng)小分子配體的2D結(jié)構(gòu)圖，通過PyMOL軟件將其轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)對應(yīng)的大分子受體蛋白的3D結(jié)構(gòu)，通過PyMOL軟件對其移除溶媒和配體分子，并導(dǎo)入AutoDockTools進(jìn)行加氫等預(yù)處理。使用AutoDockTools確定受體蛋白對接區(qū)域后，最終運(yùn)行AutoDockVina1.1.2對受體和配體進(jìn)行分子對接并計(jì)算結(jié)合能，利用PyMOL對模型進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 覆盆子化學(xué)成分分析

取覆盆子供試品溶液及混合對照品溶液，按1.4、1.5項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得到正、負(fù)離子質(zhì)譜圖，見圖1、圖2。使用Xcalibur 3.0軟件對質(zhì)譜信息進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及對照品進(jìn)行化合物鑒別[5-9]，鑒定出36種成分，其中黃酮類成分16個(gè)，鞣質(zhì)類成分12個(gè)，酚酸類成分8個(gè)，見表1。

圖2 覆盆子負(fù)離子模式下總離子流圖

表1 覆盆子主要化學(xué)成分表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 活性成分與靶點(diǎn)信息

通過數(shù)據(jù)庫篩選，共篩選覆盆子活性成分8種，潛在靶點(diǎn)155個(gè)，獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)1882個(gè)。將覆盆子8種活性成分與155個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中構(gòu)建“活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中共涉及163個(gè)節(jié)點(diǎn)(靶點(diǎn)蛋白)和242條邊(蛋白相互作用)，其中倒三角代表活性成分，菱形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行度值評價(jià)，篩選重要成分共4種(度值≥17)，有槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸，推測其是覆盆子治療2型糖尿病的關(guān)鍵成分。見圖3。

圖3 覆盆子活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選的覆盆子活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，進(jìn)而將靶點(diǎn)提交至STRING11.0平臺(tái)，將STRING11.0數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點(diǎn)蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有97個(gè)節(jié)點(diǎn)，776條邊。

節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺代表度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，其對應(yīng)的度值越大；邊的粗細(xì)程度代表結(jié)合分?jǐn)?shù)，邊越粗則結(jié)合分?jǐn)?shù)值越大。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)平均度值16，大于平均度值的核心節(jié)點(diǎn)共有36個(gè)，其中Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN靶點(diǎn)蛋白度值較高(>40)，是關(guān)鍵靶點(diǎn)，這提示覆盆子可能通過這些靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，同時(shí)也提示著各成分之間可能存在的協(xié)同作用。見圖4、圖5。

圖4 覆盆子治療2型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

圖5 覆盆子治療2型糖尿病的潛在作用靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

對覆盆子治療2型糖尿病的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分類和KEGG富集分析，GO功能富集包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)部分，其中生物過程主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、活性氧代謝過程、上皮細(xì)胞增殖等；細(xì)胞組分主要涉及膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)和質(zhì)膜蛋白復(fù)合物等；分子功能主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合和蛋白域特異性結(jié)合等。KEGG結(jié)果顯示主要涉及癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等，推測覆盆子是通過調(diào)節(jié)這些通路治療2型糖尿病的。見圖6～9。

圖6 覆盆子治療2型糖尿病的生物過程氣泡圖

圖7 覆盆子治療2型糖尿病的細(xì)胞組分氣泡圖

圖8 覆盆子治療2型糖尿病的分子功能氣泡圖

圖9 覆盆子治療2型糖尿病的KGGG通路氣泡圖

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將富集分析得到KEGG通路對應(yīng)覆盆子治療2型糖尿病的靶點(diǎn)及成分，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)由168個(gè)節(jié)點(diǎn)和694條邊構(gòu)成，其中圓形代表活性成分，菱形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)，倒三角代表信號(hào)通路。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行度值評價(jià)，根據(jù)度值、介度、緊密度確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。其中度值較高的成分有槲皮素(126)、山奈酚(52)、甾谷醇(29)、鞣花酸(17)。度值較高的通路有Pathways in cancer(60)、TNF信號(hào)通路(49)、MAPK信號(hào)通路(47)、AGE-RAGE信號(hào)通路(37)。

結(jié)果顯示覆盆子每種活性成分對應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)連接多種成分，體現(xiàn)了“多成分、多靶點(diǎn)”的作用機(jī)制，同時(shí)，多條通路之間是通過共有靶點(diǎn)連接而非獨(dú)立分開的，表明各條通路之間可發(fā)揮協(xié)同作用起到治療作用。見圖10。

圖10 覆盆子治療2型糖尿病的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前7的靶點(diǎn)蛋白，即Akt1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1和JUN與“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的活性成分：槲皮素、山奈酚、甾谷醇、鞣花酸和兒茶素。利用AutoDock Tools進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表2。對接分?jǐn)?shù)的絕對值越大，化合物與靶點(diǎn)結(jié)和力越強(qiáng)，分子構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)果顯示槲皮素、山奈酚與TP53的親和力最強(qiáng)，鞣花酸、兒茶素與TNF的結(jié)合能力最強(qiáng)，甾谷醇與VEGFA的結(jié)合能力最強(qiáng)。其中親和力較強(qiáng)的分子對接圖見圖11?？梢杂^察到藥物活性成分與靶點(diǎn)蛋白相結(jié)合的具體位點(diǎn)，黃色連線為二者之間的氫鍵相互作用力，是促使分子結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力。

表2 覆盆子治療T2DM核心成分與靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

圖11 覆盆子治療2型糖尿病核心成分與靶點(diǎn)分子對接圖

3 討論

本研究前期分別對提取溶劑(水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇)以及提取方法(超聲、回流)進(jìn)行了考察，以篩選最佳提取方法。結(jié)果表明采用70%甲醇回流提取時(shí)，各分析物響應(yīng)最好，提取率最高，提取效果最優(yōu)。在優(yōu)化色譜條件時(shí)，本研究重點(diǎn)比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水分別作為流動(dòng)相時(shí)的色譜行為，結(jié)果表明采用甲醇-0.1%甲酸水溶液做流動(dòng)相時(shí)的色譜峰較多且分離度較好。

本研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定出覆盆子36種成分，其中黃酮類成分16個(gè)，鞣質(zhì)類成分12個(gè)，酚酸類成分8個(gè)，并通過數(shù)據(jù)庫篩選出槲皮素、山奈酚、甾谷醇和鞣花酸等8個(gè)活性成分。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過上調(diào)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)胰島素的分泌[10]。此外，槲皮素還可改善高糖引起的細(xì)胞損傷，改善糖尿病大鼠的糖代謝水平，保護(hù)大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞免受高糖損傷。山奈酚可以與α-葡萄糖苷酶直接結(jié)合，表現(xiàn)出酶抑制效應(yīng)，降低體內(nèi)血糖含量[11]。鞣花酸[12]可顯著改善糖尿病小鼠脂肪組織異常的胰島素信號(hào)，降低脂肪組織Beclin1和LC3II/I蛋白表達(dá)。

KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)覆盆子治療2型糖尿病的主要信號(hào)通路有癌癥途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等。癌癥途徑主要與癌癥疾病相關(guān)，與該通路相關(guān)的靶基因有61個(gè)，這提示2型糖尿病與癌癥存在某些共同的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs-RAGE是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展主要原因之一，當(dāng)機(jī)體糖尿病應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，RAGE出現(xiàn)異常高表達(dá)，激活下游NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，使IL-6及TNF-α等炎癥因子大量釋放，出現(xiàn)組織細(xì)胞的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，引起各種病理變化，從而參與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[13-14]。HIF-1信號(hào)通路是機(jī)體低氧應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的主要靶點(diǎn),研究表明，抑制HIF-1α表達(dá)能降低糖尿病小鼠的血糖水平[15]。TNF-α是一類重要炎性遞質(zhì)，與胰島素抵抗有密切關(guān)系，TNF-α可干擾胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗[16-17]。

綜上，本研究通過UPLC-Q-Orbitrap-MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對覆盆子的化學(xué)成分進(jìn)行解析并對其治療2型糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析，建立了覆盆子“成分-疾病-通路”的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，并從多個(gè)角度探索覆盆子治療2型糖尿病的潛在分子機(jī)制，為覆盆子后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制研究提供了參考。