辣椒苗期耐低溫弱光鑒定指標研究

王春萍 張世才 楊小苗 蔣曉英 李怡斐 黃啟中 黃任中 林 清

(1重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級重點實驗室，重慶 401329；2重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，重慶 401329)

辣椒(Capsicum annumL.)喜溫，正常生長溫度為20～30℃，最適生長溫度為24～28℃，低于15℃生長發(fā)育受阻，持續(xù)低于12℃植株可能受低溫傷害，低于5℃植株受低溫傷害嚴重或死亡[1-2]；辣椒又是中光性作物，光照不足會導(dǎo)致植株徒長，花蕾發(fā)育不良，易出現(xiàn)落花落果現(xiàn)象[3]。低溫弱光天氣對于我國北方設(shè)施栽培辣椒十分不利，南方早春的倒春寒天氣也可能給辣椒生產(chǎn)帶來嚴重損失。加強耐低溫弱光辣椒資源評價、培育耐低溫弱光品種是抵御低溫弱光逆境的最理想途徑，而確立準確高效的耐低溫弱光鑒定方法是實現(xiàn)該徑的前提條件之一。

辣椒耐低溫鑒定方法研究起步較早，已取得較多研究進展[4-7]。辣椒耐低溫弱光鑒定方法研究起步較晚，也取得了一些進展，如劉雪梅[8]和朱晨曦[9]利用相對株高、相對莖粗、相對葉長和相對葉寬等生長指標對辣椒進行了耐低溫弱光性鑒定，頡建明等[10-12]和王春萍等[13]研究了滲透物質(zhì)、類胡蘿卜含量以及葉綠素熒光參數(shù)與辣椒耐低溫弱光性的關(guān)系。這些研究為辣椒耐低溫弱光鑒定提供了重要參考，但目前辣椒耐低溫弱光鑒定方法仍缺少一套高效統(tǒng)一的鑒定指標，要建立更加準確可靠的方法還需要將生長指標和生理指標相結(jié)合，進行更加綜合系統(tǒng)的研究。

本研究以5 份耐低溫弱光特性不同的辣椒為材料，研究了低溫弱光處理后辣椒幼苗的冷害指數(shù)、SPAD 值、葉綠素熒光參數(shù)和根系形態(tài)等指標變化，并分析了恢復(fù)生長28 d 后這些指標以及干物質(zhì)量積累的恢復(fù)情況，從中篩選最適宜的辣椒苗期耐低溫弱光鑒定指標，旨在優(yōu)化辣椒耐低溫弱光鑒定指標，為確立準確高效的辣椒耐低溫弱光鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為茄門甜椒、南京早椒、US12、US20 和US21 等5 份辣椒材料，其中茄門甜椒低溫敏感，南京早椒耐低溫，由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒研究室提供，US12、US20 和US21 是由美國新墨西哥州立大學(xué)引進的自交系材料，耐低溫特性未知。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 低溫弱光處理 選取籽粒飽滿的辣椒種子于55℃蒸餾水中浸泡15 min，再用蒸餾水沖洗3 次，然后于25℃蒸餾水浸泡1～2 h。將種子平放于鋪有2 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃黑暗培養(yǎng)至萌發(fā)。待胚芽長至0.5 cm 左右，播種于漂浮板上，利用營養(yǎng)液水培[14]，晝/夜溫度28℃/25℃，光照300 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h。長至四葉一心時，選擇長勢較為整齊的辣椒幼苗為試驗材料，試驗設(shè)對照組和低溫弱光組，對照組植株在晝/夜溫度28℃/25℃(晝/夜)，光照300 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h 條件下生長，每種材料設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 棵植株。低溫弱光組植株在晝/夜溫度10℃/5℃，光照100 μmol·m-2·s-1，光周期12 h/12 h 條件下生長，每種材料設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 棵植株，處理5 d 后進行冷害指數(shù)統(tǒng)計[7]，并與對照組植株一起進行葉片SPAD 值、根系形態(tài)和葉綠素熒光參數(shù)測定。

1.2.2 恢復(fù)生長處理 將1.2.1 中低溫處理5 d 后的材料轉(zhuǎn)入與對照組植株相同的條件下生長，28 d 后和對照組植株一起進行SPAD 值、葉綠素熒光參數(shù)、根系形態(tài)、莖葉干重和根系干重測定，并計算根冠比。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 冷害指數(shù)測定 根據(jù)植株受低溫弱光傷害程度將其分為5 個冷害等級:

0 級:無明顯癥狀；

1 級:植株第1、第2 葉葉緣失水，其他無明顯冷害癥狀；

2 級:植株第1、第2 葉葉緣失水嚴重，第3 葉葉緣略失水，心葉無明顯冷害癥狀；

3 級:植株第1、第2 葉葉緣出現(xiàn)脫水斑，第3 葉葉緣嚴重失水，心葉略失水；

4 級:植株第1、第2 葉脫水斑連接成片，葉片萎蔫，第3 葉出現(xiàn)脫水斑，心葉嚴重失水；

5 級:全部葉片萎焉，幼苗在常溫下不能恢復(fù)。

冷害指數(shù)=Σ(各級株數(shù)×級數(shù))/(總株數(shù)×最高級別數(shù))。

1.3.2 葉片SPAD 值和根系形態(tài)測定 采用SPAD-502 Plus 便攜式葉綠素測定儀(柯尼卡美能達，日本)測定每棵植株功能葉的SPAD 值，然后取平均值；利用Epson Perfection V850 pro 根系掃描儀(愛普生，北京)和WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)(Regent 公司，加拿大)對根系的長度、表面積、直徑、體積和根尖數(shù)等形態(tài)參數(shù)進行測定分析。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)測定 每個重復(fù)隨機選取3棵植株，每棵植株選第一片完全展開的功能葉測定光合系統(tǒng)Ⅱ(PhotosystemⅡ，PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(maximum photochemical，F(xiàn)v/Fm)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching，qP)、非光合學(xué)淬滅系數(shù)(Non-photochemical quenching，NPQ)和相對電子傳遞速率(relative electron transport rate，ETR)等葉綠素熒光參數(shù)，參照王春萍等[13]的方法測定。

1.3.4 干重測定 將地上部分(莖葉)和地下部分(根系)分別于105℃殺青30 min，然后于70℃烘干至恒重后稱其干重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 和SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)分析。隸屬函數(shù)計算公式:當測定指標值與耐低溫弱光性呈正相關(guān)時，Pij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，當測定指標與耐低溫弱光性呈負相關(guān)時，Pij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，Xij為第i個材料第j個指標的低溫弱光處理組植株的測定值與對照組植株測定值的比值；Xjmin為第j個指標的比值最小值；Xjmax為第j個指標比值的最大值。各材料各指標隸屬函數(shù)值進行累加后得到的平均值即為平均隸屬度，用于綜合評價辣椒材料的耐低溫弱光能力，平均隸屬度越高則材料耐低溫弱光性越強[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒幼苗受冷害程度鑒定

冷害指數(shù)可以從形態(tài)上初步反映材料受低溫弱光傷害的程度。由圖1可知，5 份材料受10℃/5℃(晝/夜)，100 μmol·m-2·s-1低溫弱光傷害程度由大到小依次為:茄門甜椒＞US20＞US21＞US12＞南京早椒，茄門甜椒受低溫弱光傷害最大，南京早椒受低溫弱光傷害最小，US21 和US20 受低溫弱光傷害程度接近。

2.2 低溫弱光對辣椒幼苗SPAD 值的影響

由圖2可知，低溫弱光處理5 d 后，僅有南京早椒的SPAD 值受低溫弱光處理影響不顯著，其余4 份材料在低溫弱光處理5 d 后SPAD 值均顯著下降?；謴?fù)生長28 d 后，除US20 和茄門甜椒外，其余3 份材料的SPAD 值均恢復(fù)到了正常水平，推斷US20 和茄門甜椒這兩份材料受低溫弱光傷害較大，恢復(fù)能力較其余3份材料小，這與冷害指數(shù)結(jié)果一致，說明SPAD 值對于檢測辣椒葉片受低溫弱光傷害程度比較靈敏。

2.3 低溫弱光對辣椒幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

由圖3可知，與對照組植株相比，低溫弱光處理5 d 后5份材料的Fv/Fm均顯著降低，南京早椒下降幅度最小，茄門甜椒下降幅度最大，其余3 份材料下降幅度接近；NPQ 在5 份材料中均未發(fā)生顯著變化；茄門甜椒、南京早椒和US20 的qP 下降，但只有南京早椒達到了差異顯著水平；南京早椒、US20 和茄門甜椒的ETR 顯著降低，而US21 和US12 的ETR 未發(fā)生顯著變化。因此，低溫弱光處理后Fv/Fm與低溫冷害指數(shù)調(diào)查結(jié)果相關(guān)性較高，NPQ、qP 和ETR 與冷害指數(shù)調(diào)查結(jié)果存在差異。

恢復(fù)生長28 d 后，各辣椒材料的Fv/Fm、NPQ、qP和ETR 均恢復(fù)到正常生長水平(圖4)，說明無論是耐低溫弱光材料還是低溫弱光敏感材料均可恢復(fù)低溫弱光對其PSⅡ的傷害。

2.4 低溫弱光對辣椒幼苗根系形態(tài)的影響

對辣椒根系長度、根系表面積、根系直徑、根系體積和根尖數(shù)進行分析，結(jié)果如表1所示。與對照組相比，低溫弱光處理5 d 后茄門甜椒、南京早椒和US20的根系長度均顯著降低，US21 和US12 未發(fā)生顯著變化；除南京早椒外，US21、US20、US12 和茄門甜椒根系直徑顯著降低；南京早椒、US20、US12 和茄門甜椒的根系體積和根尖數(shù)均顯著降低；南京早椒和US21 的根系表面積有所增加，但差異未達到顯著水平，其余3份材料的根系表面積減小，差異也未達到顯著水平。綜合分析表明，根系直徑變化與冷害指數(shù)調(diào)查結(jié)果相關(guān)性較高，而其余根系形態(tài)指標與冷害指數(shù)調(diào)查結(jié)果存在差異?；謴?fù)生長后，US21、US20、US12 和茄門甜椒的根系直徑未恢復(fù)到正常水平(表2)，說明低溫弱光對辣椒幼苗根系直徑造成的傷害難以恢復(fù)。因此，低溫弱光處理5 d 后根系直徑對于檢測辣椒苗期耐低溫弱光具有較高的靈敏性。

2.5 恢復(fù)生長后干物質(zhì)積累特點

恢復(fù)生長后辣椒幼苗的莖葉干重、根系干重、整株干重和根冠比如表3所示，僅茄門甜椒的莖葉干重、整株干重和根冠比與對照組差異顯著，說明茄門甜椒受低溫弱光傷害最嚴重，與前文低溫弱光處理5 d 后通過冷害指數(shù)、SPAD 值、Fv/Fm以及根系直徑等4 個指標檢測到的受低溫弱光影響程度一致，同時也說明恢復(fù)生長后辣椒幼苗的莖葉干重、根系干重、整株干重和根冠比等4 個指標對辣椒苗期耐低溫弱光鑒定具有參考價值。

表1 低溫弱光處理5 d 對辣椒幼苗根系形態(tài)的影響Table 1 Effect of five days chilling and weak light treatment on the root morphology of the pepper seedlings

表2 恢復(fù)生長28 d 后辣椒幼苗的根系形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of root system of the pepper seedlings after twenty-eight days restore growth

2.6 不同辣椒材料苗期耐低溫弱光綜合評價

綜上可知，低溫弱光處理5 d 后的SPAD 值、Fv/Fm和根系直徑，以及恢復(fù)生長28 d 后的莖葉干重、根系干重、整株干重和根冠比等7 個指標能夠靈敏地反映辣椒耐低溫弱光性，因此，以這些指標低溫弱光組植株測定值與對照組植株測定值的比值為變量計算各指標的隸屬函數(shù)值，并利用隸屬函數(shù)值的平均值綜合評價各辣椒材料的耐低溫弱光特性。結(jié)果表明，5 份材料的耐低溫弱光性從強到弱依次為:南京早椒＞US12＞US21＞SU20＞茄門甜椒(表4)，與利用冷害指數(shù)鑒定的結(jié)果一致，說明本研究篩選出的7個耐低溫弱光相關(guān)指標可用于辣椒耐低溫弱光的綜合評價。

表3 恢復(fù)生長28 d 辣椒幼苗干物質(zhì)積累Table 3 Dry matter accumulation of the pepper seedlings after twenty-eight days restore growth

表4 辣椒耐低溫弱光相關(guān)指標隸屬函數(shù)值Table 4 Membership function value of tolerance related indexes of low temperature and weak light in pepper

3 討論

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收過程中起核心作用，其含量直接影響植物光合能力的強弱。曹克友等[16]研究表明，低溫弱光處理10 d 后辣椒功能葉片總?cè)~綠素含量、葉綠素a 和葉綠素b 含量均呈下降趨勢。王萍等[17]研究表明，在亞適溫弱光(100 μmol·m-2·s-1，23℃/10℃)條件下，辣椒葉片的葉綠素含量增加，隨著溫度和光照強度的降低，葉綠素含量逐漸降低。因此，低溫弱光脅迫下葉綠素含量的變化可以靈敏地指示辣椒對低溫弱光脅迫的響應(yīng)。SPAD 值與葉綠素含量呈顯著正相關(guān)[18]，本研究表明，低溫弱光處理后耐性辣椒材料的SPAD 值下降幅度小于非耐性材料，并且在恢復(fù)生長后耐性材料的SPAD 值能恢復(fù)到正常水平，而非耐性材料的SPAD 值未恢復(fù)到正常水平，說明在本研究設(shè)定的低溫弱光條件下測出的SPAD 值具有較高的靈敏性。

葉綠素熒光是葉綠素分子吸收光子后分子能級發(fā)生變化，由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)后再回到基態(tài)時釋放出的光子。葉綠素熒光參數(shù)作為實時監(jiān)測植物PSⅡ的探針十分靈敏[12，19-21]。前期研究表明，10℃/5℃，70 μmol·m-2·s-1低溫弱光處理1 d 后，非耐低溫弱光性辣椒材料的Fv/Fm略有下降，耐性材料Fv/Fm略有上升，但均未達到顯著水平，而處理5 d 后耐性材料和非耐性材料的Fv/Fm均顯著降低，且耐性材料下降幅度小于非耐性材料[13]。本研究結(jié)果與前期結(jié)果相同，再一次證明低溫弱光處理5 d 的Fv/Fm在鑒定辣椒耐低溫弱光時具有靈敏性和穩(wěn)定性。qP 的下降表明PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)通過下調(diào)光合電子傳遞來匹配碳代謝對ATP 和NADPH 需求的減少[22]，NPQ 上升反映了PSⅡ天線色素吸收的光能以熱耗散形式耗散掉的部分增加[23]，這是植物在低溫弱光下的自我防御機制。頡建明等[12]研究了低溫弱光(15℃/5℃，100 μmol·m-2·s-1) 處理5、10、15 和20 d 后辣椒葉片的葉綠素熒光參數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)處理15 d 后多數(shù)辣椒材料的葉片qP 顯著下降，僅有少部分材料的NPQ 顯著增加。本研究前期表明在10℃/5℃，70 μmol·m-2·s-1低溫弱光條件下，qP 隨處理時間的延長呈降低趨勢，NPQ 在處理3 d 和5 d 后顯著上升，處理7 d 后非耐性品種NPQ 顯著下降，耐性品種NPQ 顯著上升或無顯著變化[13]。本研究表明，10℃/5℃，100 μmol·m-2·s-1低溫弱光處理5 d 后5 份材料的qP 變化趨勢不一致，且NPQ 在5 份材料中均未發(fā)生顯著變化，推測不同低溫弱光處理強度下辣椒材料啟動自我防御機制的時期存在差異，在本研究的處理強度下未能體現(xiàn)qP 和NPQ與材料耐低溫弱光性的相關(guān)性。

根系是植物吸收營養(yǎng)和水分的重要器官，其發(fā)育狀況與植株的生長息息相關(guān)[24-25]。植物的根系形態(tài)特征是由自身遺傳特性和所處環(huán)境共同作用的結(jié)果[26-27]，根系長度、根系表面積和根系直徑等形態(tài)指標是描述根系吸收能力的重要參數(shù)，不僅能同級反映植物生長發(fā)育情況，也可衡量植物的抗逆性[28]。任旭琴等[29]研究了低溫逆境下辣椒根系總長度、根系直徑和根系體積等根系形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的降低，根系總長度呈下降趨勢。已有研究表明低溫弱光對辣椒幼苗的根系干重和鮮重均有影響[30-31]，而對于低溫弱光下辣椒根系的形態(tài)變化尚鮮見報道。本研究對低溫弱光處理后辣椒的根系形態(tài)進行了分析，并對其恢復(fù)生長后的情況進行了跟蹤調(diào)查，結(jié)果顯示，低溫弱光對辣椒根系的生長具有明顯抑制作用，具體表現(xiàn)在低溫弱光處理后辣椒的根系長度、根系表面積、根系直徑、根系體積和根尖數(shù)降低；不同耐性材料對低溫弱光的響應(yīng)存在差異，其根系直徑對于反映辣椒耐低溫弱光性具有較高的靈敏性。這些結(jié)果進一步完善了辣椒耐低溫弱光的研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

研究表明，采用水培法，以四葉一心期辣椒幼苗為材料，10℃/5℃(晝/夜)，100 μmol·m-2·s-1低溫弱光處理5 d 的SPAD 值、Fv/Fm和根系直徑，以及恢復(fù)生長28 d 后的莖葉干重、根系干重、整株干重和根冠比等7 個指標對于檢測辣椒耐低溫弱光具有較高靈敏性和穩(wěn)定性，可作為辣椒苗期耐低溫弱光鑒定指標，為辣椒耐低溫弱光鑒定體系的優(yōu)化提供參考。