• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    冠心康凍干粉通過(guò)SENP1/STAT3增強(qiáng)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬作用

    2022-10-11 12:57:40張一凡劉萍
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:冠心骨髓硬化

    張一凡 劉萍

    冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。近些年研究人員逐漸聚焦到胞葬作用及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[2],胞葬作用通過(guò)吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞)及時(shí)清理凋亡細(xì)胞,促進(jìn)炎癥消退及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn),縮小壞死核面積,增加斑塊穩(wěn)定性[3]。小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞通常被用來(lái)體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究,但對(duì)其胞葬作用的研究較少。

    本課題組結(jié)合中醫(yī)理論和前期的臨床研究,以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方,化裁得到冠心康。冠心康由黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草組成,具有益氣化痰活血之效。前期研究發(fā)現(xiàn),冠心康可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞的胞葬作用改善動(dòng)脈粥樣硬化[4-6]。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在觀察冠心康凍干粉(以下簡(jiǎn)稱“冠心康”)對(duì)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞小分子類(lèi)泛素修飾物特異性蛋白酶1(small ubiquitin-related modifiers /sentri-specific proteases 1,SENP1)/信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)分子表達(dá)及胞葬作用的影響,進(jìn)一步探討冠心康治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    雄性C57BL/6J小鼠6只,6周齡,體質(zhì)量為18~23 g,購(gòu)于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008,動(dòng)物合格證號(hào):202000150。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào):2019-N002)。

    1.2 試劑與儀器

    RIPA裂解液(批號(hào):P0013B)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào):P0010)、SDS-PAGE電泳試劑(批號(hào):103019200702)、中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(批號(hào):030521210525),巨噬細(xì)胞集落刺激因子(批號(hào):100421211007),均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司; STAT3、P-STAT3、GAPDH抗體(貨號(hào):34、12、7),購(gòu)自美國(guó)CST公司;TAM酪氨酸激酶受體(TYRO3/AXL/MER receptor tyrosine kinase)、血小板反應(yīng)蛋白-1(Thrombospondin 1,THBS1)、乳脂球表皮生長(zhǎng)因子8(milk fat globule-epidermal growth factor,MFGE8)抗體(批號(hào):GR284192-5、GR220083-6、GR153845-2、GR3304513-1),均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;SENP1抗體(批號(hào):K0817),購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司;引物(批號(hào):111359735)由上海閃晶分子生物科技有限公司合成;氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL,批號(hào):H3011720),購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

    高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)5810R,德國(guó) Eppendorf 公司);StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)7500,美國(guó) ABI 公司);酶標(biāo)儀(型號(hào)SynergyH4,美國(guó)BioTek公司);凝膠成像儀(型號(hào)731BR02744)、蛋白電泳儀(型號(hào)552BR 225015),均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;顯微鏡(型號(hào)403497,日本尼康公司)。

    1.3 藥物及凍干粉制備

    冠心康(黃芪30 g、全瓜蔞15 g、薤白12 g、制半夏12 g、益母草30 g、丹參12 g),由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。將全部草藥放入煎藥容器煎煮2次;藥液放冷后無(wú)菌紗布過(guò)濾3次,利用旋蒸儀,將中藥水煎液濃縮至 1 g/mL,置于-80℃冰箱過(guò)夜;次日使用冷凍干燥機(jī)制備冠心康凍干粉。DMEM培養(yǎng)基溶解凍干粉,超聲混勻過(guò)夜,混勻溶液用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌,配制成50 μg /mL原液,實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。

    1.4 骨髓源巨噬細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、分組[7]

    選取SPF級(jí)小鼠,腹腔麻醉后采用脊椎脫臼法處死小鼠,在75%乙醇中浸泡5分鐘,用剪刀分離雙腿,剔除腿部肌肉組織及其他軟組織,暴露出完整的股骨及脛骨;浸入75%乙醇中 5分鐘,預(yù)冷無(wú)菌 PBS 5分鐘;在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨;用無(wú)血清的 DMEM 培養(yǎng)基沖洗腿骨,將骨髓沖洗液加入到離心管中,1 000 r/min離心 5分鐘;去上清,加入10 mL 含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(10 μg/L)和含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸,然后分裝到細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于 37 ℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    選取上述細(xì)胞,用ox-LDL 40 μg/mL誘導(dǎo)6小時(shí),并分別給予含有冠心康凍干粉低、中、高劑量(1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL)的培養(yǎng)基,分為對(duì)照組、模型組、冠心康低劑量組、冠心康中劑量組、冠心康高劑量組。提取細(xì)胞樣本做后續(xù)檢測(cè),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞純度

    在 24 孔板中,加入濃度為 1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)。24小時(shí)后,棄上清,4%多聚甲醛固定10分鐘,0.1% Triton-X-100通透細(xì)胞15分鐘。含5% BSA 的0.2% PBST封閉細(xì)胞1小時(shí)。以一抗F4/80(1∶100)4 ℃ 孵育過(guò)夜,二抗(1∶1 000)室溫避光孵育 1小時(shí)。DAPI染核1分鐘,避光。在倒置相差熒光顯微鏡觀察拍照。

    1.6 中性紅法檢測(cè)細(xì)胞吞噬率

    在96孔板中,加入濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液100 μL,培養(yǎng)24小時(shí);PBS洗3次,分別加入完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基+ox-LDL、完全培養(yǎng)基+ox-LDL+低、中、高劑量冠心康,培養(yǎng)24小時(shí);PBS 洗3次,每孔加入20 μL中性紅染色液+200 μL培養(yǎng)基,孵育2小時(shí);去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗3次,加入200μL中性紅檢測(cè)裂解液,室溫?fù)u床上裂解10分鐘。測(cè)定540 nm處OD值。

    1.7 胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)

    采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)測(cè)定AXL、MERTK、TYRO3、THBS1 mRNA表達(dá),按照Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA選用ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。采用2-△△Ct法分析結(jié)果,計(jì)算目的基因在各組的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.8 蛋白免疫印跡法 (Western blotting)檢測(cè)胞葬相關(guān)蛋白表達(dá)

    加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品上樣至聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,電轉(zhuǎn)至 PVDF膜。封閉1小時(shí)后,分別以一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育1小時(shí)。電化學(xué)法顯影后,采集條帶并進(jìn)行灰度分析。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞純度

    免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞的純度,巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物 F4/80表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到 99%,表明小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。見(jiàn)圖1。

    2.2 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

    運(yùn)用中性紅法檢測(cè)細(xì)胞吞噬率。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞吞噬率降低(P<0.05);給予不同劑量的冠心康干預(yù)后,細(xì)胞吞噬率升高(P<0.05),表明冠心康增強(qiáng)了小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞的吞噬功能。見(jiàn)表2。

    表2 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞吞噬率的影響

    2.3 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

    運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1的mRNA表達(dá)降低(P<0.05);給予不同劑量的冠心康干預(yù)后,冠心康高劑量組AXL的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中劑量組TYRO3的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組MERTK、THBS1的mRNA表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)。見(jiàn)表3。

    表3 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響

    2.4 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

    運(yùn)用Western Blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞AXL、MERTK、TYRO3、THBS1、MFGE8 蛋白表達(dá)降低(P<0.05);給予冠心康干預(yù)后,冠心康低、中、高劑量組AXL、MERTK、TYRO3蛋白表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組THBS1、MFGE8y蛋白表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖2、表4。

    注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 冠心康低劑量組;D 冠心康中劑量組;E 冠心康高劑量組

    表4 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞胞葬相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

    2.5 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞SENP1/p-STAT3分子蛋白表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞SENP1、p-STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05);給予冠心康干預(yù)后,冠心康低、中、高劑量組SENP1蛋白表達(dá)升高(P<0.05),冠心康中、高劑量組 p-STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05),表明冠心康促進(jìn)SENP1/p-STAT3分子表達(dá)。見(jiàn)圖3、表5。

    注:A 對(duì)照組;B 模型組;C 冠心康低劑量組;D 冠心康中劑量組;E 冠心康高劑量組

    表5 冠心康對(duì)骨髓源巨噬細(xì)胞SENP1/p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    冠狀動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”“脈痹”等范疇。葉天士《臨證指南醫(yī)案》曰:“痹者……皆由氣血虧損,腠理疏豁,風(fēng)寒濕三氣得以乘虛外襲,留滯于內(nèi)以致濕痰、濁血流注凝澀而得之?!北咀C為本虛標(biāo)實(shí)之證,脾腎兩虛,氣虛導(dǎo)致痰濁、血瘀內(nèi)生,痰瘀互結(jié),痹阻脈絡(luò),發(fā)為痹癥[8]。因此在治療上需要健脾益氣、化痰祛瘀的治法[9]。本課題組結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化氣虛痰瘀的中醫(yī)病機(jī)和前期的臨床研究,以瓜蔞薤白半夏湯為基礎(chǔ)方臨證化裁為黃芪、丹參、瓜蔞、薤白、半夏、益母草,組成冠心康。全方以黃芪為君藥,補(bǔ)氣虛治本,其主要活性成分黃芪多糖能提高巨噬細(xì)胞吞噬活性[10];瓜蔞、丹參為臣藥,化痰活血,其中丹參多種活性成分如丹酚酸B、丹參酮IIA,對(duì)胞葬作用均有調(diào)控作用[11];薤白、半夏、益母草為佐藥,助臣藥化痰活血之力。全方具有益氣活血、化痰降濁之效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4-6],冠心康有效改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化,上調(diào)THBS1和TAM受體蛋白,促進(jìn)胞葬作用,但冠心康調(diào)控胞葬作用的機(jī)制尚不完善。

    有效的胞葬作用能防止凋亡細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死以及釋放炎性因子,減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[12]。胞葬作用的有效完成需要多種分子協(xié)同配合,如“尋我”信號(hào)分子、“食我”信號(hào)分子、橋接分子等。TAM酪氨酸激酶受體家族作為 “食我”受體,包括TYRO3、AXL和MERTK。當(dāng)MERTK缺失會(huì)加重小鼠炎癥,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13];TYRO3和MERTK的變異與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生關(guān)系密切[14]。THBS1、MFGE8均是橋接分子,負(fù)責(zé)結(jié)合凋亡細(xì)胞“食我”信號(hào)分子與巨噬細(xì)胞的吞噬受體。研究發(fā)現(xiàn),骨髓源性細(xì)胞中缺乏MFGE8會(huì)增加斑塊中凋亡細(xì)胞的積累[15]。在晚期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中,MFGE8、MERTK等多種胞葬相關(guān)分子發(fā)揮重要作用清除斑塊中凋亡細(xì)胞[16]。

    SENP1是一種半胱氨酸特異的蛋白酶,是SENP家族酶活性較強(qiáng)且最為經(jīng)典的成員,可以調(diào)控血管生成、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等[17]。研究發(fā)現(xiàn),SENP1+/-小鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著增大[18]。STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員,調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)等[19]。研究發(fā)現(xiàn),SENP1可以上調(diào)STAT3的磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性,活化的STAT3可以提高巨噬細(xì)胞的胞葬作用[20-21]。

    本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量降低;與模型組比較,冠心康干預(yù)后,細(xì)胞吞噬率、胞葬相關(guān)分子、SENP1、p-STAT3表達(dá)量升高。綜上所述,冠心康通過(guò)上調(diào)SENP1的表達(dá),促進(jìn)STAT3的磷酸化,從而增強(qiáng)骨髓源巨噬細(xì)胞的胞葬作用,但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為SENP1、STAT3與巨噬細(xì)胞胞葬作用的關(guān)系提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    猜你喜歡
    冠心骨髓硬化
    Ancient stone tools were found
    山東:2025年底硬化路鋪到每個(gè)自然村
    HPLC法同時(shí)測(cè)定冠心丹參片中10種成分
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:16
    宮頸癌術(shù)后調(diào)強(qiáng)放療中骨髓抑制與骨髓照射劑量體積的關(guān)系
    Apelin-13在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值
    贊美骨髓
    文苑(2018年18期)2018-11-08 11:12:42
    磨削硬化殘余應(yīng)力分析與預(yù)測(cè)
    冠心舒通膠囊對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+ -CaM-CaMPK Ⅱ δ信號(hào)系統(tǒng)的影響
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:17
    骨髓穿刺涂片聯(lián)合骨髓活檢切片在骨髓增生異常綜合征診斷中的應(yīng)用
    冠心七味丸對(duì)大鼠血管球囊損傷再狹窄的治療作用研究
    av网站免费在线观看视频| av一本久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲国产色片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲av二区三区四区| 免费观看a级毛片全部| 啦啦啦在线观看免费高清www| 9色porny在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲第一av免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 69精品国产乱码久久久| 免费观看无遮挡的男女| 韩国高清视频一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品免费大片| 97精品久久久久久久久久精品| 免费少妇av软件| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 视频中文字幕在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| av在线老鸭窝| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 夫妻午夜视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲三级黄色毛片| 欧美精品一区二区大全| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲成人手机| 亚洲国产精品成人久久小说| 高清欧美精品videossex| 免费少妇av软件| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产欧美亚洲国产| 亚洲成人av在线免费| 亚洲成色77777| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 少妇人妻 视频| kizo精华| 国产一区有黄有色的免费视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲综合色惰| 91久久精品国产一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成人手机| 午夜激情福利司机影院| 自线自在国产av| a级一级毛片免费在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 婷婷色av中文字幕| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 性高湖久久久久久久久免费观看| 中文天堂在线官网| 深夜a级毛片| 亚洲自偷自拍三级| av在线播放精品| 国产精品熟女久久久久浪| 狂野欧美激情性bbbbbb| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩电影二区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产熟女欧美一区二区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 99热网站在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产伦理片在线播放av一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 我要看黄色一级片免费的| 欧美成人午夜免费资源| 中文字幕久久专区| 黄色日韩在线| 国产极品天堂在线| 七月丁香在线播放| 精品少妇久久久久久888优播| 日本黄色片子视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av成人精品一二三区| 校园人妻丝袜中文字幕| 婷婷色综合www| 99热全是精品| 久久久久久久国产电影| 涩涩av久久男人的天堂| 精品视频人人做人人爽| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黑丝袜美女国产一区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲欧美精品专区久久| 人人妻人人澡人人看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品欧美亚洲77777| 六月丁香七月| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久精品久久久久久久性| 九九爱精品视频在线观看| 老女人水多毛片| 熟女电影av网| 精品久久久久久久久av| 亚洲精品第二区| 久久av网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久6这里有精品| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产av精品麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 99热6这里只有精品| 国产探花极品一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 最新中文字幕久久久久| 久久久久网色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本午夜av视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 97超碰精品成人国产| 欧美精品一区二区免费开放| 最近手机中文字幕大全| 亚洲第一av免费看| 69精品国产乱码久久久| 丝袜脚勾引网站| 人妻一区二区av| 最新中文字幕久久久久| 51国产日韩欧美| 亚洲,欧美,日韩| 精品久久久久久电影网| 国产精品一二三区在线看| 日韩成人伦理影院| 国产精品无大码| 成人国产av品久久久| 亚洲av中文av极速乱| 国产在线视频一区二区| 国产永久视频网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黄色一级大片看看| 欧美国产精品一级二级三级 | 草草在线视频免费看| 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜免费男女啪啪视频观看| 婷婷色综合大香蕉| 国产黄色视频一区二区在线观看| 看十八女毛片水多多多| 色哟哟·www| 青春草国产在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲人与动物交配视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 最新中文字幕久久久久| 午夜激情福利司机影院| 中文字幕人妻丝袜制服| av天堂久久9| 亚洲人成网站在线播| 寂寞人妻少妇视频99o| 国国产精品蜜臀av免费| av线在线观看网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 美女福利国产在线| 国产精品不卡视频一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 一级黄片播放器| 伦理电影大哥的女人| 久久人人爽人人爽人人片va| 晚上一个人看的免费电影| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 看免费成人av毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 热re99久久精品国产66热6| 最近中文字幕2019免费版| 久久人人爽人人爽人人片va| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 最近的中文字幕免费完整| 久久亚洲国产成人精品v| 人人妻人人澡人人看| 乱系列少妇在线播放| 久久久久久久久久成人| 十分钟在线观看高清视频www | av网站免费在线观看视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲第一av免费看| 日韩制服骚丝袜av| 三级国产精品片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 在现免费观看毛片| 午夜日本视频在线| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 99热国产这里只有精品6| 国产高清有码在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美精品一区二区大全| 久久久久久伊人网av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜激情福利司机影院| 在线观看免费视频网站a站| 成人毛片a级毛片在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 美女主播在线视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 99九九在线精品视频 | 国产精品一区二区在线观看99| 国产一区二区三区av在线| av一本久久久久| 国产美女午夜福利| 日本欧美视频一区| 欧美三级亚洲精品| 精品国产一区二区久久| 国精品久久久久久国模美| 亚洲国产成人一精品久久久| 色5月婷婷丁香| 街头女战士在线观看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 在线观看免费高清a一片| 精品亚洲成国产av| 欧美bdsm另类| 欧美3d第一页| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 观看美女的网站| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲av成人精品一二三区| 国产美女午夜福利| 午夜福利网站1000一区二区三区| 99久久综合免费| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美精品国产亚洲| av在线老鸭窝| 亚洲av男天堂| 女的被弄到高潮叫床怎么办| freevideosex欧美| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 高清在线视频一区二区三区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 亚洲国产精品国产精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲高清免费不卡视频| 99国产精品免费福利视频| 各种免费的搞黄视频| 最近手机中文字幕大全| 男人狂女人下面高潮的视频| 黄片无遮挡物在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产一区二区在线观看av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲欧洲国产日韩| 9色porny在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | av免费在线看不卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 妹子高潮喷水视频| 欧美日本中文国产一区发布| 少妇丰满av| 插阴视频在线观看视频| 丝瓜视频免费看黄片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月玫瑰六月丁香| 少妇 在线观看| 日韩成人伦理影院| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 如何舔出高潮| 99视频精品全部免费 在线| av在线观看视频网站免费| 秋霞伦理黄片| 国产欧美日韩精品一区二区| 最新的欧美精品一区二区| 丰满少妇做爰视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲国产av新网站| 99热全是精品| 国产精品国产三级专区第一集| 91久久精品国产一区二区成人| 青春草视频在线免费观看| 久久人妻熟女aⅴ| 啦啦啦在线观看免费高清www| 男人爽女人下面视频在线观看| 午夜视频国产福利| 国产一区二区三区av在线| 国产黄片视频在线免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 看十八女毛片水多多多| 777米奇影视久久| 久久精品夜色国产| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久6这里有精品| 亚洲第一av免费看| 亚洲真实伦在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品女同一区二区软件| 18+在线观看网站| 亚洲内射少妇av| 亚洲第一av免费看| 午夜激情久久久久久久| 国产淫语在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久国产欧美日韩av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 极品教师在线视频| 日韩中字成人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 成人影院久久| 色5月婷婷丁香| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人特级av手机在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 精品一区在线观看国产| 97超碰精品成人国产| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲自偷自拍三级| 久久狼人影院| 一级毛片电影观看| 中文资源天堂在线| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美高清成人免费视频www| 91久久精品国产一区二区三区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 中国三级夫妇交换| 成人综合一区亚洲| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产日韩欧美亚洲二区| 各种免费的搞黄视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 中国三级夫妇交换| 久久狼人影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩av免费高清视频| 国产色爽女视频免费观看| 成人国产av品久久久| 97超碰精品成人国产| 亚洲内射少妇av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲内射少妇av| 久热这里只有精品99| 丰满乱子伦码专区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久这里有精品视频免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 丝袜喷水一区| 久久久久视频综合| 日韩一区二区视频免费看| 午夜激情久久久久久久| 国产在线男女| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩强制内射视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 午夜激情久久久久久久| 另类亚洲欧美激情| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜福利,免费看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美区成人在线视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 五月天丁香电影| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲人与动物交配视频| 午夜av观看不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲欧美精品专区久久| 91精品国产九色| 中文欧美无线码| 热re99久久精品国产66热6| 日本午夜av视频| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 丁香六月天网| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品人妻久久久久久| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美人与善性xxx| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜福利,免费看| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美激情国产日韩精品一区| 搡老乐熟女国产| 国产淫语在线视频| 欧美人与善性xxx| 99国产精品免费福利视频| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品久久久久成人av| 亚洲av成人精品一二三区| 在线观看免费高清a一片| 伦精品一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 精品视频人人做人人爽| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久国产精品麻豆| 国产在视频线精品| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品蜜桃在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 十八禁网站网址无遮挡 | 黄色一级大片看看| 亚洲欧美清纯卡通| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产视频内射| 亚洲美女视频黄频| 免费少妇av软件| 国产视频首页在线观看| 人妻一区二区av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 下体分泌物呈黄色| 深夜a级毛片| 伊人久久国产一区二区| 色哟哟·www| 欧美+日韩+精品| 99久久综合免费| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品一二三区在线看| 久久国产乱子免费精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲内射少妇av| 亚洲,欧美,日韩| 精品国产国语对白av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久99热6这里只有精品| 成人国产麻豆网| 国产乱人偷精品视频| 一本色道久久久久久精品综合| 99久久精品一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 中文字幕制服av| 亚洲av.av天堂| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 精品一区二区三区视频在线| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一级二级三级毛片免费看| 久久久久国产网址| 能在线免费看毛片的网站| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲伊人久久精品综合| 美女中出高潮动态图| 免费大片18禁| 国产有黄有色有爽视频| 少妇熟女欧美另类| 最黄视频免费看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品一区二区在线不卡| 国产高清不卡午夜福利| 在线 av 中文字幕| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 中国国产av一级| 黄色配什么色好看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一区在线观看完整版| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美精品一区二区免费开放| 在线观看人妻少妇| 9色porny在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av播播在线观看一区| 国内精品宾馆在线| 三级国产精品片| 久久99一区二区三区| 热re99久久国产66热| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 看非洲黑人一级黄片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人黄色视频免费在线看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 五月伊人婷婷丁香| 熟妇人妻不卡中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品.久久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产黄片美女视频| 国内精品宾馆在线| 国产成人精品无人区| 在线免费观看不下载黄p国产| 91久久精品电影网| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费在线观看成人毛片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 免费av中文字幕在线| 97超碰精品成人国产| 国产亚洲最大av| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品免费大片| 人人妻人人看人人澡| 一级二级三级毛片免费看| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级a做视频免费观看| 久久久欧美国产精品| 一级毛片电影观看| 国产毛片在线视频| 久久97久久精品| av天堂中文字幕网| 我要看黄色一级片免费的| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品伦人一区二区| 大片电影免费在线观看免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 51国产日韩欧美| 亚洲综合色惰| 亚洲久久久国产精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产男人的电影天堂91| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产在视频线精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 高清黄色对白视频在线免费看 | 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 黄色配什么色好看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜免费男女啪啪视频观看| videossex国产| 日日啪夜夜撸| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久久久久精品精品| 久久热精品热| 丁香六月天网| 久久97久久精品| 国产黄色免费在线视频| 午夜影院在线不卡| 久久韩国三级中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美3d第一页| 大片电影免费在线观看免费| 老司机影院毛片| 久久精品夜色国产| 人人妻人人澡人人看| 国产伦理片在线播放av一区| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品偷伦视频观看了| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 高清不卡的av网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本欧美视频一区| 嫩草影院入口| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 免费观看无遮挡的男女| 国产亚洲5aaaaa淫片| 内地一区二区视频在线|