復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路及足細(xì)胞凋亡的影響

賈世艷 仲啟明 司瑞花 范曉陽(yáng) 嚴(yán)文允 劉光珍

膜性腎病是成人腎病綜合征的主要病因，約40%的患者在10年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病，依賴腎透析治療[1-3]。目前膜性腎病治療以激素、免疫抑制劑和細(xì)胞毒類藥物為主，長(zhǎng)期療效和安全性有待臨床的全面評(píng)估[4]。因此，尋找更安全有效的膜性腎病治療藥物成為亟待解決的問(wèn)題。足細(xì)胞自我修復(fù)和再生能力有限，其損傷程度與膜性腎病預(yù)后密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少的重要機(jī)制和促進(jìn)膜性腎病發(fā)展的重要因素，因此干預(yù)足細(xì)胞凋亡是延緩和治療膜性腎病有效策略[5-7]。復(fù)方蛇龍膠囊是課題組根據(jù)多年治療慢性腎臟病臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出“清熱利濕，活血化瘀”中醫(yī)組方理論基礎(chǔ)上形成的，前期研究表明復(fù)方蛇龍膠囊具有較高臨床緩解率，且無(wú)明顯毒副作用[8-9]。本研究擬從蛋白尿緩解、腎組織病理學(xué)改變和足細(xì)胞凋亡等方面，觀察復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)陽(yáng)離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)膜性腎病大鼠的治療作用，進(jìn)一步探討其治療膜性腎病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量160～180 g，6周齡，共60只，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(京)2017-0005，實(shí)驗(yàn)方案符合山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理要求，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度23～26 ℃，濕度45～50%，自由飲食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

復(fù)方蛇龍膠囊由穿山龍(批號(hào)：20191101)、鬼箭羽(批號(hào)：20190901)和白花蛇舌草(批號(hào)：20190801)組成，三種飲片均購(gòu)自山西省中醫(yī)院藥房。將上述3味中藥加10倍水煎煮2次，每次2小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.23～1.28(80 ℃)的清膏，真空干燥，粉碎成粗粉，備用；雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg。批號(hào)：20170602)。

1.3 主要試劑與儀器

陽(yáng)離子化牛血清白蛋白，弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為102062773、344291)；肌酐(serum Creatinine，SCr)，甘油三脂(triglycerides，TG)，總膽固醇(total cholesterol，TC)，白蛋白(albumin，ALB)，總蛋白(total protein，TP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20210225、20210304、20210226、20210226、20210301)；微量白蛋白(microalbumin，mALB)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(江蘇蘇州酶免生物技術(shù)有限公司，批號(hào)202012)；QuantiNova SYBR Green PCR Kit(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)208054)；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)2268313)；兔來(lái)源一抗Nephrin，Podocin，Bcl-2，Bad，磷酸化蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-Akt)，β-Actin(Abcam公司，批號(hào)分別為ab216341、ab181143、ab196495、ab32445、ab38449、ab179467)；二抗(Abcam公司，批號(hào)ab97051)。

H1型多功能微孔板讀板機(jī)(美國(guó)博騰)；7500型實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(美國(guó)ABI公司)；Veriti9902型定性PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Beckman Coulter流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；Mini-Protean型電泳系統(tǒng)，Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)；Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)(美國(guó)Kodak公司)；正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)；超薄切片機(jī)(Leica公司)；透射電子顯微鏡(Hitachi公司)。

1.4 動(dòng)物模型制備、實(shí)驗(yàn)分組及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組10只，造模組50只。按照改良 Border 法制備膜性腎病大鼠模型[10]，以大鼠24小時(shí)尿蛋白≥20 mg作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組，每組10只。大鼠給藥劑量根據(jù)人與大鼠的體表面積換算成等效給藥劑量[11]，分別給予雷公藤多苷片7.5 mg/kg，復(fù)方蛇龍膠囊0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)8周。使用代謝籠留取大鼠24小時(shí)尿液，離心取上清，4℃保存?zhèn)溆?；?shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食水12小時(shí)后使用異氟烷吸入麻醉，留取血清及腎組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血液和尿液生化指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清SCr、TG、TC、ALB、TP含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)尿mALB含量。

1.5.2 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)、馬松(Masson)染色和透射電鏡檢測(cè)腎臟組織病理學(xué)變化 將固定于4%多聚甲醛的腎組織脫水，石蠟包埋，切片，分別按照HE和Masson染色方法進(jìn)行制片，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化；2.5%戊二醛溶液固定腎組織，放置于PBS中浸洗3次，1%鋨酸固定，丙酮逐級(jí)脫水后進(jìn)行包埋聚合、超薄切片，乙酸雙氧鈾和酸鉛雙重染色，進(jìn)行透射電鏡觀察并拍照。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎臟組織細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組腎臟組織細(xì)胞凋亡變化，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎組織Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取腎組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制擴(kuò)增體系，擴(kuò)增條件為95 ℃ 5分鐘，95 ℃ 5秒，60 ℃ 35秒，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物委托上海生物工程技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.5.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)腎組織蛋白表達(dá) 使用RIPA緩沖液提取腎組織總蛋白，與5×Loading buffer混勻后100 ℃變性5分鐘，10% SDS-PAGE凝膠電泳45分鐘，PVDF轉(zhuǎn)膜90分鐘，5% BSA封閉PVDF膜60分鐘，一抗(Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bad、β-Actin，1∶2 000)室溫孵育120分鐘，洗膜后二抗(1∶5 000)室溫孵育30分鐘，ECL法顯色，用Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶/β-Actin 條帶灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠mALB、ALB、TP、TC、TG、SCr含量的影響

與正常組比較，模型組ALB和TP明顯降低，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組血清ALB和TP明顯升高，血清TC、TG、SCr和尿mALB明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)大鼠血液和尿液生化指標(biāo)的影響

2.2 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響

正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)腎組織纖維化，腎小球基底膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；模型組腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，藍(lán)色膠原纖維組織出現(xiàn)，基底膜增厚，足細(xì)胞損傷；與模型組相比，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎小球和足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不同程度改善，腎組織纖維化面積減少，腎小球基底膜病變減輕。見(jiàn)圖1～3。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

2.3 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組Nephrin和Podocin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3，4，圖5。

表3 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達(dá)的影響

表4 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)的影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

2.5 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎組織p-Akt、Bcl-2、Bad表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，Bad mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷片組、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，Bad mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表5、6，圖6。

表5 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)影響

注：A 正常組；B 模型組；C 雷公藤多苷片組；D 復(fù)方蛇龍膠囊低劑量組；E 復(fù)方蛇龍膠囊中劑量組；F 復(fù)方蛇龍膠囊高劑量組。

表6 復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)膜性腎病大鼠腎p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白表達(dá)影響

3 討論

膜性腎病臨床進(jìn)展緩慢，病程較長(zhǎng)，因此，對(duì)于經(jīng)保守治療未達(dá)到自發(fā)緩解的顯著蛋白尿患者，KDIGO指南推薦包括皮質(zhì)類固醇和環(huán)磷酰胺交替療程的改良Ponticelli方案作為一線治療[12-13]。近年來(lái)，我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在膜性腎病治療的臨床實(shí)踐中積累了大量臨床研究成果，在世界范圍內(nèi)逐漸得到認(rèn)可和廣泛應(yīng)用[14-15]。

膜性腎病的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿和低蛋白血癥，是膜性腎病診斷和療效評(píng)價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)[16]。腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能和形態(tài)異常，導(dǎo)致尿蛋白含量升高，血清ALB和TP含量下降，進(jìn)而促使肝臟代償性合成白蛋白和脂蛋白等，誘發(fā)高脂血癥，加重腎小球硬化、腎管間質(zhì)損傷等，相互作用促進(jìn)病程進(jìn)展，致使腎小球硬化，最終進(jìn)展為終末期腎病[17-18]。本研究采用改良Border法制備膜性大鼠模型，研究結(jié)果顯示復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)8周后，大鼠尿mALB含量明顯降低，血清ALB明顯升高，血尿生化指標(biāo)趨于正常，腎臟病理?yè)p傷程度得到改善，進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)方蛇龍膠囊能通過(guò)改善腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能、減輕足細(xì)胞損傷、減少腎組織纖維化程度，從而延緩膜性腎病進(jìn)展。

腎小球?yàn)V過(guò)屏障由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞組成。足細(xì)胞是一種高度分化的上皮細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)穿過(guò)分隔血液和尿間隙的毛細(xì)血管壁的選擇性過(guò)濾而構(gòu)成腎濾過(guò)屏障的核心細(xì)胞基礎(chǔ)[19]。作為膜性腎病發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，足細(xì)胞損傷主要與足細(xì)胞特異性蛋白及細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)異常相關(guān)，Podocin是足細(xì)胞中唯一整合膜蛋白，能夠直接與Nephrin相互作用，在形成足細(xì)胞裂孔膜支架和控制腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性中具有重要作用，Podocin表達(dá)水平降低將導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡和裂孔膜結(jié)構(gòu)被破壞[20-21]。Nephrin作為裂孔膜的關(guān)鍵成分，能夠向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，Nephrin表達(dá)缺失或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)異常將導(dǎo)致足細(xì)胞形態(tài)改變和蛋白尿產(chǎn)生[22-23]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)后能夠抑制膜性腎病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)足細(xì)胞標(biāo)志分子Nephrin和Podocin表達(dá)水平升高，進(jìn)而恢復(fù)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，修復(fù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能，有效降低尿蛋白。

膜性腎病病程遷延，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的改變，其復(fù)雜發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究表明激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)足細(xì)胞并改善蛋白尿[24-25]。p-Akt是PI3K的主要下游效應(yīng)分子，能夠阻斷Bcl-2和Bad的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞凋亡[26-27]。Bcl-2和Bad均為Bcl-2 家族成員，在維持線粒體膜完整性和細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[28-30]。本研究顯示，膜性腎病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bad表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2和p-Akt表達(dá)水平明顯降低，而經(jīng)過(guò)復(fù)方蛇龍膠囊干預(yù)后，凋亡信號(hào)通路被抑制，Bad表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2和p-Akt表達(dá)水平明顯升高，復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組腎組織細(xì)胞凋亡率較模型組明顯降低，結(jié)果表明復(fù)方蛇龍膠囊對(duì)陽(yáng)離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的膜性腎病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡具有較強(qiáng)的抑制作用。

綜上所述，復(fù)方蛇龍膠囊能夠抑制足細(xì)胞損傷和凋亡，維持細(xì)胞形態(tài)功能和數(shù)量穩(wěn)定，進(jìn)而恢復(fù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性，減少尿蛋白含量，這一過(guò)程可能是通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通過(guò)實(shí)現(xiàn)，其詳細(xì)作用機(jī)制仍值得進(jìn)一步探究。