麥粒灸對(duì)環(huán)磷酰胺小鼠骨髓細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)的影響

趙帥 程艷婷 朱濤 丁彥澤 侯玉鐸 孟立強(qiáng)

化療是惡性腫瘤治療的三大手段之一，而經(jīng)化療藥物治療后出現(xiàn)的種種不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量[1]。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作為烷化類免疫抑制劑，被廣泛用于腫瘤的化療中，其細(xì)胞毒性明顯，可破壞細(xì)胞內(nèi)部DNA結(jié)構(gòu)，阻斷復(fù)制途徑，影響分裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。因其殺死細(xì)胞的作用不具有特異性，同樣也會(huì)對(duì)骨髓產(chǎn)生嚴(yán)重影響，損害造血干細(xì)胞，降低外周血白細(xì)胞[3]。

造血細(xì)胞的正常發(fā)育、成熟保障了造血功能的穩(wěn)定，而整個(gè)過程都與細(xì)胞凋亡的參與密不可分。細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)以及是否發(fā)生凋亡，有許多信號(hào)分子的參與，癌基因、原癌基因?yàn)槿怂熘?，其中Bcl-2家族占有關(guān)鍵性作用[4]。報(bào)道表明[5-7]，麥粒灸具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)抗病能力的作用。麥粒灸因其溫?zé)嶂?，作用于特定腧穴，達(dá)到扶正固本、達(dá)邪外出之功[8]。本實(shí)驗(yàn)以CTX建立小鼠白細(xì)胞減少癥模型，從外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓形態(tài)學(xué)、骨髓細(xì)胞凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X,BAX)表達(dá)量四個(gè)方面，探討CTX小鼠經(jīng)麥粒灸治療后對(duì)其產(chǎn)生的影響，并進(jìn)一步研究麥粒灸抑制細(xì)胞凋亡、減緩骨髓抑制的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

7周齡SPF級(jí)雄性CD1(ICR)小鼠45只，體質(zhì)量(35±1)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)章程規(guī)范操作，倫理審批號(hào)：2019DW233。實(shí)驗(yàn)小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為空白組、模型組、麥粒灸組，每組15只。

1.2 主要試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺(安道生，Baxter Oncology GmbH，0.2 g/瓶，批號(hào)：0E386A)，多聚甲醛固定液(Servicebio公司，貨號(hào)：G1101-500ML)，Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit(Servicebio公司，貨號(hào)：G1511)，20×檸檬酸抗原修復(fù)液(Servicebio公司，貨號(hào)：G1202-250ML)，蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染液(Servicebio公司，貨號(hào)：G1005-500ML)，牛血清白蛋白(Servicebio公司，貨號(hào)：G5001-5G)，免疫組化二抗試劑盒(Servicebio公司，貨號(hào)：G1215-200T)，Bcl2 Antibody(Cusabio，貨號(hào)：CSB-RA002611A0HU)，BAX Antibody(Cusabio，貨號(hào)：CSB-PA000976)。

顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)：ECLIPSE Ci_S)，切片機(jī)(亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：YGQ-III)，BD流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號(hào)：FACSCalibur)。

1.3 模型制備

除空白組外其余小鼠均做造模處理，造模方法為腹腔注射CTX 80 mg/kg，每日一次，連續(xù)3天，建立白細(xì)胞減少癥模型小鼠[9]；空白組相同時(shí)間腹腔注射0.2 mL生理鹽水。

1.4 取穴及治療方法

依課題組前期成果取穴大椎、足三里、三陰交[10-11]。定位參考《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》[12]，小鼠取穴模擬大鼠的定位方法：大椎位于頸7與胸1之間，后正中線上；足三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下5 mm；三陰交位于內(nèi)踝尖直上10 mm。

麥粒灸組：選用上述腧穴，每天用麥粒大小艾柱(1 g)進(jìn)行艾灸，以小鼠強(qiáng)力扭轉(zhuǎn)身體為度，每穴各三壯。每日1次，連續(xù)7天。

空白組、模型組：連續(xù)7天陪同麥粒灸組小鼠做抓取、固定動(dòng)作，且時(shí)間、力度相同，不做麥粒灸治療。

1.5 取材方法

末次治療結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，摘取左側(cè)完整股骨，除凈軟組織，置于固定液中；右側(cè)股骨同樣去除軟組織，并剪去兩側(cè)干骺端，用2 mL注射器吸取定量PBS將紅色條帶狀骨髓沖出，再用1 mL注射器針頭反復(fù)吸取過濾制成單個(gè)骨髓細(xì)胞懸液備用。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù) 小鼠于CTX造模前當(dāng)天、治療第3天、5天、7天完成后，用手術(shù)刀片于尾靜脈處劃割采血，吸取血樣10 μL/只，滴入稀釋液中混勻，取少許懸液，鏡下計(jì)數(shù)。

1.6.2 骨髓形態(tài)學(xué)觀察 股骨經(jīng)多聚甲醛固定24小時(shí)后，置于EDTA脫鈣液中，以股骨富有彈性能被輕易折彎，或針尖能輕松刺入組織時(shí)判斷脫鈣完成，流水沖洗后即可進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片、染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.6.3 骨髓有核細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將制備好的骨髓細(xì)胞懸液離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌兩次后收集1～5×105個(gè)細(xì)胞，按試劑盒說明加入Binding Buffer稀釋液輕柔重懸細(xì)胞，再依次加入Annexin V-FITC/PI，室溫避光條件下反應(yīng)10分鐘，1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.4 免疫組化法檢測(cè)骨髓細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA室溫封閉30分鐘，去除封閉液，滴加一抗Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)，4℃孵育過夜，滴加二抗(1∶200)，室溫孵育50分鐘；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；脫水，封片。400倍鏡下觀察拍照，采集5個(gè)視野。Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽性面積，以平均陽性面積作為蛋白表達(dá)量，并計(jì)算平均光密度值，反映陽性信號(hào)的平均深淺。每組隨機(jī)選取8只小鼠的骨髓切片進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

造模前各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異(P>0.05)；治療3天后，模型組與麥粒灸組白細(xì)胞計(jì)數(shù)均有下降，與空白組比較差異明顯(P<0.01)，說明CTX對(duì)小鼠細(xì)胞毒作用明顯，造模成功，麥粒灸組白細(xì)胞計(jì)數(shù)要略高于模型組(P<0.05)；治療5天后，模型組下降到最低值，而麥粒灸組表現(xiàn)出一定的治療效果，白細(xì)胞數(shù)有上升趨勢(shì)，與模型組比較差異明顯(P<0.05)；在治療7天后，各組小鼠均表現(xiàn)出一定的自愈康復(fù)傾向，且麥粒灸組要明顯高于模型組(P<0.01)，模型組仍低于空白組(P<0.05)。見表1。

表1 各組CTX小鼠麥粒灸治療前后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.2 各組小鼠骨髓造血組織病理變化

治療結(jié)束后各組小鼠骨髓切片HE染色結(jié)果顯示：空白組造血組織豐富，細(xì)胞排列緊密，造血功能旺盛，脂肪細(xì)胞數(shù)量較少；模型組小鼠骨髓造血組織破壞嚴(yán)重，血細(xì)胞生成減少，細(xì)胞排列疏松，有核細(xì)胞明顯減少；經(jīng)麥粒灸治療后，造血組織有所恢復(fù)，骨髓有核細(xì)胞數(shù)量明顯增。見圖1。

圖1 各組CTX小鼠骨髓造血組織病理學(xué)變化比較(HE染色，×200)

2.3 各組小鼠骨髓有核細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠骨髓有核細(xì)胞凋亡率，空白組凋亡率(7.89±0.87)%，模型組凋亡率(23.58±1.98)%，麥粒灸組凋亡率(10.90±1.25)%，空白組、麥粒灸組凋亡率顯著低于模型組(P<0.01)，且空白組也顯著低于麥粒灸組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組CTX小鼠骨髓有核細(xì)胞凋亡率比較

2.4 各組小鼠股骨骨髓Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況比較

治療結(jié)束后，空白組、麥粒灸組Bcl-2蛋白表達(dá)相比無明顯差異(P>0.05)，且均高于模型組(P<0.01)；麥粒灸組在陽性表達(dá)深淺上與空白組、模型組無顯著差異(P>0.05)，模型組染色要弱于空白組(P<0.05)。見圖3，表2。

注：棕黃色為陽性染色，藍(lán)色為蘇木素染色。

表2 各組CTX小鼠骨髓造血組織Bcl-2蛋白含量比較

Bax蛋白表達(dá)方面，模型組明顯高于空白組和麥粒灸組(P<0.01)，麥粒灸組表達(dá)較空白組也有明顯升高(P<0.01)；在陽性表達(dá)深淺上，空白組與麥粒灸組無顯著差異(P>0.05)，模型組染色程度要深于空白組和麥粒灸組(P<0.01)。見圖4，表3。

注：棕黃色為陽性染色，藍(lán)色為蘇木素染色。

表3 各組CTX小鼠骨髓造血組織BAX蛋白含量的比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)于使用化療藥后所造成的白細(xì)胞減少、骨髓抑制等情況并無明確記載，但其發(fā)生的病因、病機(jī)多為正氣虛損，又遭化學(xué)藥物之“外來毒邪”所傷，而致脾腎兩虛，氣血乏源，繼而出現(xiàn)身困乏力、形體羸瘦、納谷不馨、脈虛無力等一系列虛損癥候，據(jù)此可歸于中醫(yī)“虛勞”范疇[13]?！鹅`樞》所述“髓海不足”則“懈怠安臥”，亦有虛、勞之疾，宜補(bǔ)、宜溫等治則。本研究通過艾灸大椎、足三里、三陰交以拮抗化療后不良反應(yīng)。督脈大椎與諸陽經(jīng)相交會(huì)，具有振陽起痿、祛邪扶正之功；足三里是足陽明之脈所入為合的合土穴，艾灸三里有助氣血生化，充養(yǎng)形體，凡久病元?dú)馑ネ觯刑撚趦?nèi)所致之疾，均屬本穴主治；三陰交為肝脾腎三經(jīng)交會(huì)之處，對(duì)其氣化功能失常所致病候具有一定的功效，有補(bǔ)益全身血分之虧虛及通暢全身血液運(yùn)行的作用[14]。三穴合用，具有助陽化氣，溫補(bǔ)脾腎，調(diào)和氣血，固本填髓之功。

Bcl-2基因是一種能抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，其編碼的Bcl-2蛋白抗凋亡作用明顯，可在線粒體內(nèi)通過調(diào)控活性氧水平，有效清除氧自由基，并且使谷胱甘肽更容易進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，改善內(nèi)部氧化還原情況，抑制凋亡。與之相反的Bax蛋白為促凋亡蛋白，當(dāng)收到凋亡信號(hào)時(shí)，該蛋白會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)位，通過胞質(zhì)進(jìn)入線粒體，與Bcl-2蛋白結(jié)合，形成同源二聚體，破壞細(xì)胞膜的完整性，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[15]。Bcl-2和Bax蛋白量的多少?zèng)Q定細(xì)胞發(fā)生凋亡與否，Bcl-2/Bax值上調(diào)則抑制凋亡，下降則促進(jìn)凋亡[16]。

為探究麥粒灸對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)CTX化療小鼠骨髓內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，腹腔注射CTX小鼠能很好地模擬化療后出現(xiàn)的白細(xì)胞減少、骨髓抑制狀態(tài)。在治療3天、5天時(shí)，模型組白細(xì)胞仍持續(xù)降低，提示CTX的細(xì)胞毒作用呈持續(xù)狀態(tài)。而經(jīng)麥粒灸治療的小鼠有著明顯的拮抗CTX細(xì)胞毒作用，白細(xì)胞回升提前，這與路玫等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。1周后白細(xì)胞數(shù)甚至超過原有水平，且顯效時(shí)間較藥物療法明顯縮短[18]。鏡下觀察小鼠骨髓造血組織損害程度減輕，表明麥粒灸對(duì)于化療后產(chǎn)生的骨髓抑制確有療效。

為維持骨髓造血細(xì)胞正常發(fā)育成熟與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，機(jī)體將衰老、異變的細(xì)胞通過凋亡途徑予以清除[19]。腹腔注射CTX后，骨髓細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax表達(dá)增多，Bcl-2/Bax兩者比值降低，骨髓細(xì)胞發(fā)生凋亡增多。經(jīng)麥粒灸治療后，骨髓細(xì)胞凋亡率有明顯下降，確可逆轉(zhuǎn)化療后細(xì)胞凋亡水平。且Bax表達(dá)明顯下降，Bcl-2表達(dá)有所增加，比值上調(diào)，細(xì)胞凋亡率有所減少，提示麥粒灸對(duì)于減輕骨髓抑制，降低細(xì)胞凋亡率的作用可能與調(diào)控Bcl-2、Bax的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，麥粒灸大椎、足三里、三陰交三穴，可以增加CTX化療小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過調(diào)控Bcl-2/Bax蛋白抑制骨髓細(xì)胞的凋亡，減輕小鼠骨髓組織的損傷，恢復(fù)骨髓造血功能。